間充質(zhì)干細胞及其外泌體在急性肝衰竭中免疫調(diào)節(jié)作用的研究進展

李佳靜 荀運浩

急性肝衰竭（acute liver failure，ALF）是以迅速進展的肝性腦病、凝血功能障礙和多器官衰竭為主要表現(xiàn)的一組臨床癥候群，以短期內(nèi)大面積肝細胞壞死為特征，嚴重威脅患者的生命[1]。肝移植是目前治療ALF 最有效的手段，但在臨床應(yīng)用中因供體來源缺乏而受到限制，僅少數(shù)患者受惠。目前基于干細胞的肝臟再生研究備受關(guān)注，間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）作為當下研究的熱點，具有低免疫原性、無倫理學爭議等優(yōu)點，是干細胞移植治療時細胞類型的優(yōu)先選擇。研究表明，MSC 擁有強大的免疫調(diào)節(jié)、血管調(diào)節(jié)和肝臟保護特性，而MSC 源性外泌體（mesenchymal stem cell-derived exosome，MSC-Exo）通過接收細胞旁分泌的生物活性分子，具有與源細胞類似的免疫調(diào)節(jié)功能，而且更為穩(wěn)定，免疫原性更低[2-4]。事實上，作為無細胞治療策略的外泌體已被應(yīng)用于多種疾病的治療，如神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、肌肉骨骼系統(tǒng)疾病、肝臟疾病、腎臟疾病、眼病、皮膚疾病以及癌癥等[5]。盡管MSC/MSC-Exo 在調(diào)節(jié)自身免疫和炎癥反應(yīng)方面具有重要作用，但它們調(diào)節(jié)免疫細胞和減輕免疫介導的損傷的潛在機制尚未完全闡明。本文將從肝臟免疫微環(huán)境、外泌體的生物學特性、MSC/MSC-Exo在ALF 中的免疫調(diào)節(jié)作用、MSC/MSC-Exo 的臨床應(yīng)用前景等方面展開作一綜述。

1 肝臟免疫微環(huán)境

MSC/MSC-Exo 可調(diào)節(jié)肝內(nèi)免疫微環(huán)境，從而抑制免疫介導的肝損傷。MSC 以近分泌（細胞-細胞接觸依賴信號）和旁分泌[分泌可溶性因子前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）、IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、吲哚胺2，3-二氧酶（indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）、一氧化氮（nitric oxide，NO）、肝生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）、IL-1 受體拮抗劑（IL-1 receptor antagonist，IL-1ra）]方式調(diào)節(jié)肝臟微環(huán)境，并調(diào)節(jié)致病性免疫細胞的表型和功能[6]。MSC-Exo 恢復和維持組織微環(huán)境穩(wěn)態(tài)的能力取決于其內(nèi)含有的蛋白質(zhì)和RNA 等內(nèi)容物的生化特性[7]。MSC-Exo 中富含的miRNA 是重要的細胞內(nèi)調(diào)節(jié)分子，如通過靶向信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducers and activators of transcription 3，STAT3）的miR-223-3p、靶向磷酸肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）的miR-455-3p、靶向程序性死亡受體-4 的miR-21 和靶向核信號1 的miR-124-3p 等均可負性調(diào)節(jié)炎癥環(huán)境[8-9]。

2 外泌體的生物學特性

細胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）是指被釋放到細胞外的脂質(zhì)雙層膜封裝的囊泡，通常分為外泌體、微囊泡、凋亡小體等3類。外泌體直徑約30～150 nm，內(nèi)含重要的信息和生物大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸，其中核酸包括mRNA、非編碼RNA 和DNA[10-11]。通過以胞吐形式釋放到胞外的特性，使外泌體不僅成為細胞外基質(zhì)的一部分，還能調(diào)節(jié)細胞外微環(huán)境[12]。細胞外基質(zhì)中的外泌體可以通過受體-配體相互作用發(fā)出信號，可以通過內(nèi)吞作用被周圍靶細胞攝取，也可以通過血液、體液甚至穿過細胞間隙被運送到遠隔部位靶細胞，在免疫應(yīng)答、免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)和干細胞表型轉(zhuǎn)化等過程中發(fā)揮重要作用[13-15]。因目前本領(lǐng)域的大部分研究并未嚴格區(qū)分外泌體和微囊泡，本綜述描述的外泌體也包括具備外泌體特征的EV。

