C/GP/Co水凝膠聯(lián)合肌腱干細(xì)胞在大鼠跟腱損傷愈合中的作用研究

楊志金,徐 江,徐雁華,陳 康,謝美明,唐康來

1.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九二〇醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科,昆明 650032; 2.中國人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院骨科,成都 610083; 3.陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院運動醫(yī)學(xué)中心,重慶 400038

肌腱損傷在體育運動及日常生活中均十分常見。肌腱損傷的治療是骨科及運動醫(yī)學(xué)的一個難題,目前仍沒有最佳治療方案,治療方法也尚有爭論,臨床迫切需要切實有效的治療方法[1- 2]。干細(xì)胞治療有望促進(jìn)損傷肌腱組織再生,肌腱干細(xì)胞(tendon stem cells,TSCs) 是來源于肌腱組織的一種間充質(zhì)干細(xì)胞[3-4]。TSCs具有多向分化潛能,并且在維持肌腱自我平衡及促進(jìn)肌腱損傷修復(fù)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。采用TSCs促進(jìn)肌腱損傷修復(fù)是一項極有前景的治療方法。TSCs需要適當(dāng)?shù)闹Ъ芤员３制涓杉?xì)胞的干性及成肌腱分化能力,且支架在肌腱組織再生的過程中起到重要作用[2]。

細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)及其組成成分對健康肌腱的發(fā)育及維護(hù)起到重要作用,肌腱組織ECM的主要成分是I型膠原[5]。I型膠原具有良好的生物相容性、生物活性及可降解性,是最適宜作為肌腱組織工程的生物材料[6]。水凝膠具有良好的生物相容性、天然的仿生特征,用作肌腱組織工程支架切實可行[7]。水凝膠為移植的TSCs提供了一個良好的載體及模擬ECM的微環(huán)境,營養(yǎng)物質(zhì)及氧氣等能輕易地在水凝膠內(nèi)部移動[8]。水凝膠在各類組織的損傷愈合過程中均有應(yīng)用可能[9]。

筆者課題組在前期實驗中,按6∶1∶8的體積比,成功制作了殼聚糖/β-甘油磷酸鈉/膠原(chitosan/β-glycerophosphate/collagen,C/GP/Co)水凝膠,并對其理化性質(zhì)及生物相容性進(jìn)行了詳細(xì)研究。結(jié)果證實:C/GP/Co水凝膠對營養(yǎng)物質(zhì)和水溶性代謝產(chǎn)物具有良好的滲透性,也有利于TSCs的存活及生長[10]。此外,C/GP/Co可在液體狀態(tài)時包裹細(xì)胞,通過微創(chuàng)的方式注射至損傷部位,然后在生理情況下,體溫37°C以上時形成凝膠。

本實驗擬首先建立大鼠急性跟腱損傷模型,然后將C/GP/Co水凝膠聯(lián)合TSCs注射至大鼠跟腱損傷區(qū)域,通過組織學(xué)、成肌腱相關(guān)基因的表達(dá)及成肌腱分化相關(guān)蛋白檢測等指標(biāo)評價C/GP/Co聯(lián)合TSCs對大鼠跟腱損傷的治療效果,并分析其可能的作用機(jī)制。

材料與方法

1 實驗動物

98只雄性SD大鼠(4周齡,體重約100g,由陸軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供)。其中2只用于提取TSCs,96只用于進(jìn)一步動物實驗。實驗動物均嚴(yán)格按照實驗動物治療和處理指南進(jìn)行處理,實驗程序均由陸軍軍醫(yī)大學(xué)動物研究倫理委員會批準(zhǔn) [SYXK(渝)20170002]。

2 主要試劑

殼聚糖(脫乙酰度>95%,大連美侖生物公司,中國);β-甘油磷酸鈉 (上海瑞永生物公司,中國);Ⅰ型鼠尾膠原溶液(上海魯汶生物公司,中國);天狼星紅染色液(北京索萊寶公司,中國);苦味酸染色液(北京索萊寶公司,中國);mRNA提取試劑盒(Takara公司,日本);熒光定量PCR試劑盒(Takara公司,日本)。

