黃連-川芎治療冠狀動(dòng)脈粥樣硬化和急性心肌梗死作用機(jī)制差異性的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

魏康康　劉敏　趙小晗　馬曉娟　史大卓　陳可冀

摘要目的：基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法與分子對(duì)接技術(shù)，探究活血解毒中藥藥對(duì)黃連-川芎治療冠狀動(dòng)脈粥樣硬化（CAS）和急性心肌梗死（AMI）作用機(jī)制的差異性，為活血解毒中藥在冠心病不同階段的應(yīng)用提供理論依據(jù)。方法：通過基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫（GEO）獲得CAS和AMI的差異基因，并進(jìn)行GEO差異分析。從中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（TCMSP）搜集黃連、川芎中主要活性成分和篩選預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。根據(jù)藥物作用靶點(diǎn)，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖并進(jìn)行拓?fù)浞治?，再利用DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因本體（GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析。采用Schrodinger軟件將中藥主要活性成分分別與CAS和AMI的關(guān)鍵蛋白進(jìn)行分子對(duì)接。結(jié)果：黃連-川芎治療CAS和AMI的活性成分基本相同。PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鲲@示，治療CAS有17種靶蛋白，治療AMI有37種靶蛋白，兩者共有16個(gè)相同的靶蛋白，而AMI多出了21個(gè)特有靶蛋白等，表明在AMI時(shí)，黃連-川芎能在調(diào)控CAS相關(guān)靶點(diǎn)基礎(chǔ)上進(jìn)一步作用于新的靶點(diǎn)。GO富集分析顯示黃連-川芎通過不同的生物過程干預(yù)CAS和AMI。KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)CAS相關(guān)通路為22條，而AMI相關(guān)通路為90條，兩者共有通路17條，但在CAS和AMI中的富集程度存在差異；而AMI特有的通路有73條，主要為腫瘤壞死因子（TNF）信號(hào)通路、核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路等，涉及多個(gè)炎癥相關(guān)通路；表明中藥黃連和川芎能夠在調(diào)控CAS相關(guān)通路的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步調(diào)控AMI時(shí)的特有通路。分子對(duì)接結(jié)果顯示，主要化合物和靶點(diǎn)能很好地結(jié)合，支持網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果。結(jié)論：本研究闡釋了黃連-川芎基于多化合物、多靶點(diǎn)、多途徑治療CAS和AMI的可能作用機(jī)制及兩者的差異性，發(fā)現(xiàn)黃連-川芎可以在調(diào)控CAS和AMI共有靶點(diǎn)和通路的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步作用于AMI發(fā)生時(shí)出現(xiàn)的特有蛋白和通路，揭示了在冠心病不同階段活血解毒中藥黃連-川芎作用的不同機(jī)制，從藥理學(xué)層面完善了冠心病的“瘀毒”理論。

關(guān)鍵詞冠狀動(dòng)脈粥樣硬化；急性心肌梗死；黃連；川芎；作用機(jī)制；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；活血解毒

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2023.23.002

The Mechanism? of Huanglian and Chuanxiong in the Treatment of Coronary Atherosclerosis and Acute Myocardial Infarction Based on Network Pharmacology

WEI Kangkang， LIU Min， ZHAO Xiaohan， MA Xiaojuan， SHI Dazhuo， CHEN Keji

National Clinical Research Center for Chinese Medicine Cardiology， Xiyuan Hospital， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100091， China; Peking University Traditional Chinese Medicine Clinical Medical School（Xiyuan）， Beijing 100091， China

