下調(diào)miR-31抑制心肌細胞凋亡并防止心肌缺血再灌注損傷的機制研究

樊開凱　路萬里　阮昕華　徐亞威　師強偉　梁振興

摘要目的：探究microRNA-31（miR-31）在心肌細胞缺氧/復(fù)氧（H/R）損傷及大鼠心肌缺血再灌注損傷（MIRI）中的作用。方法：通過inhibitor-miR-31及空病毒載體構(gòu)建miR-31低表達心肌細胞，采用H/R建立心肌細胞損傷模型，缺氧4 h再復(fù)氧2 h，采用定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）檢測細胞miR-31 mRNA相對水平，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率，蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測細胞半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）、活化半胱氨酸蛋白酶3（Cleaved Caspase-3）、活化半胱氨酸蛋白酶9（Cleaved Caspase-9）、半胱氨酸蛋白酶9（Caspase-9）、Bcl相關(guān)X蛋白（Bax）、B細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）蛋白表達。將Wistar大鼠分為對照組、MIRI組、MIRI＋inhibitor-NC組和MIRI＋inhibitor-miR-31組，每組24只，MIRI＋inhibitor-NC組和MIRI＋inhibitor-miR-31組大鼠心肌內(nèi)注射攜帶inhibitor-NC、inhibitor-miR-31的慢病毒載體，7 d后，采用左冠狀動脈結(jié)扎法構(gòu)建MIRI模型。慢病毒載體注射后14 d，超聲儀檢查大鼠心率（HR）、左心室壁厚度（LVWT）、左心室收縮末期容積（LVESV）和左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF），qRT-PCR檢測心肌組織miR-31 mRNA相對水平，氯化三苯基四氮唑（TTC）法檢測心臟梗死面積百分比，蘇木精-伊紅（HE）染色觀察大鼠心肌組織病理損傷，缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）染色觀察心肌組織凋亡率，酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清心肌肌鈣蛋白-I（cTnI）、肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）水平，Western Blot檢測心肌組織凋亡相關(guān)蛋白表達。結(jié)果：與對照組比較，H/R組心肌細胞miR-31 mRNA相對水平、細胞凋亡率和Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、Bax蛋白表達升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白表達降低（P＜0.05）；與H/R組比較，H/R＋inhibitor-miR-31組心肌細胞miR-31mRNA相對水平、細胞凋亡率和Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、Bax蛋白表達降低（P＜0.05），Bcl-2蛋白表達升高（P＜0.05）。與對照組比較，MIRI組大鼠心肌組織miR-31 mRNA相對水平、梗死面積百分比、細胞凋亡率、LVESV和血清cTnI、CK、CK-MB水平升高（P＜0.05），Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、Bax蛋白表達升高（P＜0.05），HR、LVWT、LVEF、Bcl-2蛋白表達降低（P＜0.05）；與MIRI組比較，MIRI＋inhibitor-miR-31組大鼠心肌組織miR-31 mRNA相對水平、梗死面積百分比、細胞凋亡率、LVESV和血清cTnI、CK、CK-MB降低（P＜0.05），Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、Bax蛋白表達降低（P＜0.05），HR、LVWT、LVEF和Bcl-2蛋白表達升高（P＜0.05）。結(jié)論：抑制miR-31表達能通過增強心肌細胞抗凋亡作用，改善心肌缺氧再灌注損傷。

關(guān)鍵詞心肌缺血再灌注損傷；心肌細胞損傷；microRNA-31；細胞凋亡；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2023.23.007

Effect of? miR-31 on? Cardiomyocytes Apoptosis and? Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury

FAN Kaikai， LU Wanli， RUAN Xinhua， XU Yawei， SHI Qiangwei， LIANG Zhenxing

First Affiliated Hospital of Zhengzhou University， Zhengzhou 450052， Henan， China， E-mail： fankaikai1980@163.com

