鐵死亡相關(guān)基因KIF20A對腎上腺皮質(zhì)癌患者預(yù)后的影響

楊欣睿 馮源康 賈占奎△

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院1)醫(yī)務(wù)處; 2)泌尿外科 鄭州 450000

腎上腺皮質(zhì)癌(adrenocortical carcinoma,ACC)是一種罕見的泌尿系腫瘤,它具有一定的內(nèi)分泌功能,通常預(yù)后不好[1]。1～4歲和40～50歲的女性患病率較高。在西方國家,ACC發(fā)病率為每年0.7～2/百萬人[2],我國的預(yù)估發(fā)病率約為0.7×106～2.0×106例/年[3]。對局限性ACC患者,手術(shù)是其他治療手段的基礎(chǔ);對晚期ACC患者,減瘤手術(shù)可使激素控制和后期系統(tǒng)治療提供可能[4]。依托泊苷、阿霉素和順鉑加口服米托坦(EDP-M方案)是目前常用的治療ACC的方案[2],但其具有一定的局限性。鑒于ACC的不良預(yù)后,探索一種ACC患者的預(yù)后預(yù)測模型顯得尤為重要。鐵死亡是近些年新發(fā)現(xiàn)的細胞的程序性死亡方式,其更依賴于鐵離子和活性氧發(fā)揮作用。有研究發(fā)現(xiàn),ACC中鐵死亡標志物GPX4的表達升高,提示ACC對鐵死亡的敏感性更高[5]。我們運用生物信息學(xué)技術(shù),尋找與ACC預(yù)后密切相關(guān)的鐵死亡相關(guān)基因,并以其為基礎(chǔ),建立預(yù)測ACC患者生存率的列線圖。

1 資料與方法

1.1數(shù)據(jù)準備從腫瘤基因組圖譜(the cancer genome atlas,TCGA)數(shù)據(jù)庫獲得77例ACC患者的RNA-seq測序數(shù)據(jù)和臨床信息。從GTEx數(shù)據(jù)庫中獲得128例正常腎上腺組織的RNA-seq測序數(shù)據(jù)。從高通量基因表達數(shù)據(jù)庫(gene expression omnibus data base,GEO)篩選獲得芯片數(shù)據(jù)GSE33371數(shù)據(jù)集(正常組織=10例,腫瘤組織=33例)和GSE14922數(shù)據(jù)集(正常組織=4例,腫瘤組織=4例)。從FerrDb數(shù)據(jù)庫中獲得鐵死亡驅(qū)動基因264個和鐵死亡抑制基因238個。使用在線生物信息學(xué)分析工具GEPIA 2獲得ACC腫瘤中差異表達的基因和總生存分析排名前500的基因。

1.2關(guān)鍵基因的選擇用“venn”包將ACC腫瘤中生存分析排名前500的基因、ACC癌組織中高表達的基因和鐵死亡抑制基因進行交集得到ACC腫瘤中高表達的鐵死亡抑制基因;將ACC腫瘤中生存分析排名前500的基因、ACC癌組織中低表達的基因和鐵死亡驅(qū)動基因進行交集得到ACC腫瘤中低表達的鐵死亡驅(qū)動基因。

1.3關(guān)鍵基因的驗證對TCGA數(shù)據(jù)庫ACC的KIF20A表達量和GTEx中正常腎上腺的KIF20A進行t檢驗驗證。對GSE33371數(shù)據(jù)集和GSE14922數(shù)據(jù)集中正常組織和ACC組織中KIF20A的表達量進行t檢驗驗證。為了進一步驗證KIF20A的作用,在不同分期的ACC組織中對KIF20A的表達量進行方差分析。

1.4關(guān)鍵基因的生存分析用“pROC”包繪制KIF20A表達量的ROC曲線,以KIF20A表達量的最佳截斷值為界,將ACC分為高表達組和低表達組。加載“survival”包繪制生存曲線,采用 Log-Rank檢驗組間的差異性。通過“SurvivalROC”包繪制的時間受試者工作曲線(time-dependent ROC)進行驗證。