Corresponding AuthorMA Xiaojuan， E-mail： abc_mxj@aliyun.com

AbstractObjective：To investigate the difference of the mechanisms of Huanglian and Chuanxiong in the treatment of coronary atherosclerosis（CAS） and acute myocardial infarction（AMI） based on a network pharmacology approach and molecular docking technology.Methods：The differential genes of CAS and AMI were obtained through the comprehensive gene expression database（GEO）.The main active ingredients and predicted targets in Huanglian and Chuanxiong were collected from the traditional Chinese medicine systematic pharmacology database and analysis platform（TCMSP）.According to drug action targets，protein-protein interaction network diagram（PPI） was constructed and topological analysis was performed.David database was used for gene ontology（GO） functional enrichment analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG） enrichment analysis.Schrodinger software was used to dock the key active ingredients of traditional Chinese medicine with the key proteins of CAS and AMI respectively.Results：The active ingredients of Huanglian and Chuanxiong in the treatment of CAS and AMI were similar.PPI network topology analysis showed that there were 17 target proteins for the treatment of CAS and 37 target proteins for the treatment of AMI，with a total of 16 identical target proteins，while AMI had 21 more specific target proteins，Huanglian and Chuanxiong could further act on new targets on the basis of regulating CAS related targets in AMI.GO enrichment analysis showed that blood activating and detoxifying herbs interfered with CAS and AMI through different biological processes.KEGG enrichment analysis showed that there were 22 CAS-related pathways and 90 AMI-related pathways，and there were 17 common pathways between CAS and AMI，but there were differences in the enrichment degree between CAS and AMI.There were 73 specific pathways of AMI，mainly tumor necrosis factor（TNF） signaling pathway，nuclear transcription factor-κB（NF-κB） signaling pathway，etc.，involving multiple inflammatory pathways.These results indicated that Huanglian and Chuanxiong could further regulate the specific pathway of AMI on the basis of the regulation of CAS related pathway.Molecular docking results showed that the main compounds and targets were well combined，supporting the network pharmacological results.Conclusion：In this study，the possible mechanism of action of Huanglian and Chuanxiong in the treatment of CAS and AMI based on multi-compound，multi-target and multi-pathway? were explained.It was found that Chinese herbs? could further act on the specific proteins and pathways in the occurrence of AMI on the basis of regulating the common targets and pathways of CAS.The different? mechanisms of activating blood and detoxification therapy in different stages of coronary heart disease were revealed，and the theory of "stasis poison" of coronary heart disease was perfected from the pharmacological level.

Keywordscoronary atherosclerosis; acute myocardial infarction; blood activating and detoxifying; Huanglian; Chuanxiong; mechanism; network pharmacology

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化（coronary atherosclerosis，CAS）是一種脂蛋白驅(qū)動(dòng)的疾病，通過內(nèi)膜炎癥、壞死、纖維化和鈣化導(dǎo)致動(dòng)脈特定部位的斑塊形成。隨著動(dòng)脈粥樣硬化的不斷發(fā)展，纖維帽薄的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊可能會(huì)突然破裂，暴露出高度血栓形成的、富含紅細(xì)胞的壞死核心物質(zhì)，導(dǎo)致危及生命的冠狀動(dòng)脈血栓形成，表現(xiàn)為急性冠狀動(dòng)脈綜合征［1-2］。目前，CAS和急性冠脈綜合征的藥物治療主要是降脂和抗血小板聚集［3］，以穩(wěn)定斑塊、抑制血栓形成；冠狀動(dòng)脈介入治療降低了急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）的院內(nèi)死亡率，但AMI仍是心血管病病人死亡的主要原因［4-5］。在CAS和AMI的治療中，中藥的良好療效已被諸多研究所證實(shí)［6］。

陳可冀院士團(tuán)隊(duì)通過對(duì)“瘀”“毒”和“瘀毒”等文獻(xiàn)的挖掘，結(jié)合現(xiàn)代相關(guān)臨床與基礎(chǔ)研究，印證了冠心病發(fā)生發(fā)展過程中“因瘀致毒、瘀毒互結(jié)”的病因病機(jī)，提出了冠心病“瘀毒致病”理論。CAS早期出現(xiàn)內(nèi)皮功能與微循環(huán)障礙、血液流變學(xué)異常、血小板聚集性增高、血液凝固性增高或纖溶活性降低等一般認(rèn)為屬于“血瘀”范疇。隨著動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，機(jī)體出現(xiàn)過氧化應(yīng)激損傷、炎癥反應(yīng)、血管活性物質(zhì)釋放、超氧化物增加等，則與“毒邪”致病特點(diǎn)吻合［7-8］。CAS斑塊穩(wěn)定，尚未發(fā)生急性心血管事件時(shí)，以血脈瘀阻為主，內(nèi)生毒邪多為“潛毒”；若遷延日久、失治誤治，一旦外因引動(dòng)，誘發(fā)AMI，毒邪發(fā)生量到質(zhì)的變化，則可“毒瘀搏結(jié)、痹阻心脈、蝕脈傷肌”［9-10］。黃連和川芎是具有代表性的活血解毒藥對(duì)，配伍使用可以協(xié)同增效，課題組前期研究證明了其在冠心病治療中具有抗血小板活化、抑制炎癥、穩(wěn)定斑塊等功效［11-12］。因此，本研究以黃連-川芎作為活血解毒藥代表藥對(duì)，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)探討其治療CAS和AMI作用機(jī)制的差異。

