外周血淋巴細胞亞群對靜脈注射免疫球蛋白無反應型川崎病患兒的預測價值

薛燕 尹晶 許俐 黨利亨 王朝 崔亞瓊 張新杰 李崇巍

（1.天津市兒童醫(yī)院（天津大學兒童醫(yī)院）天津市兒科研究所/天津市兒童出生缺陷防治重點實驗室，天津 300134；2.天津市兒童醫(yī)院（天津大學兒童醫(yī)院）風濕免疫科，天津 300134）

川崎病（Kawasaki disease, KD）是一種急性免疫性血管炎性疾病，心血管系統(tǒng)受累在KD中表現突出，以冠狀動脈病變（coronary artery lesion,CAL）最為多見，已成為兒童后天性心臟病的最常見病因［1］。 目前， 靜脈注射免疫球蛋白（intravenous immunoglobulin, IVIG）聯合阿司匹林是KD 的標準治療，但仍有10%～20%的患兒對該治療無反應，其CAL 發(fā)生率較IVIG 敏感患兒明顯升高［2］。早期識別IVIG 無反應患兒，有助于盡早采取積極的強化治療，從而降低IVIG 耐藥率和CAL發(fā)生率，改善患兒預后［3-4］。

目前KD的發(fā)病機制尚不清楚，但在疾病的急性期能觀察到中性粒細胞比例和絕對計數增多，以及淋巴細胞比例和絕對計數減少，因此固有免疫與適應性免疫的不平衡被認為是KD的關鍵致病因素［5-6］。淋巴細胞亞群作為適應性免疫的重要組成部分，是評估細胞免疫和體液免疫功能的重要指標。與正常對照相比，急性KD患兒外周血中B、T細胞等顯著降低，可以選擇性地從外周血招募到冠狀動脈，從而引起CAL［7］。有研究表明，淋巴細胞亞群參與多種免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展，可用于監(jiān)測自身免疫性疾病的病情進展和治療轉歸［8］。淋巴細胞亞群在IVIG 無反應型與IVIG 敏感型KD之間存在顯著差異，但其在IVIG無反應型KD預測體系中的作用尚未見報道。本研究就治療前外周血淋巴細胞亞群在IVIG無反應型KD中的特征及其在IVIG無反應型KD早期預測中的臨床價值進行探討，建立IVIG無反應型KD的早期預測模型，并評估其預測效能。

1 資料與方法

1.1 研究對象

回顧性納入2021年1月—2023年3月期間在我院住院的KD 患兒226 例。納入標準：（1）根據2017年美國心臟協(xié)會的標準診斷的完全性KD或不完全性KD［9］；（2）發(fā)病10 d 內入院，且首次治療均為IVIG（2 g/kg）；（3）臨床資料完整，且治療前采集外周血進行淋巴細胞亞群檢測。排除標準：（1）復發(fā)KD、KD休克綜合征；（2）合并有其他自身免疫疾病、血液疾病或惡性腫瘤等；（3）患兒于外院確診KD，且診療過程已使用IVIG治療。

IVIG無反應型KD診斷標準：首次IVIG輸注結束后36 h，患兒仍有持續(xù)發(fā)熱的表現，或在治療2～7 d后再次出現發(fā)熱并伴隨至少1種以上的KD臨床癥狀［9］。根據此標準，將納入對象分為IVIG 敏感組（185例）和IVIG無反應組（41例）。

另選取同期0.5～5歲的健康兒童46例作為對照組，其年齡和性別構成與KD組相匹配。

1.2 臨床資料收集

（1）一般資料：年齡、性別和發(fā)病時間等。

（2）IVIG 治療前常見實驗室檢查指標：中性粒細胞比例（neutrophil percentage, N%）、血小板計數（platelet count, PLT）、谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase, AST）、 谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase, ALT）、球蛋白（globulin, GLB）、白蛋白（albumin, ALB）、血清鈉（serum sodium,Na+）、總膽紅素（total bilirubin, TB）、C 反應蛋白（C reactive protein, CRP）、鐵蛋白（ferritin, Ferr）、紅細胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate,ESR）、白細胞介素-6（interleukin-6, IL-6）。