3 主要儀器

E400POL偏振光顯微鏡(NIKON公司,日本);iMarkTM酶標(biāo)儀(Bio-Rad 公司,美國);ABI 7500實時熒光定量PCR儀(Life Tech公司,美國);Cycler Real time PCR儀(BIO-RAD公司,美國);自動凝膠成像(Eppendorf公司,德國)。

4 方法

4.1SD大鼠跟腱TSCs的分離及培養(yǎng) 取4周齡雄性SD大鼠2只,體重約100g,用于SD大鼠跟腱TSCs的分離及培養(yǎng),具體分離及培養(yǎng)步驟采用筆者課題組前期研究使用方法[10]。

4.2C/GP/Co水凝膠的配制 在超凈臺中、無菌條件下,配制體積比為6∶1∶8的C/GP/Co溶液,具體步驟采用筆者課題組前期研究使用方法[10]。

4.3大鼠跟腱損傷模型的建立及分組 取96只SD大鼠,建立左側(cè)后肢急性跟腱損傷動物模型,具體步驟采用筆者課題組前期研究使用方法,右側(cè)后肢不做任何處理[10]。

將96只左側(cè)跟腱缺損的SD大鼠完全隨機(jī)分為4個組,每組包含24只大鼠。分別為:(1)對照組:左側(cè)跟腱缺損術(shù)后,自然愈合組;(2)水凝膠組:單純在跟腱損傷區(qū)域注射300μL C/GP/Co水凝膠;(3)TSCs組:單純在跟腱損傷區(qū)域注射106TSCs;(4)TSCs聯(lián)合水凝膠治療組:在跟腱缺損區(qū)域注射300μL C/GP/Co水凝膠及106TSCs。

每組大鼠分別于損傷后2、4、6周,用CO2過度麻醉法各處死8只,迅速將大鼠左側(cè)跟腱完整取出,用于組織學(xué)檢測及基因、蛋白表達(dá)檢測。

4.4天狼星紅染色 分別將不同時間點的4組大鼠的跟腱取材。石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化,蘇木素染色液染細(xì)胞核20min,自來水沖洗5min,蒸餾水沖洗1次,用天狼星紅苦味酸染色液染色1h,自來水沖洗5min,常規(guī)脫水、透明,中性樹膠封片。偏振光顯微鏡下觀察,采集圖像,圖像分析采用IPP(Image-Pro Plus)6.0專業(yè)圖像分析軟件,對Ⅰ型、Ⅲ型膠原的比例進(jìn)行定量分析。

4.5實時熒光定量(real-time fluorescent quantitative PCR,RT-qPCR)分析 為比較各組成肌腱基因的表達(dá)情況,采用PCR分析成肌腱Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原及scleraxis(SCX)的變化情況。分別將不同時間點4組的大鼠跟腱取材,每個跟腱樣本取約200mg組織,分離提取總RNA,使用微量分光光度計測定RNA濃度,OD260/280范圍在1.7～2.1,符合要求,然后逆轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)DNA(complementary DNA,cDNA),用ABI 7500 PCR儀進(jìn)行PCR分析。所有的引物序列(表1)由primer 5.0軟件設(shè)計并由上海生工公司合成。每個樣本重復(fù)檢測3次,每個基因檢測3個PCR循環(huán),檢測各基因擴(kuò)增的Ct值,以甘油醛-3-磷酸脫氫酶( glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)作為內(nèi)參基因,目的基因的表達(dá)水平用2-△△Ct公式計算獲得。數(shù)據(jù)分析采用CFX Manager 3.0軟件(Bio-Rad),目標(biāo)基因的表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化至內(nèi)參基因水平。

4.6成肌腱分化相關(guān)蛋白檢測 肌腱相關(guān)的特定蛋白表達(dá)水平用蛋白質(zhì)印跡法(western blot,WB)進(jìn)行檢測,分別將不同時間點的4組大鼠跟腱取材,提取總蛋白,蛋白定量采用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白質(zhì)定量試劑盒完成(按照上海碧云天公司BCA試劑盒說明書操作)。用蛋白裂解液作為對照,用酶標(biāo)儀562nm(540～590nm)測出樣本的吸光度值,分別計算各組標(biāo)本的蛋白濃度。在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳液中分離總蛋白,轉(zhuǎn)移蛋白到PVDF膜,室溫下用5%BSA封閉液(block buffer)封閉2h,分別加入對應(yīng)的抗體Ⅰ型膠原(1∶500)、Ⅲ型膠原(1∶250)、SCX (1∶500)及GAPDH (1∶3000),4℃孵育過夜。再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶3000),室溫孵育2h,用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光底物顯影印跡、曝光。蛋白的表達(dá)水平通過Image J軟件來測定條帶面積和灰度值,以GAPDH條帶為內(nèi)參(n=3),計算4組的相對蛋白表達(dá)水平。