1資料與方法

1.1CAS與AMI差異基因篩選

在NCBI中選擇基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus，GEO，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）進(jìn)行檢索，檢索詞為：“動(dòng)脈粥樣硬化”或“心肌梗死”，獲得CAS和AMI與正常人差異基因數(shù)據(jù)。根據(jù)樣品基因表達(dá)情況，進(jìn)行差異基因分析，篩選與健康人相比CAS病人和AMI病人中上調(diào)和下調(diào)基因。使用R軟件進(jìn)行分析，以logFC的絕對(duì)值＞1，矯正后P＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)，獲得差異基因。選擇上調(diào)和下調(diào)的前20個(gè)差異基因，制作火山圖和熱圖。

1.2黃連與川芎活性成分的篩選

以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug likeness，DL）≥0.18兩項(xiàng)藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)，通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)數(shù)據(jù)庫（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php/）收集黃連和川芎的主要活性成分。

1.3黃連-川芎治療CAS和AMI的核心靶點(diǎn)篩選和預(yù)測(cè)

通過TCMSP網(wǎng)站對(duì)DrugBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，篩選出主要活性成分所對(duì)應(yīng)的靶基因，并將藥物靶基因和疾病差異基因取交集，預(yù)測(cè)中藥化合物治療CAS和AMI的核心靶點(diǎn)。將中藥、中藥活性成分、核心靶點(diǎn)輸入Cytoscape 3.7.1（http：/ /www.cytoscape.org/）軟件中，構(gòu)建中藥活性成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及拓?fù)浞治?/p>

使用Cytoscape進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，導(dǎo)入基因信息后，通過BisoGenet檢索HPRD、BIND、DTP、MINT、INTACT、BIOGRID數(shù)據(jù)庫獲取蛋白信息，選擇內(nèi)部節(jié)點(diǎn)和鄰近節(jié)點(diǎn)制作PPI蛋白網(wǎng)絡(luò)。然后利用CytoNCA包進(jìn)行拓?fù)浞治?，以中心度（degree centrality，DC）臨界節(jié)點(diǎn)數(shù)目、介數(shù)中心度（betweenness centrality，BC）為篩選標(biāo)準(zhǔn)，先以DC最小數(shù)值為61進(jìn)行篩選，再以BC最小值為600進(jìn)行篩選，最終獲得相關(guān)靶蛋白。

1.5富集分析

運(yùn)用DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因本體（Gene Ontology，GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析，其中GO分析通常分為生物過程（biological process，BP）、細(xì)胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）3大類。以P value Cutoff＝0.05及Q value Cutoff＝0.05為標(biāo)準(zhǔn)，使用R軟件運(yùn)行腳本，進(jìn)行GO和KEGG富集分析，選取前20個(gè)富集結(jié)果，分別繪制氣泡圖。將KEGG富集的前20個(gè)結(jié)果作為納入通路，分析每個(gè)通路對(duì)應(yīng)的靶基因，構(gòu)建KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6活性成分和靶點(diǎn)分子對(duì)接

分子對(duì)接技術(shù)是通過計(jì)算機(jī)模擬，預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與藥物分子之間的結(jié)合模式與親和力的一種方法。通過PDB數(shù)據(jù)庫（Protein Data Bank，PDB，https：//www.rcsb.org/）收集蛋白結(jié)構(gòu)，并從Pubchem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲得活性成分3D結(jié)構(gòu)。將兩者導(dǎo)入Schrodinger 2021，先進(jìn)行靶蛋白和化合物預(yù)處理，然后選中蛋白配體，生成對(duì)接文件，最后運(yùn)行Ligand Docking程序，獲得分子對(duì)接docking score及對(duì)接結(jié)果圖。