3 MSC/MSC-Exo 在ALF 中的免疫調(diào)節(jié)作用

肝衰竭最主要的病理生理學特征是肝臟乃至全身的炎癥反應(yīng)和免疫紊亂，較大程度的免疫損傷在短時間內(nèi)可造成大量肝細胞凋亡和壞死，隨后出現(xiàn)缺血、缺氧和內(nèi)毒素血癥，加速肝衰竭進展，即肝衰竭的“三重打擊”假說[16]。炎癥級聯(lián)反應(yīng)和免疫應(yīng)答失衡在ALF 的發(fā)病和轉(zhuǎn)歸中起關(guān)鍵作用，因此，緩解炎癥反應(yīng)并調(diào)節(jié)免疫細胞的活性是肝衰竭治療的重要選擇。

3.1 固有免疫細胞 肝組織可通過誘導免疫細胞活化來啟動固有免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，從而緩解肝損傷。肝損傷與免疫反應(yīng)之間的不平衡可導致炎癥反應(yīng)和肝細胞損傷的進展。因此，免疫抑制對于肝細胞再生和肝損傷修復是必要條件[17]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，MSC/MSC-Exo 可有效調(diào)節(jié)肝臟M1 或M2 型巨噬細胞、樹突狀細胞（dendritic cell，DC）、自然殺傷T 細胞（natural killer T cell，NKT）等先天免疫細胞以及調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cell，Treg）/輔助性T 細胞（helper T cell，Th）17 的平衡，從而介導免疫抑制，進而減輕肝臟的急性炎癥反應(yīng)。

3.1.1 M1 或M2 型巨噬細胞 巨噬細胞在肝臟疾病的發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用[18]。巨噬細胞極具可塑性，可以根據(jù)環(huán)境刺激極化為不同的功能表型，大致可分為M1 型和M2 型[19]。M1 型巨噬細胞可產(chǎn)生高水平的促炎細胞因子（包括IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α 等）、活性氮和活性氧，與引起并維持炎癥反應(yīng)有關(guān)[20]。相反的，交替激活的M2 型巨噬細胞可產(chǎn)生高水平的抗炎細胞因子（包括IL-10、TGF-β、IL-1ra），具有抗炎和修復的功能[20]。因此，促進巨噬細胞向M2 表型極化對緩解炎癥反應(yīng)和促進組織重塑至關(guān)重要。

越來越多的證據(jù)表明，MSC/MSC-Exo 可促進巨噬細胞向M2 表型極化，并調(diào)節(jié)炎癥因子釋放，從而減輕肝臟炎癥損傷。Wang 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在脂多糖/D-氨基半乳糖誘導的肝損傷小鼠模型中，MSC 分泌的PGE2通過抑制TGF-β 活化激酶1 信號和NLRP3 炎癥小體激活來阻止巨噬細胞的激活，并通過激活STAT6 和雷帕霉素靶蛋白信號來誘導生成M2 型巨噬細胞，從而促進肝臟炎癥消退。Zhao 等[22]研究發(fā)現(xiàn)，來自脂肪MSC 的外泌體可以轉(zhuǎn)移到巨噬細胞中，增加M2 表型相關(guān)的精氨酸酶-1、IL-10 的mRNA 水平。此外，脂肪MSC-Exo 通過其攜帶的STAT-3 反式激活精氨酸酶-1來誘導巨噬細胞向抗炎M2 表型極化，并顯著抑制由脂多糖和IFN-γ 刺激的巨噬細胞炎癥反應(yīng)。MSC-Exo促進巨噬細胞向M2 表型極化，miR-132、miR-let7 等miRNA 在炎癥反應(yīng)中高度上調(diào)，并可能通過調(diào)節(jié)Toll樣受體實現(xiàn)對M2 表型極化的誘導[23]。

3.1.2 Treg 與Th17 比值 Th17、Treg 是CD4+T 淋巴細胞的不同亞群，具有不同的分化途徑和功能。產(chǎn)生IL-17 的Th17 表達ROR-γt，而Treg 表達Foxp3 并分泌抗炎細胞因子，可通過抑制巨噬細胞、NKT、B 淋巴細胞的分化和增殖等發(fā)揮免疫耐受效應(yīng)[24]。Th17 與Treg之間的平衡對免疫反應(yīng)至關(guān)重要，尤其是在肝組織受損和免疫穩(wěn)態(tài)恢復過程中[25]。