5 統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

1 天狼星紅染色觀察

肌腱組織天狼星紅染色在偏振光顯微鏡下較容易區(qū)分出Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維,Ⅰ型膠原纖維較粗大、排列緊密,具有強(qiáng)雙折光性,呈紅色或橙色;而Ⅲ型膠原纖維較細(xì),具有弱雙折光性,在鏡下呈綠色(圖1)。天狼星紅染色結(jié)果顯示損傷后2周時,各組的Ⅰ型膠原面積占比比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,圖1b)。在損傷后4周及6周時,TSCs聯(lián)合水凝膠治療組的Ⅰ型膠原面積占比明顯大于其他3組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,圖1b)。天狼星紅染色結(jié)果顯示損傷后2周時,各組的Ⅲ型膠原面積占比比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,圖1c)。在損傷后4周及6周時,TSCs聯(lián)合水凝膠治療組的Ⅲ型膠原面積占比明顯小于其他3組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,圖1c)。

圖1 天狼星紅染色觀察及Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原面積占比統(tǒng)計分析。a.損傷后2、4、6 周各組跟腱組織天狼星紅染色觀察,Ⅰ型膠原纖維呈橙黃色,Ⅲ型膠原纖維呈綠色,放大倍數(shù):×100,標(biāo)尺=200 μm;b.損傷后2、4、6周各組跟腱組織天狼星紅染色Ⅰ型膠原面積占比統(tǒng)計分析;c.損傷后2、4、6周各組跟腱組織天狼星紅染色Ⅲ型膠原面積占比統(tǒng)計分析。#:P<0.05;TSCs:肌腱干細(xì)胞

2 PCR檢測相關(guān)基因的表達(dá)

損傷后2、4、6 周時,各組Ⅰ型膠原及SCX mRNA的表達(dá)量均成逐漸上升趨勢,其中Ⅰ型膠原mRNA增加更明顯(圖2)。在損傷后2、4、6 周時,TSCs聯(lián)合水凝膠治療組Ⅰ型膠原及SCX mRNA的表達(dá)量均明顯高于其他3組,差異有明顯統(tǒng)計學(xué)意義(圖2a、c)。表明移植到大鼠體內(nèi)的TSCs在C/GP/Co水凝膠的協(xié)同作用下,利于向肌腱細(xì)胞分化。

圖2 PCR檢測相關(guān)基因的表達(dá)。a.Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)情況;b.Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)情況;c.SCX mRNA表達(dá)情況。#:P<0.05;TSCs:肌腱干細(xì)胞

損傷后2周,各組Ⅲ型膠原mRNA的表達(dá)量開始增加,但各組之間無明顯差異。損傷后4周,各組Ⅲ型膠原mRNA的表達(dá)量增加至最高水平,但TSCs聯(lián)合水凝膠治療組明顯低于其他3組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。損傷后6周,各組Ⅲ型膠原mRNA的表達(dá)量較前明顯降低,TSCs聯(lián)合水凝膠治療組明顯低于其他3組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖2b),表明移植到大鼠體內(nèi)的TSCs在C/GP/Co水凝膠的協(xié)同作用下,可抑制損傷區(qū)域瘢痕組織的增生,有利于提高損傷肌腱愈合質(zhì)量。

3 WB檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)

損傷后2周,TSCs聯(lián)合水凝膠治療組Ⅰ型膠原明顯高于其他3組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。但TSCs聯(lián)合水凝膠治療組Ⅲ型膠原明顯低于其他3組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。各組之間SCX無明顯差異(圖3a、b)。