2結(jié)果

2.1CAS和AMI差異基因

納入的CAS研究共有19個(gè)樣本，其中6個(gè)來自健康人，13個(gè)來自CAS病人；納入的AMI研究共99個(gè)樣本，其中49個(gè)來自AMI病人，50個(gè)來自健康人。根據(jù)是否病變進(jìn)行分組，獲得對(duì)照組和試驗(yàn)組對(duì)應(yīng)基因，用于基因差異分析。將對(duì)照組和試驗(yàn)組中基因進(jìn)行對(duì)比，CAS共發(fā)現(xiàn)1 295個(gè)差異基因，其中587個(gè)上調(diào)，708個(gè)下調(diào)，而AMI共發(fā)現(xiàn)1 140個(gè)差異基因，其中589個(gè)上調(diào)，551個(gè)下調(diào)，每一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)基因，綠色代表對(duì)照組上調(diào)基因，紅色代表試驗(yàn)組上調(diào)基因，黑色代表兩組無差異基因。詳見圖1。根據(jù)基因差異程度，選擇上調(diào)和下調(diào)最明顯的20個(gè)基因繪制熱圖，其中肌動(dòng)蛋白絲切蛋白 1（CFL1）、核糖體蛋白L3（RPL3）、胸腺素β10（TMSB10）等在CAS試驗(yàn)組高表達(dá)，而白細(xì)胞介素1受體（IL1R2）、酰輔酶A合成酶1（ACSL1）、水通道蛋白9（AQP9）等在AMI試驗(yàn)組高表達(dá)。顏色由低到高代表基因表達(dá)強(qiáng)度。上調(diào)和下調(diào)最明顯的前20個(gè)基因詳見圖2。

2.2黃連與川芎活性成分和靶點(diǎn)篩選

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫，從黃連和川芎中篩選出21種符合條件的活性成分，對(duì)應(yīng)1 944個(gè)作用靶點(diǎn)。將中藥作用靶點(diǎn)與疾病差異基因取交集，結(jié)果顯示，CAS相關(guān)活性成分共7種，包括（R）-Canadine（R-氫化小檗堿）、Palmatine（黃藤素）、Berlambine（小檗浸堿）、Quercetin（槲皮素）、Myricanone（楊梅酮）、Berberine（黃連素）、Berberrubine（小檗紅堿），作用于15個(gè)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)；AMI相關(guān)活性成分共6種（缺少Berberrubine），作用于27個(gè)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，其中兩者共有預(yù)測(cè)靶點(diǎn)為CTSD和ODC1。利用Cytoscape 軟件構(gòu)建“疾病-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，將3者關(guān)系可視化，網(wǎng)絡(luò)圖外周為中藥治療疾病的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，內(nèi)部為活性成分及來源（棕色代表黃連，紫色代表川芎）。詳見圖3。

2.3PPI網(wǎng)絡(luò)及拓?fù)浞治?/p>

使用Cytoscape進(jìn)行CAS和AMI 的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，分別含有1 299個(gè)和1 918個(gè)蛋白。以DC最小數(shù)值為61進(jìn)行篩選，刪除重復(fù)節(jié)點(diǎn)，分別獲得271個(gè)和359個(gè)蛋白。建立新的子網(wǎng)絡(luò)，在新的網(wǎng)絡(luò)中以BC最小值為600進(jìn)一步篩選，最終得到DC＞61且 BC＞600的網(wǎng)絡(luò)圖（見圖4），CAS和AMI分別獲得17個(gè)和37個(gè)關(guān)鍵蛋白。從拓?fù)浞治鼋Y(jié)果可知，治療CAS有17種靶蛋白，治療AMI有37種靶蛋白，兩者共有16種相同的靶蛋白（不同的是YWHAZ），包括熱休克蛋白5（HSPA5）、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)型受體酪氨酸激酶1（NTRK1）、腫瘤蛋白TP53等；而AMI多出了21個(gè)特有靶蛋白，包括MYC、 FN1 抗原（重組蛋白）、核仁磷酸蛋白（NPM1）重組蛋白等；在AMI時(shí)，黃連-川芎能在調(diào)控CAS相關(guān)靶點(diǎn)基礎(chǔ)上，進(jìn)一步作用于新的靶點(diǎn)。