1.3 淋巴細胞亞群檢測

所有患兒治療前予EDTA 抗凝管靜脈采血2 mL， 采用流式細胞儀FACScanto Ⅱ（BD Bioscience，美國）、BD multitest 6-color TBNK 試劑（BD Bioscience，美國）及絕對計數微球試劑盒（北京同生時代，中國）檢測淋巴細胞亞群，包括總T 細胞（CD3+）、CD4+T 細胞（CD3+CD4+）、CD8+T 細胞（CD3+CD8+）、B 細胞（CD3-CD19+）和自然殺傷細胞（natural killer cell，NK 細胞）（CD3-CD16+/CD56+）的比例和絕對計數。

1.4 5種不同預測評分體系

應用Kobayashi 等［10］、 Egami 等［11］、 Sano等［12］、Yang等［13］、Wu等［14］5種評分體系（表1），對本研究226 例KD 患兒進行評分，分別計算各個評分體系對本研究中IVIG無反應型KD患兒預測的靈敏度和特異度。

表1 5種不同預測評分體系

1.5 統(tǒng)計學分析

使用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件對數據進行統(tǒng)計學分析。呈正態(tài)分布的計量資料以均值±標準差（xˉ±s）表示，組間比較采用兩樣本t檢驗；非正態(tài)分布資料以中位數（四分位數間距）［M（P25，P75）］表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。計數資料以頻數和百分率（%）表示，組間比較使用卡方檢驗。將單因素分析后P＜0.05 的變量納入多因素logistic回歸分析，評估IVIG無反應型KD的預測因素。為了便于操作，對每個預測因素進行賦值以建立一個簡化的預測評分體系［14］。

2 結果

2.1 研究對象的一般資料

共226例KD患兒納入研究，其中IVIG敏感組185 例，IVIG 無反應組41 例。IVIG 敏感組中，女性73 例（39.5%），男性112 例（60.5%），中位發(fā)病年齡2（1，3）歲。IVIG 無反應組41 例，其中女性19例（46.3%），男性22例（53.7%），中位發(fā)病年齡2（1，3）歲。兩組之間年齡、性別的比較差異無統(tǒng)計學意義（分別P=0.795、0.417）。

對照組共46 例，其中男性31 例（67.4%），女性15 例（32.6%），中位年齡2（1，3）歲。KD 組共226 例，其中男性134 例（59.3%），女性92 例（40.7%）。兩組年齡、性別的比較差異無統(tǒng)計學意義（分別P=0.599、0.305）。

2.2 IVIG敏感組和IVIG無反應組常見臨床數據的比較

與IVIG 敏感組相比，IVIG 無反應組Ferr、IL-6、AST、ALT、TB、N%及CRP 顯著升高，Na+、GLB 及PLT 顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。兩組其余指標的比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 IVIG敏感組和IVIG無反應組常見臨床數據的比較

2.3 KD組與對照組淋巴細胞亞群的比較

與對照組相比，KD組B細胞比例及CD4+/CD8+比值顯著升高（P＜0.05），總T 細胞、CD8+T 細胞、NK 細胞的比例顯著下降（P＜0.05）；KD 組總T 細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞、NK細胞的絕對計數均明顯低于對照組（P＜0.05）。見表3。

表3 KD組和對照組淋巴細胞亞群的比較 ［M（P25，P75）］

2.4 IVIG無反應組和IVIG敏感組淋巴細胞亞群的比較

IVIG無反應組總T細胞和CD4+T細胞的比例明顯低于IVIG 敏感組（P＜0.05）；IVIG 無反應組總T細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞、B細胞及NK細胞的絕對計數明顯低于IVIG敏感組（P＜0.05）。兩組其余指標的比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表4。