圖3 WB檢測相關(guān)蛋白的表達(dá):檢測2周(a、b)、4周(c、d)及6周(e、f)各組成肌腱相關(guān)蛋白及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原及SCX蛋白)的表達(dá)情況。各組以對照組數(shù)據(jù)為參照,評估各組間的表達(dá)量差異(n=3)。#:P<0.05;GAPDH:甘油醛-3-磷酸脫氫酶;TSCs:肌腱干細(xì)胞;protein relative fold change:蛋白質(zhì)相對倍數(shù)差

損傷后4、6周,TSCs聯(lián)合水凝膠治療組的Ⅰ型膠原及SCX均明顯高于其他3組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。TSCs聯(lián)合水凝膠治療組的Ⅲ型膠原明顯低于其他3組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,圖3c～f)。

討 論

肌腱是肌肉骨骼系統(tǒng)的重要組成部分,其作用是在肌肉和骨骼之間傳遞力量以實現(xiàn)關(guān)節(jié)運動[11]。肌腱損傷常在體育運動及其他劇烈活動中發(fā)生,是肌肉骨骼系統(tǒng)最常見的損傷之一,其病因是多因素的,包括創(chuàng)傷、長期過度使用、老齡、炎癥和遺傳因素[12]。由于肌腱的愈合能力差,損傷后不能有效修復(fù),修復(fù)過程往往時間長,且常伴有瘢痕組織形成,導(dǎo)致?lián)p傷肌腱的機(jī)械性能下降,容易發(fā)生二次損傷或反復(fù)損傷[13]。肌腱損傷的治療通常采用非手術(shù)治療或手術(shù)治療,然而無論何種治療均有其局限性,不能恢復(fù)肌腱組織的天然成分、組織結(jié)構(gòu)及機(jī)械性能[14-15]。

肌腱損傷臨床治療效果差,可導(dǎo)致持續(xù)不適、功能和活動能力受損,常伴有長時間的功能障礙。肌腱的血供較其他大部分結(jié)締組織差,肌腱再生及修復(fù)緩慢,而且效果不理想。肌腱損傷后往往不能恢復(fù)其正常的生理功能及生物力學(xué)狀態(tài)。肌腱損傷后,肌腱修復(fù)及瘢痕形成常同時發(fā)生。目前認(rèn)為損傷肌腱的修復(fù)可以分為3個階段,包括:炎癥反應(yīng)期、細(xì)胞增殖期、重塑與成熟期,這些階段互相重疊、相互依賴。在早期炎癥反應(yīng)階期,紅細(xì)胞、炎癥細(xì)胞,特別是中性粒細(xì)胞浸潤至損傷部位,TSCs逐漸遷移至損傷部位,Ⅲ型膠原開始合成。損傷幾天后,在細(xì)胞增殖期,Ⅲ型膠原的合成達(dá)到最高峰;損傷幾周后,在重塑與成熟期,Ⅰ型膠原開始大量合成[16-17]。

干細(xì)胞是治療肌腱損傷、促進(jìn)損傷肌腱修復(fù)極具前景的方法?，F(xiàn)有研究表明:間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs)、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs)等均能促進(jìn)肌腱損傷修復(fù)[18- 19]。TSCs是肌腱來源,具有異體移植潛力的免疫豁免細(xì)胞[20]。使用TSCs治療肌腱損傷,促進(jìn)肌腱損傷修復(fù)是最明智也是最有前景的治療策略。局部注射TSCs至大鼠跟腱損傷區(qū)域很難避免干細(xì)胞滲漏等問題,而且TSCs也很難長時間在損傷部位發(fā)揮治療作用,因此研究更適宜的干細(xì)胞移植技術(shù)顯得十分重要。使用生物支架材料包裹干細(xì)胞注射至損傷部位以治療肌腱損傷應(yīng)是十分理想的策略,合適的生物支架材料應(yīng)具有良好的生物相容性,不刺激宿主引起炎癥反應(yīng)。