AbstractObjective：To explore the effects of microRNA-31（miR-31） on cardiomyocytes hypoxia-reoxygenation（H/R） injury and myocardial ischemia-reperfusion injury（MIRI） in rats.Methods：The cardiomyocytes with low-expression miR-31 were constructed by inhibitor-miR-31 and empty virus vector.The models of cardiomyocyte injury were constructed by H/R.After 4 h of hypoxia and 2 h of reoxygenation，relative level of miR-31 mRNA was detected by quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction（qRT-PCR）.The cells apoptosis was detected by flow cytometry.The expressions of cysteine protease-3（Caspase-3），cleaved cysteine protease-3（Cleaved Caspase-3），cleaved cysteine protease-9（Cleaved Caspase-9），cysteine protease-9（Caspase-9），Bcl-associated X protein（Bax），and B-cell lymphoma/leukemia-2（Bcl-2） proteins were detected by Western Blot.Wistar rats were divided into control group，MIRI group，MIRI＋inhibitor-NC group，and MIRI＋inhibitor-miR-31 group，with 24 cases in each group.The rats in MIRI＋inhibitor-NC group and MIRI＋inhibitor-miR-31 group were given myocardial injection of lentiviral vectors carrying inhibitor-NC and inhibitor-miR-31.After 7 days，the MIRI models were constructed by left coronary ligation.At 14 d after injection of lentiviral vector，heart rate（HR），left ventricular wall thickness（LVWT），left ventricular end-systolic volume（LVESV），and left ventricular ejection fraction（LVEF） were detected by ultrasonic apparatus.The relative level of miR-31 mRNA in myocardial tissues was detected by qRT-PCR.The percentage of cardiac infarction area was detected by triphenyltetrazolium chloride（TTC）.The pathological damage of myocardial tissues was observed by hemotoxylin-eosin（HE） staining.The apoptosis rate of myocardial tissues was observed by terminal deoxyribonucleotidyl transferase（TdT）-mediated dUTP nick end labeling（TUNEL） staining.The levels of cardiac troponin-I（cTnI），creatine kinase（CK） and creatine kinase MB（CK-MB） were detected by enzyme-linked immunosorbent assay.The expressions of apoptosis-related proteins in myocardial tissues were detected by Western blot.Results：Compared with the control group，relative level of miR-31 mRNA in cardiomyocytes，apoptosis rate，expression levels of Cleaved Caspase-3，Cleaved Caspase-9 and Bax proteins? increased in H/R group（P＜0.05），while expression of Bcl-2 protein? decreased（P＜0.05）.Compared with H/R group，relative level of miR-31 mRNA in cardiomyocytes，apoptosis rate，expression levels of Cleaved Caspase-3，Cleaved Caspase-9 and Bax proteins? decreased in H/R＋inhibitor-miR-31 group（P＜0.05），while expression of Bcl-2 protein? increased（P＜0.05）.Compared with control group，relative level of miR-31 mRNA in myocardial tissues，percentage of infarction area，apoptosis rate，levels of LVESV，serum cTnI，CK and CK-MB? increased in MIRI group（P＜0.05），expressions of Cleaved Caspase-3，Cleaved Caspase-9 and Bax proteins? increased（P＜0.05），HR，LVWT，LVEF，and Bcl-2? decreased（P＜0.05）.Compared with MIRI group，relative level of miR-31 mRNA in myocardial tissues，percentage of infarction area，apoptosis rate，levels of LVESV，serum cTnI，CK and CK-MB? decreased in MIRI＋inhibitor-miR-31 group（P＜0.05），expressions of Cleaved Caspase-3，Cleaved Caspase-9 and Bax proteins? decreased（P＜0.05），HR，LVWT，LVEF，and Bcl-2? increased（P＜0.05）.Conclusion：Inhibition of miR-31 expression can relive MIRI by enhancing anti-apoptotic effect of cardiomyocytes.

Keywordsmyocardial ischemia-reperfusion injury; cardiomyocyte injury; microRNA-31; apoptosis; experimental study

急性心肌梗死是臨床上致死率、致殘率較高的心血管疾病之一［1］。藥物或冠狀動脈介入術(shù)再灌注治療是急性心肌梗死治療的主要方式，但心肌組織血流供應(yīng)中斷一定時間后再次恢復(fù)血流灌注時，會引起心肌缺血再灌注損傷（MIRI），進一步加重心肌損傷程度［2］。目前，臨床尚無有效的MIRI的治療方案［3］。微小RNA（miRNA）作為一種內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，通過降解靶mRNA或抑制其翻譯，調(diào)控相應(yīng)信號通路的變化進而影響相應(yīng)生理及病理過程［4］。研究表明，miRNA與多種心腦疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其中，miR-31表達降低可減輕大腦中動脈閉塞后的神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷，進而發(fā)揮心臟保護作用［5-6］。本研究通過構(gòu)建心肌細胞缺氧/復(fù)氧模型、大鼠MIRI模型探討miR-31影響缺血再灌注損傷的通路及機制，為MIRI的治療提供實驗基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1實驗動物