表4 IVIG敏感組和IVIG無反應組淋巴細胞亞群的比較 ［M（P25，P75）］

2.5 多因素logistic回歸分析

單因素分析后，將IVIG 敏感組與IVIG 無反應組之間差異有統(tǒng)計學意義的變量（P＜0.05）納入多因素logistic 回歸分析，共納入17 個連續(xù)變量作為自變量，包括10 個常見實驗室檢查指標（Ferr、IL-6、Na+、AST、ALT、GLB、TB、N%、PLT、CRP） 及7 個淋巴細胞亞群指標（總T 細胞和CD4+T 細胞比例，以及總T 細胞、CD8+T 細胞、CD4+T 細胞、NK 細胞、B 細胞絕對計數），以患兒對IVIG 治療的敏感性為因變量。多因素logistic 回歸分析顯示，CD4+T 細胞絕對計數、NK 細胞絕對計數、Na+、GLB和TB這5個變量是IVIG無反應型KD 的預測因素（P＜0.05），見表5，并建立logistic回歸模型：Y（X）=26.863-0.001X1（CD4+T 細胞絕對計數）+0.002X2（NK細胞絕對計數）-0.193X3（Na+）-0.117X4（GLB）+0.078X5（TB）。受試者操作特征曲線 （receiver operating characteristic curve， ROC 曲線）分析顯示，以模型得分≥-1.51為截斷值，該模型預測IVIG 無反應型KD 的靈敏度、特異度分別為70.7%、78.9%，約登指數為0.496，曲線下面積（area under the curve, AUC）為0.801（95%CI：0.725～0.878）。

表5 IVIG無反應型KD影響因素的logistic回歸分析

2.6 簡化評分體系

根據ROC 曲線分析結果，將以上logistic 回歸模型中的5個變量轉化為二分類變量，再次進行多因素logistic 回歸分析。各變量的截斷值如下：CD4+T 細胞絕對計數≤960.9 個/μL，NK 細胞絕對計數≤157.2 個/μL，Na+≤135 mmol/L，GLB≤22.4 g/L，TB≥5.9 μmol/L。多因素logistic回歸分析結果顯示，CD4+T細胞絕對計數≤960.9個/μL，Na+≤135 mmol/L，GLB≤22.4 g/L，TB≥5.9 μmol/L 為IVIG 無反應型KD的預測因素。根據各預測因素的OR值對變量賦分（表6），建立評分體系：CD4+T 細胞絕對計數≤960.9 個/μL 為3 分，Na+≤135 mmol/L 為3 分，GLB≤22.4 g/L為3分，TB≥5.9 μmol/L為5分。ROC曲線分析顯示，總分≥11分為截斷值時，此評分體系預測IVIG無反應型KD的約登指數最大（0.545），靈敏度、特異度分別為70.7%、83.8%，AUC為0.816（95%CI：0.745～0.888），見表7和圖1。

圖1 預測IVIG無反應型KD的ROC曲線

表6 多因素logistic回歸法分析IVIG無反應型KD的預測指標

表7 不同截斷值下本研究建立的預測評分體系的預測效能

2.7 與已有的5種評分體系預測IVIG無反應型KD的預測效能的比較

將5 種國內外評分體系［10-14］分別應用于本研究的226 例KD 患兒，對IVIG 無反應型KD 進行預測。結果顯示，Sano 評分［12］、Yang 評分［13］、Wu評分［14］的靈敏度均低于50%，Kobayashi 評分［10］和Egami評分［11］的特異度均低于75%，5種評分體系的約登指數均低于0.4（范圍：0.174～0.358）。與以上5種評分體系相比，本研究建立的評分體系的靈敏度和特異度明顯增高，約登指數為0.545，見表8。

表8 6種評分體系對IVIG無反應型KD的預測效能

3 討論

現有IVIG無反應型KD評分體系主要基于臨床特點和炎癥指標所構建，缺乏免疫指標，存在靈敏度不高的缺陷。KD作為一種急性的自身免疫性血管炎，免疫機制在其中發(fā)揮著重要作用。KD發(fā)病初期存在免疫細胞活化，免疫指標的引入或許能增加預測體系的效能。因此本研究檢測總T 細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、B細胞及NK細胞在急性期治療前的表達水平，結合現有評分體系提示的多個預測因素，構建預測評分體系，探討其在IVIG無反應型KD預測中的作用。