2.4GO功能富集分析

對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行BP、CC、MF三類GO功能富集分析，并制作氣泡圖，橫坐標(biāo)代表基因比例，縱坐標(biāo)代表GO的類別，圓圈大小代表富集的基因數(shù)目，顏色代表富集的顯著性。詳見圖5～圖7。CAS核心靶點(diǎn)主要通過調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)環(huán)境刺激的反應(yīng)、膠原代謝過程、脂肪細(xì)胞分化、膽固醇儲(chǔ)存、脂肪酸氧化等影響生物過程，而AMI主要通過調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)細(xì)菌來源分子的反應(yīng)、平滑肌細(xì)胞增殖、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、氧化應(yīng)激反應(yīng)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的產(chǎn)生等影響生物過程。此外，中藥在分泌顆粒內(nèi)腔、膜筏、膜微區(qū)、囊腔等方面影響CAS時(shí)細(xì)胞組分，在膜筏、膜微區(qū)、頂端plCASma膜、細(xì)胞頂端部分等方面影響AMI時(shí)細(xì)胞組分。最后，中藥還可以通過蛋白酶綁定、蛋白激酶調(diào)節(jié)活性、RNA聚合酶Ⅱ與特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等影響CAS時(shí)的分子功能，通過受體配體活動(dòng)、信號(hào)受體激活因子活性、細(xì)胞因子活性等影響AMI時(shí)的分子功能。

2.5KEGG通路分析

KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，黃連-川芎治療CAS和AMI的潛在通路分別有22條和90條，根據(jù)前20條通路制作氣泡圖（見圖8）。KEGG網(wǎng)絡(luò)（見圖9）描述了基因和通路的關(guān)系，均納入前20條通路，分別對(duì)應(yīng)12個(gè)和19個(gè)基因。KEGG網(wǎng)絡(luò)圖外周為富集前20的KEGG通路，中間為對(duì)應(yīng)基因，連線代表該基因?qū)儆诖送?，基因和通路連線越多，圖形面積越大表明CAS中MAPK14、CCASP3、CALM1等基因出現(xiàn)次數(shù)最多，主要涉及脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)通路、高級(jí)糖基化終末產(chǎn)物-受體（AGE-RAGE）信號(hào)通路、p53 信號(hào)通路、PPAR 信號(hào)通路、白細(xì)胞介素（IL）-17 信號(hào)通路等。AMI中Jun、IL-6、IL-β等基因出現(xiàn)最多，主要涉及流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)通路、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號(hào)通路、IL-17號(hào)通路、AGE-RAGE 信號(hào)通路、核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路等。黃連-川芎在治療CAS和AMI時(shí)，兩者共有通路17條，包括脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)通路，表明AGE-RAGE 信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路等，但在CAS和AMI中的富集程度存在差異；而AMI特有的通路有73條，主要為TNF信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路等，涉及多個(gè)炎癥相關(guān)通路，表明黃連-川芎能夠在調(diào)控CAS相關(guān)通路的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步調(diào)控AMI時(shí)的特有通路。

2.6分子對(duì)接結(jié)果與分析

利用Schrodinger軟件對(duì)靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)中符合條件的蛋白與中藥中3個(gè)主要活性成分進(jìn)行分子對(duì)接（包括一個(gè)黃連的活性成分，一個(gè)川芎的活性成分以及一個(gè)CAS相對(duì)于AMI特有的活性成分），列出對(duì)接效果居前10位的結(jié)果（見表1）。其中，對(duì)接得分（docking score）用來描述化合物與蛋白的結(jié)合能力，數(shù)值越小，結(jié)合越好。一般而言，同一個(gè)蛋白與不同化合物對(duì)接效果不同，組蛋白脫乙?；?（HDAC5）與3種活性成分均能很好地結(jié)合，其3D結(jié)構(gòu)見圖10。

表1靶蛋白和化合物對(duì)接結(jié)果靶蛋白PDB ID疾病化合物對(duì)接得分（分）HDAC53znsAMIBerberine（黃連素）－7.813HDAC53znsAMIBerberrubine（小檗紅堿）－7.694HDAC53znsAMIMyricanone（楊梅酮）－8.518MCM26wgfCAS＋AMIBerberine（黃連素）－7.132NTRK17vkoCAS＋AMIBerberine（黃連素）－7.199NTRK17vkoCAS＋AMIBerberrubine（小檗紅堿）－7.076NTRK17vkoCAS＋AMIMyricanone（楊梅酮）－7.492HSP90AA15h22CAS＋AMIBerberrubine（小檗紅堿）－7.886ESR14xi3CAS＋AMIBerberine（黃連素）－7.037ESR14xi3CAS＋AMIBerberrubine（小檗紅堿）－7.215