目前研究認為，MSC/MSC-Exo 可通過調(diào)節(jié)Treg/Th17 之間的平衡來控制肝臟炎癥發(fā)展。Xie 等[26]在肝缺血/再灌注損傷小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，在肝缺氧/復氧微環(huán)境誘導下，影響Treg/Th17 比值的相關(guān)細胞因子IL-6、IL-17、ROR-γt mRNA 表達上調(diào)，但臍帶血MSC-Exo可顯著抑制該效應(yīng)，并且促進肝缺氧/復氧微環(huán)境對Foxp3、TGF-β1、IL-10 mRNA 表達上調(diào)的效應(yīng)；同時臍帶血MSC-Exo 通過miR-1246 介導的IL-6-gp130-STAT3 軸來調(diào)節(jié)Treg/Th17 之間的平衡，促進Th17 向Treg 遷移，從而減輕肝損傷。Court 等[27]研究發(fā)現(xiàn)，通過MSC 介導線粒體轉(zhuǎn)移至CD4+T 淋巴細胞的方式，可以強化T淋巴細胞向Treg分化，并通過上調(diào)Treg來減輕炎癥反應(yīng)。此外，研究表明MSC-Exo 通過miR-1246/NFAT5 軸、miR-19b/KLF13 軸和mTOR 介導軸以及MSC分泌肝細胞生長因子來平衡Treg/Th17比值[9，28]。

3.1.3 DC DC 是體內(nèi)已知功能最強的專職抗原提呈細胞，可通過激活T 淋巴細胞來誘導機體初始免疫應(yīng)答。研究表明，MSC/MSC-Exo 可通過調(diào)節(jié)DC 表型、減弱DC 的抗原提呈功能、抑制DC 的成熟和增殖等方式來減輕肝損傷。Zhang 等[29]研究發(fā)現(xiàn)，在痤瘡丙酸桿菌誘導的ALF 小鼠模型中，靜脈注射骨髓MSC（bone marrow-derived MSC，BM-MSC）可通過誘導肝臟DC 的調(diào)節(jié)表型來阻止ALF 的進展。BM-MSC 來源的PGE2通過激活EP4 受體誘導PI3K 和ERK1/2 激酶的磷酸化，并誘導肝臟DC 產(chǎn)生耐受性、免疫抑制表型。耐受性DC 通過誘導T 淋巴細胞無反應(yīng)或細胞凋亡以及Treg 的產(chǎn)生和增殖來幫助維持免疫耐受，減輕肝臟炎癥，遏制ALF 的發(fā)展。Reis 等[30]研究發(fā)現(xiàn)，MSC-Exo 可導致DC 成熟和活化的表面標志物CD83、CD38 和CD80 表達減少，導致DC 成熟停滯。此外，MSC 還通過下調(diào)DC 膜上主要組織相容性復合物Ⅱ類分子、共刺激分子表達以及減少NKT1、NKT17 相關(guān)炎性細胞因子的合成來減弱其抗原遞呈能力[3，31-32]。此外，MSC 還通過調(diào)節(jié)肝臟DC 表型和功能間接抑制肝臟NKT 的效應(yīng)功能[3]。

3.1.4 NKT NKT 被認為是ALF 發(fā)病機制中的主要效應(yīng)細胞，NKT 主要通過與專職抗原呈遞細胞（巨噬細胞和DC）和T 淋巴細胞的協(xié)同作用，和涉及Fas/FasL相互作用、穿孔素/顆粒酶系統(tǒng)以及IFN-γ、IL-4 和（或）TNF-α 介導的系統(tǒng)的效應(yīng)機制，導致肝細胞大量壞死[33]。Gazdic 等[34]研究發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)α-半乳糖腦苷脂誘導的肝損傷小鼠模型中，MSC 經(jīng)IDO 信號通路抑制NKT，導致產(chǎn)生TNF-α、IFN-γ 和IL-4 的NKT 總數(shù)減少，從而緩解肝損傷。MSC 來源的IDO 及其代謝產(chǎn)物犬尿氨酸主要負責誘導調(diào)節(jié)性DC，后者又可誘導免疫抑制表型調(diào)節(jié)性NKT 的產(chǎn)生和增殖[3，32]。MSC 來源的IDO 通過激活一般性調(diào)控阻遏蛋白激酶2 來阻止調(diào)節(jié)性NKT 轉(zhuǎn)分化為促炎性NKT17，并且可通過蛋白激酶B/mTOR 信號通路來抑制調(diào)節(jié)性NKT 合成炎癥細胞因子IL-17 和IL-22[3，34]。