近年越來越多的證據表明，固有免疫與適應性免疫的不平衡是KD的關鍵致病因素［7，15］。目前KD患兒外周血中總淋巴細胞比率和絕對計數減少已成共識［16-17］，但各淋巴細胞亞群的變化趨勢仍有爭議，尤其是B細胞和T細胞亞群的比例及絕對計數［18-20］。為此，2022 年Xie 等［7］通過生物信息學方法，收集高通量基因表達數據庫中所有KD相關數據集，分析101個健康兒童及480個急性期KD患兒的資料，歸納淋巴細胞亞群比例和絕對計數的變化趨勢，建立KD外周血免疫細胞圖譜，顯示KD患兒外周血中總T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、B 細胞的比例和絕對計數均明顯低于健康兒童，NK細胞的絕對計數明顯低于健康兒童。本研究中淋巴細胞亞群（除B細胞外）的絕對計數結果與之一致；總T 細胞、CD8+T 細胞、NK 細胞比例結果也與之一致，不同在于本研究中KD 患兒CD4+T 細胞比例與健康對照相比沒有顯著差異，B細胞比例則明顯高于健康兒童。這可能是由于細胞比例易受個體的亞群及總淋巴細胞兩者降低程度的影響，導致結果不穩(wěn)定。因此，我們認為淋巴細胞亞群絕對計數更能客觀反映免疫細胞變化趨勢。此外，KD患兒的各淋巴細胞亞群絕對計數還與IVIG 敏感性有關。本研究結果表明IVIG 無反應型KD 患兒治療前的總T 細胞、CD4+T 細胞、CD8+T 細胞、NK 細胞及B 細胞絕對計數明顯低于IVIG 敏感型，與國內外研究結果［18，20］基本一致，但能否作為預測IVIG 治療反應的潛在生物標志物尚缺乏研究。

在本研究建立的評分體系中，CD4+T細胞絕對計數≤960.9 個/μL 為KD 患兒IVIG 無反應的預測因素。既往研究發(fā)現KD小鼠模型中早期損傷的冠狀動脈壁可見大量CD4+T細胞浸潤，而正常小鼠冠狀動脈中未見到CD4+T細胞［6］，提示CD4+T細胞參與KD 急性期的血管壁炎癥反應，導致外周血中CD4+T 細胞過度消耗。而本研究發(fā)現IVIG 無反應組外周血中CD4+T細胞絕對計數低于IVIG敏感組，推測IVIG 無反應組有更多CD4+T 細胞參與血管壁的炎癥反應。在本研究建立的logistic回歸模型中，除了CD4+T 細胞絕對計數，NK 細胞絕對計數也是IVIG無反應的預測因素。Choi等［21］發(fā)現在診斷時（IVIG 輸注之前），IVIG 無反應型KD 患者的CD56-CD16+亞型NK 細胞水平明顯低于IVIG 敏感型，且其水平與IVIG 反應性、發(fā)熱持續(xù)時間、CAL 以及頸部淋巴結等臨床表現相關，也與氨基酸B型鈉尿肽前體、CRP和ALT水平以及淋巴細胞和中性粒細胞計數有關。但需要進一步的研究來驗證CD56-CD16+亞型NK 細胞的KD 特異性，特別是在IVIG治療的背景下，并闡明NK細胞受體表達和功能失調的分子機制。

已有研究表明淋巴細胞亞群絕對計數對兒童難治性肺炎支原體肺炎具有早期預測作用［22］。本研究將淋巴細胞亞群絕對計數納入IVIG 無反應型KD 預測評分體系中，建立的評分體系包括接受IVIG 治療前的4 個變量：CD4+T 細胞絕對計數≤960.9/μL（3 分）、Na+≤135 mmol/L（3 分）、GLB≤22.4 g/L（3 分）、TB≥5.9 μmol/L（5 分）。當總分≥11分時，KD患兒被認定為IVIG耐藥的高危人群，應警惕IVIG 治療可能無反應。此評分體系預測IVIG無反應型KD的AUC、靈敏度和特異度分別為0.816、70.7%和83.8%，預測效能優(yōu)于其他5 種國內外評分體系［10-14］。

本研究為單中心回顧性研究，可能存在選擇偏倚，這是本研究的局限性。另外，本研究建立的IVIG無反應型KD的預測評分體系的效能需要進一步內部驗證和外部驗證。因此，未來的研究應著重于前瞻性的隨機對照研究，以優(yōu)化預測模型，并需要更嚴格的內部和外部驗證。

綜上所述，本研究顯示，外周血淋巴細胞亞群的檢測可在預測IVIG無反應型KD中發(fā)揮重要作用。本研究基于外周血淋巴細胞亞群及常見實驗室檢查指標建立的預測評分體系可用于預測KD患兒是否對IVIG 有反應，與目前使用的風險評分體系相比，具有更好的準確性，對指導臨床醫(yī)生選擇合適的個體化治療以減少KD患兒CAL的發(fā)生具有重要意義。

利益沖突聲明：所有作者聲明無利益沖突。