理想的肌腱組織工程支架應(yīng)盡可能模擬肌腱的天然ECM,以調(diào)節(jié)營養(yǎng)物質(zhì)、氧氣和代謝廢物,且免疫和炎癥反應(yīng)較輕,同時應(yīng)具有適當(dāng)?shù)臋C(jī)械性能、可降解性及良好的生物相容性,有利于細(xì)胞生長、增殖和分化[21]。水凝膠是一種具有生物活性、生物相容性及可生物降解的生物材料。現(xiàn)有研究表明:MSCs、BMSCs及ADSCs聯(lián)合殼聚糖及β-甘油磷酸鈉水凝膠,在體內(nèi)及體外實驗中均取得了良好的效果[22- 23]。筆者在前期的實驗中制備并證實C/GP/Co水凝膠可充分模擬天然肌腱的ECM[10]。本研究證實C/GP/Co聯(lián)合TSCs可明顯促進(jìn)I型膠原及SCX的表達(dá)。Ⅰ型膠原及SCX是肌腱在組織水平的特異標(biāo)志[20]。與此同時,C/GP/Co聯(lián)合TSCs可降低大鼠跟腱損傷區(qū)域Ⅲ型膠原的表達(dá)。肌腱損傷早期,Ⅲ型膠原及肉芽組織在損傷區(qū)域大量增殖。在肌腱損傷的自然愈合過程中,成功塑形的典型特征是損傷區(qū)域的Ⅰ型膠原逐漸替代Ⅲ型膠原[24]。

SCX是TSCs分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素,是肌腱的特異標(biāo)志物[25]。Ⅰ型膠原是肌腱里的主要膠原,占膠原總量的90%[16,26]。本實驗中Ⅰ型膠原和SCX的高表達(dá)表明損傷愈合的肌腱具有良好的膠原結(jié)構(gòu)。Ⅰ型膠原和肌腱組織的機(jī)械強(qiáng)度密切相關(guān),理想的Ⅰ/Ⅲ型膠原比例也與肌腱的愈合質(zhì)量緊密相關(guān)[27]。本實驗通過建立大鼠跟腱缺損模型,使用C/GP/Co水凝膠聯(lián)合TSCs注射至損傷局部,結(jié)果證實C/GP/Co水凝膠聯(lián)合TSCs可明顯促進(jìn)肌腱損傷愈合。具體表現(xiàn)為改善了細(xì)胞及膠原纖維的排列,增強(qiáng)了損傷愈合肌腱的生物力學(xué)性能等。本研究中,C/GP/Co水凝膠聯(lián)合TSCs組的Ⅰ/Ⅲ膠原比例較對照組等明顯升高,是其生物力學(xué)性能明顯增強(qiáng)的關(guān)鍵因素。

TSCs單獨治療肌腱損傷無明顯療效,本研究結(jié)論和其他學(xué)者的研究結(jié)果相一致。Chen等[28]研究證實:富血小板血漿可促進(jìn)肌腱損傷愈合,TSCs可明顯增強(qiáng)PRP的治療效果,但單獨注射TSCs并不能促進(jìn)肌腱損傷修復(fù)。其他證實干細(xì)胞有利于損傷肌腱修復(fù)的研究中,均使用了各種生物材料,包括肌腱凝膠[29]、纖維蛋白膠[30]及蠶絲膠原海綿狀支架[20]等。

本研究存在一些不足:首先本研究僅觀察了跟腱損傷后2、4、6 周的治療效果,研究周期較短,缺乏更長時間治療效果的研究資料;此外,本研究未進(jìn)行C/GP/Co水凝膠聯(lián)合TSCs治療的作用機(jī)制研究。在下一步實驗中,筆者團(tuán)隊將在C/GP/Co水凝膠的性能優(yōu)化,及C/GP/Co水凝膠聯(lián)合TSCs治療肌腱損傷的作用機(jī)制等方面進(jìn)行深入研究,為肌腱損傷的治療提供更堅實的理論基礎(chǔ),以及為C/GP/Co水凝膠聯(lián)合TSCs治療肌腱損傷提供切實可行的策略。

作者貢獻(xiàn)聲明：楊志金:課題及實驗設(shè)計、操作、記錄,論文撰寫、修改及審校; 徐江、徐雁華、陳康:文獻(xiàn)檢索、資料收集整理、數(shù)據(jù)整理; 謝美明:實驗指導(dǎo)、論文修改及審校;唐康來:研究及課題指導(dǎo)、實驗指導(dǎo)、論文修改