3.2 適應(yīng)性免疫細胞 T 淋巴細胞和B 淋巴細胞受到MSC/MSC-Exo 的直接調(diào)節(jié)，也受MSC/MSC-Exo 誘導的天然免疫細胞介導的間接調(diào)節(jié)[35]。MSC/MSC-Exo 可限制CD4+T 淋巴細胞、CD8+T 淋巴細胞、γδT 淋巴細胞和B 淋巴細胞的增殖和激活[36-39]。

目前研究表明，MSC/MSC-Exo 可抑制T 淋巴細胞分化和增殖、調(diào)控T 淋巴細胞功能。Zhang 等[29]研究發(fā)現(xiàn)，在靜脈注射BM-MSC 治療痤瘡丙酸桿菌誘導的ALF 小鼠模型中，對肝臟浸潤性CD4+T 淋巴細胞的流式細胞術(shù)檢測顯示，活化細胞表面標志物CD44、CD69的表達減少，表明MSC 可抑制CD4+T 淋巴細胞的激活。MSC 下調(diào)Th1 趨化因子CXCL9、CXCL10、CCL3、CCL21 的產(chǎn)生，因此經(jīng)BM-MSC 治療后，小鼠肝臟中表達CXCR3 和CCR5 的效應(yīng)CD4+Th1 和表達CCR7 的記憶CD4+Th1 減少，伴隨著免疫抑制表型Treg 的增加。Blazquez 等[40]的體外實驗研究發(fā)現(xiàn)，MSC-Exo 對于CD4+T 淋巴細胞和CD8+T 淋巴細胞向效應(yīng)細胞或記憶細胞表型的分化具有抑制作用，這是由抗CD3/CD2/CD28 刺激介導的。MSC/MSC-Exo 還通過顯著減少IFN-γ 的分泌來抑制T 淋巴細胞的活化[40]。在MSC 存在的情況下生成的未成熟DC 不表達主要組織相容性復合物Ⅱ類分子和共刺激分子CD40、CD80、CD86，這會導致Th1 細胞無能[41]。MSC 通過分泌PGE2來抑制依賴DC 介導的初始T 淋巴細胞激活，下調(diào)Th1、Th2 中IFN-γ 和IL-4 表達，并刺激Treg 的生成和增殖[41-43]。

目前研究表明，MSC/MSC-Exo 可抑制B 淋巴細胞的增殖、分化和抗體產(chǎn)生。Palomares 等[44]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)IFN-γ 預(yù)處理的MSC 對初始B 淋巴細胞、記憶B 淋巴細胞和總B 淋巴細胞增殖均有較強的抑制作用，并且其抗體和免疫球蛋白的產(chǎn)生也受到明顯的抑制。類似的，Khare 等[39]在體外實驗中發(fā)現(xiàn)MSC-Exo 對B 淋巴細胞特異性mRNA 表達有廣泛影響，測序顯示186 個基因表達有顯著差異，并且免疫球蛋白IgM 的產(chǎn)生也受到顯著抑制。Lee 等[45]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)佛波酯前處理的MSC 以CXCL10 依賴的方式募集B 淋巴細胞，并以細胞程序性死亡-配體1 依賴的方式誘導細胞凋亡并同時抑制免疫球蛋白IgG 的產(chǎn)生。

綜上所述，MSC/MSC-Exo 可以抑制多種促炎細胞的活化和增殖，如Th1、Th17、M1 型巨噬細胞、T 淋巴細胞和B 淋巴細胞等，從而減少促炎細胞因子的分泌，同時促進M2 型巨噬細胞、Treg 等抗炎細胞的增殖，進而調(diào)節(jié)DC 和NKT 功能，增加抗炎細胞因子的分泌，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