選取12～16周齡雌性Wistar大鼠100只，體質(zhì)量320～350 g，購自河南省實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（豫）2017—0001。動物房設(shè)置環(huán)境溫度25 ℃，相對濕度60%，12 h∶12 h明暗周期，大鼠自由攝食、飲水。動物處置方式均參照中國科學(xué)技術(shù)部發(fā)布的指導(dǎo)性意見［7］執(zhí)行。

1.2實驗藥物及試劑

綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記的inhibitor-miR-31及空病毒載體購自上海吉凱基因技術(shù)有限公司；脂質(zhì)體、Lipofectamine2000購自美國Thermo Fisher Scientific公司；10%胎牛血清購自美國Gibco公司；100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素購自美國Invitrogen公司；TRIzol Kit、Revertaid First Strand cDNA Kit購自Thermo Fisher科學(xué)公司；兔抗大鼠半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）、活化半胱氨酸蛋白酶3（Cleaved Caspase-3）、活化半胱氨酸蛋白酶9（Cleaved Caspase-9）、半胱氨酸蛋白酶9（Caspase-9）、Bcl相關(guān)X蛋白（Bax）、B細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體購自美國Abcam公司；心肌肌鈣蛋白-I（cTnI）、肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；細胞計數(shù)試劑盒購自碧云天公司。

1.3實驗儀器

高速冷凍離心機購自德國Beckman Coulter公司；正置熒光顯微鏡購自日本Thermo公司；Lightercylcer 1.2實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀購自德國羅氏公司；Vevo 770高分辨率成像系統(tǒng)超聲儀購自加拿大VISUALSONIC公司。

1.4方法

1.4.1原代心肌細胞制備、轉(zhuǎn)染及處理

原代心肌細胞制備：選取4只Wistar大鼠，腹腔注射戊巴比妥鈉（40 mg/kg）和肝素（250 μg/kg），成功麻醉后，打開大鼠胸腔，保留主動脈，于主動脈瓣環(huán)上方3～4 mm處切下心臟，將心臟放入37 ℃、750 μmol/L Ca^2＋溶液中以排出多余血液。將主動脈根部固定于Langendorff灌注管口，使用37 ℃、750 μmol/L Ca2＋溶液灌注2 min，再使用100 μmol/L Ca^2＋游離乙二醇四乙酸溶液灌注4 min，0.1%Ⅱ型膠原酶溶液灌注10～15 min。灌注完畢后取心尖組織并置于含有1%牛血清白蛋白的Ⅱ型膠原酶溶液中消化，使用200目尼龍篩過濾，過濾重復(fù)4～5次，過濾所得細胞液置37 ℃水浴自然沉降，棄上清，酶洗3次，M199培養(yǎng)基終止消化。使用層粘連蛋白預(yù)處理6孔板30 min，將消化所得細胞以104/cm2密度散布平板，加入無血清M199培養(yǎng)基孵育3 h，去除未貼壁細胞，再加入M199培養(yǎng)基，細胞培養(yǎng)過夜。

心肌細胞轉(zhuǎn)染：參照Lipofectamine2000試劑盒操作說明將inhibitor-miR-31及空病毒載體（inhibitor-NC）轉(zhuǎn)染至心肌細胞，培養(yǎng)48 h，置于熒光顯微鏡下觀察，發(fā)出綠色熒光信號則視為轉(zhuǎn)染陽性。

心肌細胞缺氧/復(fù)氧（H/R）處理：心肌細胞均在混合低氧氣體（95%N₂＋5%O₂）下平衡2 h以上，之后在缺氧培養(yǎng)箱（95%N₂＋5%CO₂）37 ℃缺氧處理4 h，更換培養(yǎng)基，95%空氣＋5%CO₂下培養(yǎng)2 h復(fù)氧；對照組細胞常規(guī)條件培養(yǎng)。設(shè)置H/R組、H/R＋inhibitor-NC組、H/R＋inhibitor-miR-31組。