1.5相關(guān)性分析以KIF20A表達量的最佳截斷值為界,將ACC分為高表達組和低表達組,分別與各個臨床指標進行卡方檢驗和Logistic回歸分析,驗證與KIF20A表達相關(guān)的臨床指標。

1.6列線圖模型建立將KIF20A的表達量和各個臨床指標分別進行單因素和多因素COX回歸,當指標在單因素和多因素回歸中均滿足P<0.05時,被認為是患者的預(yù)后獨立影響因素。聯(lián)合各個指標通過“rms”包繪制出列線圖,用于評估患者的1a、3a、5a生存率。

2 結(jié)果

2.1關(guān)鍵基因ACC腫瘤中生存分析排名前500的基因、ACC癌組織中高表達的基因和鐵死亡抑制基因進行交集得到ACC腫瘤中高表達的鐵死亡抑制基因1個:KIF20A;將ACC腫瘤中生存分析排名前500的基因、ACC癌組織中低表達的基因和鐵死亡驅(qū)動基因進行交集得到ACC腫瘤中低表達的鐵死亡驅(qū)動基因0個。見圖1A、B。

圖1 A:ACC腫瘤中生存分析排名前500的基因、ACC癌組織中高表達的基因和鐵死亡抑制基因進行交集。B:ACC腫瘤中生存分析排名前500的基因、ACC癌組織中低表達的基因和鐵死亡驅(qū)動基因進行交集

2.2關(guān)鍵基因的驗證TCGA中ACC的KIF20A表達量和GTEx中正常腎上腺組織KIF20A表達量的t檢驗結(jié)果顯示,KIF20A在ACC中明顯低表達(P<0.05),見圖2A。GSE33371數(shù)據(jù)集和GSE14922數(shù)據(jù)集結(jié)果顯示,ACC中KIF20A的表達量明顯低于正常組織(P<0.05),見圖2B、C。隨著Stage分期的升高,KIF20A的表達量逐漸升高(F=8.19,P<0.05),見圖2D。

圖2 A:TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫中KIF20A的表達情況。B:GSE33371中ACC和正常腎上腺組織中 KIF20A的表達情況。C:GSE14922中ACC和正常腎上腺組織中 KIF20A的表達情況。D:KIF20A在不同Stage分期中的表達情況

2.3關(guān)鍵基因的生存分析ROC結(jié)果顯示,最佳截斷值為784.5,見圖3A。以最佳截斷值為界,生存分析結(jié)果顯示,高表達KIF20A組的腫瘤患者生存率更低,見圖3B。時間依賴的ROC曲線顯示,1a、3a、5a的AUC分別為0.808、0.893、0.815,見圖3C。

圖3 A:KIF20A的ROC曲線。B:KIF20A不同表達量情況下的生存曲線。C:時間依賴的ROC曲線

2.4關(guān)鍵基因表達的影響因素卡方檢驗結(jié)果顯示,患者的M分期、N分期、T分期、Stage分期和化療是影響KIF20A表達的因素(P<0.05),見表1。Logistic分析顯示,M分期和T分期是影響KIF20A表達的獨立危險因素(P<0.05),見表2。

表1 KIF20A的表達量和各個臨床指標之間的相關(guān)性

表2 KIF20A相關(guān)臨床指標的Logistic回歸分析

2.5列線圖模型建立單因素COX回歸分析結(jié)果顯示,KIF20A表達情況、M分期、T分期、Stage分期和化療是影響ACC患者預(yù)后的影響因素(P<0.05),見圖4 A;多因素COX回歸分析結(jié)果顯示,KIF20A是ACC患者預(yù)后的獨立影響因素(P<0.05),見圖4 B。以KIF20A表達情況和各個臨床指標為基礎(chǔ),繪制列線圖用于ACC患者生存情況的預(yù)測,并使用校準曲線對列線圖進行評估,見圖4 C、D。