4 MSC/MSC-Exo 的臨床應(yīng)用前景

當MSC 植入體內(nèi)后，能在損傷組織中發(fā)現(xiàn)這些細胞，但數(shù)量極少，僅占植入量的2%。在小鼠肝硬化模型中，植入體內(nèi)的MSC 大部分滯留在肺血管系統(tǒng)內(nèi)，僅少數(shù)達到肝臟[46]。為了提高MSC 治療的免疫調(diào)節(jié)效果，多項研究致力于MSC 的預(yù)處理策略，包括低氧、炎癥因子、三維細胞培養(yǎng)、基因工程方法和藥物或化學制劑等方法及其組合。適當?shù)念A(yù)處理能誘導MSC 釋放具有增強抗炎能力的外泌體[47]。經(jīng)處理的MSC-Exo的免疫調(diào)節(jié)作用依賴于miRNA（包括miR-216a-5p、miR-125a、miR125b、miR-1260b、miR-146a、miR-146a-5p、miR-210-3p、miR-34a、miR-124、miR-299-3p、miR-21、miR-147b、miRlet-7b、miR1246 和miR-135b等）和蛋白質(zhì)（包括TGF-β、CD73、IFN-γ、細胞程序性死亡-配體1、IDO、A20、TSG-6 和IL-10 等）作用于靶細胞，再使其表型轉(zhuǎn)化為免疫抑制型[47]。此外，外泌體還是理想的藥物遞送載體，可將生物活性分子包裹在膜內(nèi)免受降解，并通過外泌體的細胞內(nèi)吞作用來促進其在細胞內(nèi)的攝取。更重要的是，外泌體還能夠在不同物種之間傳遞，且不引起明顯的免疫反應(yīng)，這為外泌體的直接應(yīng)用提供了巨大優(yōu)勢[48]。但目前關(guān)于MSC/MSC-Exo 治療ALF的臨床隨機對照研究較少。Lin等[49]研究表明，在乙肝相關(guān)慢加急性肝衰竭患者中輸注骨髓MSC 能有效挽救肝損傷，試驗組（56例）每周輸注骨髓MSC并持續(xù)4周，與僅接受標準藥物治療的對照組（54 例）相比，24 周生存率明顯改善（55.6%比73.2%，P＜0.05），嚴重感染發(fā)生率明顯降低，血清TBil水平和終末期肝病模型評分均明顯下降。Schacher 等[50]研究表明，在慢加急性肝衰竭2～3 級患者中輸注骨髓MSC 安全可行。截至2023 年3月27 日，在美國臨床信息公示數(shù)據(jù)庫（https://clinicaltrials.gov）、藥物臨床試驗登記及公示平臺（http://www.chinadrugtrials.org.cn）和中國臨床試驗注冊中心（https://www.chictr.org.cn）中關(guān)于MSC/MSC-Exo 應(yīng)用于ALF 的臨床試驗共13 項，主要包括ChiCTR2100050852、ChiCTR200- 0030332、CTR20230389、CTR20212223、NCT-03863002、NCT03668171、NCT03629015、NCT02857010、NCT0482-2922、NCT02812121、NCT03860155、NCT014-29038、NCT-01724398?？梢姡琈SC/MSC-Exo 是一種有潛在價值的新型ALF 治療方法。

5 小結(jié)

不同來源的MSC/MSC-Exo 在ALF 的免疫調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用，可激活不同的信號轉(zhuǎn)導途徑調(diào)節(jié)免疫細胞功能，維持免疫抑制，進而抑制肝臟疾病的發(fā)生和發(fā)展；此外，MSC/MSC-Exo 還可以通過旁分泌的方式來影響機體其他組織器官。研究表明，外泌體的功效幾乎與源細胞的療效相匹配，并且是靶向運輸?shù)睦硐胼d體，提示外泌體具有作為無細胞療法的潛力，從而解決干細胞移植的安全問題，并提供一種宿主免疫反應(yīng)最小的選擇，但目前這一領(lǐng)域仍處于探索階段。外泌體的內(nèi)容物會受到周圍微環(huán)境的影響，合理的預(yù)處理可以調(diào)節(jié)其產(chǎn)物的含量和組成，以增強免疫治療效果。隨著生物工程的迅速發(fā)展，外泌體還可以經(jīng)過修飾，獲得更精準靶向器官、組織和細胞的能力。盡管MSC/MSC-Exo 在ALF 中的初步研究令人鼓舞，但MSC/MSC-Exo 在體外治療中達到臨床療效之前，仍有許多問題有待回答，比如不同來源MSC/MSC-Exo 的療效評價、MSC-Exo 用于人體的具體治療安全劑量和用藥方式等。因此，建議繼續(xù)研究MSC-Exo 的生物安全范圍，同時需要大樣本的長期體內(nèi)研究來評估外泌體的利弊。隨著研究的深入，相信在不久的將來，MSC/MSC-Exo 有望在肝衰竭精準治療中具有舉足輕重的地位，并將應(yīng)用于更廣闊的醫(yī)學領(lǐng)域。