1.4.2大鼠分組、預(yù)處理及MIRI模型建立

預(yù)處理操作：選取72只大鼠，用1.5%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉，稱重后固定在哈佛嚙齒動物呼吸機上（潮氣量2～3 mL，呼吸頻率60次/min），胸部常規(guī)脫毛后用碘伏消毒、斜切皮膚后，鈍性分離組織和肌肉，縱向切開第3肋骨、第4肋骨，切開心包暴露心臟，使用無菌微型注射器在4個不同的點，將總體積為200 μL的慢病毒溶液注射到大鼠左心室前壁［8-9］，手術(shù)后胸部逐層閉合。觀察大鼠自主呼吸30 min，呼吸穩(wěn)定后拔除氣管插管，繼續(xù)喂養(yǎng)7 d，再用于MIRI模型制備。大鼠MIRI模型制備：參考文獻［10］中造模方法，在左側(cè)開胸手術(shù)后暴露心臟，關(guān)閉胸腔以產(chǎn)生缺血前，使用4-0縫合線環(huán)和塑料管將左前降支附近的2 mm部分結(jié)扎，心電圖ST段抬高，結(jié)扎線下心肌組織呈磚紅色或蒼白，證實心肌缺血模型成功；左前降支結(jié)扎30 min后，取出塑料管進行再灌注，用于檢測心功能的各組大鼠在MIRI治療后保持胸腔存活，其余大鼠處死取材用于其他檢測。在處死大鼠之前測量體質(zhì)量。再灌注120 min。對照組的縫合線置于左前降支下方，不進行結(jié)扎，假手術(shù)持續(xù)150 min。大鼠分組預(yù)處理：將余下的96只大鼠隨機分為對照組、MIRI組、MIRI＋inhibitor-NC組和MIRI＋inhibitor-miR-31組，每組24只。MIRI組、MIRI＋inhibitor-NC組和MIRI＋inhibitor-miR-31組大鼠用于MIRI造模。在MIRI造模前，MIRI＋inhibitor-NC組和MIRI＋inhibitor-miR-31組大鼠分別于左心室前壁注射inhibitor-NC、inhibitor-miR-31慢病毒溶液預(yù)處理。

1.4.3大鼠心功能檢測

每組選取6只大鼠，于預(yù)處理后14 d，使用Vevo 770高分辨率成像系統(tǒng)超聲儀（探頭頻率40 MHz）檢測大鼠心率（HR）、左心室乳頭肌水平二維左心室短軸切片用于檢查左心室壁厚度（LVWT）、左心室收縮末期容積（LVESV）和左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）。連續(xù)測量4個心動周期，取平均值進行統(tǒng)計分析。

1.4.4氯化三苯基四氮唑（TTC）測定心肌梗死面積百分比

再灌注120 min后，每組隨機選取6只大鼠，快速處理后取心臟，超低溫－80 ℃條件下冷凍7 min，從心尖至心臟底部切5片置于1% TTC溶液中避光、37 ℃孵育25 min，10%甲醛固定24 h，相機拍攝切片染色情況，用Image J軟件計算心肌梗死面積百分比＝白色梗死區(qū)面積/紅色正常區(qū)面積×100%。

1.4.5心肌損傷血清標(biāo)志物水平檢測

再灌注120 min后，取腹主動脈血2 mL，3 000 r/min離心15 min，收集上清液，使用試劑盒檢測血清cTnI、CK、CK-MB水平。

1.4.6蘇木精-伊紅（HE）染色觀察心肌組織病理改變

再灌注120 min后，每組隨機選取6只大鼠，麻醉處死后，取大鼠左心室缺血處心肌組織于甲醛固定過夜后，行常規(guī)脫水、透明、包埋、切片制成石蠟切片，HE染色試劑盒對切片進行HE染色，在光鏡下觀察心肌組織的病理變化，每張切片隨機選取5個視野拍照。

1.4.7實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）檢測miR-31 mRNA相對水平

采用TRIZOL法提取細胞或心肌組織總RNA，然后將所得RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，采用SYBR-Green PCR Master Mix進行PCR，使用Fast Rea-l time PCR 7300操作系統(tǒng)分析miR-31 mRNA水平，以U6作為內(nèi)參基因計算miR-31 mRNA相對水平，采用2^－△△Ct法計算mRNA表達量。引物序列：miR-31正向引物為5′-AGGCAAGATGCTGGCATAGCT-3′，反向引物為5′-GCGAGCAGAGAATTAATACGAC-3′；U6正向引物為5′-CTCGCTTCGGGCAGCACA-3′，反向引物為5′-AACGCTCTCACGAATTTGCGT-3′。

1.4.8流式細胞儀檢測細胞凋亡率

將各組心肌細胞接種至6孔板（2×105個/mL），按照上述細胞H/R方式處理細胞，收集細胞，使用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）洗滌2次，調(diào)整細胞濃度至1×106/mL。將5 μL AnnexinV-異硫氰酸熒光素（FITC）和5 μL PI混合加入重懸細胞液中混勻，室溫避光5 min，行流式細胞儀檢測，使用儀器自帶軟件繪制流式圖。