圖4 A、B:分別為單因素和多因素COX回歸。C:評估患者預(yù)后的列線圖模型。D、E:該模型的校準曲線,橫坐標為預(yù)測的事件發(fā)生率,縱坐標為觀察到的實際事件發(fā)生率。

3 討論

ACC是一種起源于腎上腺皮質(zhì)的侵襲性腫瘤,該疾病具有明顯的異質(zhì)性,但大多數(shù)患者的結(jié)局較差,并且缺乏有效的藥物治療選擇[6]。在體液中檢測到特定的基因產(chǎn)物,有可能作為ACC患者的新的診斷方式。p53-RB和WNT-β-連環(huán)蛋白通路是ACC中常見的疾病驅(qū)動因素。但是,這些途徑很難通過靶向治療來進行干預(yù)。因此,探索一種新的分子靶標對于ACC的診斷和治療都具有重要的臨床意義。

谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)和長鏈脂肪酸CoA連接酶4(long-chain-fatty-acid CoA ligase 4,ACSL4)基因是鐵死亡的關(guān)鍵基因,在細胞的鐵死亡進程中發(fā)揮著不可替代的作用。有學(xué)者指出,GPX4和ACSL4在ACC中高表達,這表明鐵死亡在ACC的發(fā)生和進展中被明顯抑制[7]。本研究發(fā)現(xiàn),鐵死亡抑制基因KIF20A在ACC中表達明顯升高,這提示我們KIF20A可能在ACC的發(fā)生和進展中起到重要作用。

KIF20A是驅(qū)動蛋白家族中的一員,它能夠啟用蛋白激酶結(jié)合活性并參與微管束形成、中體脫落和細胞分裂的調(diào)節(jié)[8]。KIF20A/MKLP2能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)祖細胞的分裂模式[9];KIF20A也能夠調(diào)節(jié)小鼠精子發(fā)生中的中心紡錘體組裝和頂體的生物發(fā)生[10]。有學(xué)者指出,KIF20A與前列腺癌、腎癌和結(jié)腸癌等癌癥的進展密切相關(guān)[11-13]。在鐵死亡方面,KIF20A能夠通過影響GPX4的表達而抑制結(jié)直腸癌中的鐵死亡[13]。本研究通過生存分析發(fā)現(xiàn),隨著M分期和T分期的升高,KIF20A的表達量也明顯升高,同時KIF20A與ACC患者的預(yù)后明顯相關(guān),這表明,KIF20A在ACC的診斷和預(yù)后判斷中具有一定的臨床價值。

列線圖,又稱諾莫圖(Nomogram),它是建立在各種多因素回歸分析的基礎(chǔ)上,使用生物屬性、基因表達情況或者多個臨床指標,然后采用帶有分數(shù)高低的線段,從而達到研究者所設(shè)置的研究目的:基于多個因變量的值來判斷一定的臨床結(jié)局或者某類事件發(fā)生的概率[14-16]。本研究將患者的性別、年齡、TNM分期、Stage分期、放化療情況和KIF20A作為因變量,繪制列線圖來判斷患者的預(yù)后情況,這對于臨床ACC的診斷、治療和預(yù)后判斷都具有重要意義。

本研究發(fā)現(xiàn)KIF20A是ACC預(yù)后的影響因素,但是上述結(jié)果是基于ACC與正常腎上腺組織間基因表達水平的差異,可能忽略了腫瘤進展過程中的調(diào)控關(guān)系;而且本研究主要是采用生物信息學(xué)的方法,缺少基礎(chǔ)實驗驗證。在今后的研究中我們將著重研究KIF20A的上下游調(diào)控關(guān)系,完善ACC中KIF20A的作用機制,同時探索能夠靶向KIF20A的化學(xué)藥物,為鐵死亡藥物用于臨床ACC患者的治療提供一定的理論依據(jù)。