3討論

從CAS到AMI的過程中，涉及血小板活化、炎癥反應(yīng)、內(nèi)皮損傷、組織因子釋放、凝血級(jí)聯(lián)激活等多種因素影響［13-15］。基于冠心病“瘀毒理論”的指導(dǎo)，活血解毒中藥在心血管疾病中的作用已經(jīng)被諸多研究所證實(shí)［6，16］。本研究發(fā)現(xiàn)，黃連-川芎治療CAS和AMI時(shí)關(guān)鍵蛋白分別為17個(gè)和37個(gè)，其中16種關(guān)鍵蛋白相同，AMI時(shí)多出了21個(gè)特有靶蛋白。KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)黃連-川芎治療CAS和AMI的關(guān)鍵通路分別為22條和90條，其中17條通路相同，AMI特有的通路有73條，涉及多個(gè)炎癥通路。黃連-川芎可以在調(diào)控CAS和AMI共有靶點(diǎn)和通路的基礎(chǔ)上，調(diào)控發(fā)生AMI時(shí)的特有蛋白和通路，尤其是炎癥相關(guān)通路，為中醫(yī)CAS以“瘀”為主到AMI“瘀毒互結(jié)”的理論提供了一定依據(jù)。

通過對(duì)TCMSP數(shù)據(jù)庫獲得的活性成分的分析，發(fā)現(xiàn)黃連-川芎治療CAS和AMI發(fā)揮作用的主要活性成分包括（R）-氫化小檗堿、黃藤素、小檗浸堿、槲皮苷、楊梅酮、黃連素等。其中，氫化小檗堿可以通過與PRP1受體結(jié)合發(fā)揮抗血小板聚集作用［17］。棕櫚堿、黃連素都具有較好的降糖功效［18］，從而發(fā)揮調(diào)控心血管疾病作用［19］；棕櫚堿還可以通過激活抗氧化蛋白來保護(hù)細(xì)胞避免活性氧或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷［20］。黃連素不僅可以用于糖尿病的治療［21-22］，更是一種很好的抗炎藥物，廣泛應(yīng)用于心血管疾病的治療［23］，發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用［24］。此外，槲皮素具有抑制低密度脂蛋白氧化，降低內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子和炎性因子表達(dá)，以及抗血小板聚集等作用，從而用于CAS和AMI的治療［25］。

通過“疾病-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，發(fā)現(xiàn)中藥治療AMI的特有靶基因中有諸多炎癥相關(guān)靶點(diǎn)如IL-1A、IL-1B、IL-6等，而“瘀毒”理論認(rèn)為CAS發(fā)展到AMI時(shí)，因瘀致毒，以毒為主，炎癥是其重要表現(xiàn)之一，因此，該結(jié)果佐證了冠心病“瘀毒”學(xué)說的部分理論。PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治霭l(fā)現(xiàn)，黃連-川芎治療CAS的17種關(guān)鍵蛋白中有16種也是治療AMI的關(guān)鍵靶點(diǎn)，說明中藥黃連和川芎在治療CAS和AMI的作用靶點(diǎn)具有一定的共性，這可能是因?yàn)閮烧呦嗨频牟±砘A(chǔ)。同時(shí)，基于中藥多靶點(diǎn)作用，又可以調(diào)控AMI新出現(xiàn)的21個(gè)特定靶蛋白，體現(xiàn)了中藥治療AMI的特性。通過檢索GeneCard（https：//www.genecards.org/）對(duì)共有靶點(diǎn)進(jìn)行分析：一方面，活性化合物調(diào)控基因復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、蛋白伴侶等相關(guān)蛋白如微染色體維持蛋白2（MCM2）、細(xì)胞分裂蛋白激酶2（CDK2）、F盒蛋白6（FBXO6）等發(fā)揮作用；另一方面，通過調(diào)節(jié)心血管疾病相關(guān)蛋白如雌激素受體1（ESR1）調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮（NO）產(chǎn)生、含纈氨酸蛋白（VCP）調(diào)控NF-κB通路激活等發(fā)揮作用。

GO分析結(jié)果顯示，在BP富集中，CAS主要涉及膠原代謝、脂肪細(xì)胞分化、膽固醇儲(chǔ)存等，而AMI主要通過調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)細(xì)菌來源分子的反應(yīng)、平滑肌細(xì)胞增殖、氧化應(yīng)激反應(yīng)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的產(chǎn)生等，這與兩者病理狀態(tài)密切相關(guān)。此外，中藥調(diào)控CC和MF時(shí)也只有少數(shù)結(jié)果相同，如膜筏、DNA轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等，說明不同疾病狀態(tài)下，中藥可以調(diào)控不同的生物過程以達(dá)到治療目的。

通過KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)中藥治療CAS作用的17條通路也是治療AMI的通路，并且在AMI時(shí)，又調(diào)控了特有的73條通路。這說明隨著疾病從CAS向AMI的轉(zhuǎn)變，中藥可以根據(jù)疾病狀態(tài)的改變發(fā)揮多靶點(diǎn)、多通路作用，達(dá)到治療目的。對(duì)排名前20位的通路進(jìn)行分析，共同通路有6個(gè)，主要包括IL-17 信號(hào)通路、糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE 信號(hào)通路、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)通路。IL-17作為促炎細(xì)胞因子，可以誘導(dǎo)活性氧產(chǎn)生導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞衰老，引起血管促凝和抗凝機(jī)制失衡，促進(jìn)CAS進(jìn)展和血栓形成［26］。糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號(hào)通路可以調(diào)控絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、NF-κB等炎癥通路，在糖尿病和冠心病中均發(fā)揮著重要作用［27］。雖然黃連-川芎治療CAS和AMI時(shí)有部分共有通路，但兩者涉及的主要通路也有差異。除共有通路外，還可以通過過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）信號(hào)通路治療CAS。PPAR屬于核配體激活轉(zhuǎn)錄因子超家族，該通路不僅可以通過磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/活化內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）或MAPK/內(nèi)皮素-1（ET-1）通路調(diào)節(jié)胰島素信號(hào)通路和內(nèi)皮功能障礙，還可以調(diào)節(jié)腎素-血管緊張素系統(tǒng)級(jí)聯(lián)蛋白的基因表達(dá)以減緩動(dòng)脈粥樣硬化和高血壓的進(jìn)展［28］。而黃連素-川芎治療AMI的主要通路中，主要涉及TNF信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路等炎癥通路，體現(xiàn)了AMI“以毒為主”的理論。活血解毒中藥可以通過抑制炎癥通路，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞功能，維持抗凝和促凝功能平衡等，發(fā)揮治療CAS和AMI［9，29］的作用。

本研究使用分子對(duì)接技術(shù)檢查了化合物和關(guān)鍵靶點(diǎn)的結(jié)合情況，分子對(duì)接結(jié)果表明，受體和配體結(jié)合良好，支持網(wǎng)絡(luò)藥理研究結(jié)果。采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接的方法，闡釋了黃連-川芎通過多組分、多靶點(diǎn)、多途徑治療CAS和AMI的可能機(jī)制并比較了兩者的差異性。發(fā)現(xiàn)黃連-川芎可以在作用于CAS和AMI共有通路和蛋白的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步作用于發(fā)生AMI時(shí)出現(xiàn)的特有的蛋白和通路，從而干預(yù)冠心病的不同病理階段，體現(xiàn)了中藥多靶點(diǎn)作用的優(yōu)勢(shì)。黃連-川芎治療AMI時(shí)的特有靶點(diǎn)和通路與炎癥密切相關(guān)，屬于“毒”的范疇。這與中醫(yī)認(rèn)為CAS早期以“瘀”為主，到AMI時(shí)，“毒”從量變到達(dá)質(zhì)變，出現(xiàn)“毒瘀搏結(jié)，痹阻心脈”的認(rèn)識(shí)相似。本研究揭示了冠心病不同階段活血解毒治療的不同調(diào)控機(jī)制，進(jìn)一步從藥理學(xué)層面完善了冠心病的“瘀毒”理論。

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（收稿日期：2022-09-03）

（本文編輯王雅潔）