1.4.9缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）檢測心肌細胞凋亡情況

取各組固定好的心肌組織切片脫蠟、乙醇梯度洗滌復(fù)水。加入蛋白酶K溶液并將樣品在室溫下孵育30 min，100 μL含有末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）平衡緩沖液室溫下孵育10～30 min，然后將5 μL TdT溶液和45 μL熒光素標(biāo)記的脫氧尿苷三磷酸（dUTP）添加到每個樣品中并充分混合。根據(jù)樣品量制備TUNEL反應(yīng)溶液，樣品密封、反應(yīng)溶液覆蓋37 ℃溫育60～90 min。465～495 nm的綠色熒光激發(fā)波長下分析標(biāo)記的凋亡細胞，并計算凋亡細胞率。

1.4.10蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測凋亡相關(guān)蛋白表達

收集心肌細胞、大鼠缺血心肌組織，置于－80 ℃條件下凍存，使用放射免疫沉淀法緩沖液（RIPA裂解液）提取總蛋白，二喹啉甲酸（BCA）對蛋白濃度進行測定。取50 μg總蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳、電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜（PVDF），室溫密封2 h，加入兔抗鼠Cleaved Caspase-3、Caspase-3、Cleaved Caspase-9、Caspase-9、Bax、Bcl-2、GAPDH一抗4 ℃孵育過夜，Tris緩沖鹽水與吐溫20（TBST）漂洗后，加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗孵育1 h，TBST漂洗后，電化學(xué)發(fā)光法（ECL）發(fā)光液顯色，采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參蛋白。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），兩兩比較采用SNK法檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組心肌細胞中miR-31 mRNA相對水平比較

與對照組比較，H/R組心肌細胞中miR-31 mRNA相對水平升高（P＜0.05）；與H/R組比較，H/R＋inhibitor-miR-31組miR-31 mRNA相對水平降低（P＜0.05）；H/R＋inhibitor-NC組與H/R組miR-31 mRNA相對水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。詳見圖1。

2.2miR-31對H/R心肌細胞凋亡率的影響及細胞凋亡相關(guān)蛋白表達情況

與對照組比較，H/R組心肌細胞凋亡率、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、Bax蛋白表達升高（P＜0.05），Bcl-2表達水平降低（P＜0.05）；與H/R組比較，H/R＋inhibitor-miR-31組心肌細胞凋亡率、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、Bax蛋白表達降低（P＜0.05），Bcl-2蛋白表達水平升高（P＜0.05）；H/R＋inhibitor-NC組和H/R組細胞凋亡率、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、Bax、Bcl-2蛋白表達比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。詳見圖2～圖5。

2.3miR-31對MIRI大鼠心肌損傷的影響

與對照組比較，MIRI組大鼠的心肌組織miR-31 mRNA相對水平和蛋白表達、心肌梗死面積百分比升高（P＜0.05）；與MIRI組比較，MIRI＋inhibitor-miR-31組大鼠的心肌組織miR-31 mRNA相對水平和蛋白表達、心肌梗死面積百分比降低（P＜0.05）；MIRI＋inhibitor-NC組和MIRI組miR-31 mRNA相對水平和蛋白比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。詳見圖6～圖10。

各組大鼠心肌組織HE染色顯示，對照組大鼠心肌細胞排列整齊，心肌間質(zhì)少，細胞核大小及胞漿染色均勻；MIRI組和MIRI＋inhibitor-NC組大鼠心肌細胞分布散亂，排列紊亂；MIRI＋inhibitor-miR-31組大鼠心肌細胞結(jié)構(gòu)散亂情況明顯減輕。詳見圖11。

2.4miR-31對MIRI大鼠血清cTnI、CK、CK-MB水平的影響

與對照組比較，MIRI組大鼠血清cTnI、CK、CK-MB水平升高（P＜0.05）；與MIRI組比較，MIRI＋inhibitor-miR-31組大鼠血清cTnI、CK、CK-MB水平降低（P＜0.05）；MIRI＋inhibitor-NC組和MIRI組血清cTnI、CK、CK-MB水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表1。

2.5miR-31對MIRI大鼠心臟功能的影響

與對照組比較，MIRI組大鼠HR、LVWT、LVEF降低（P＜0.05），LVESV升高（P＜0.05）；與MIRI組比較，MIRI＋inhibitor-miR-31組大鼠的HR、LVWT、LVEF升高（P＜0.05），LVESV降低（P＜0.05）；MIRI＋inhibitor-NC組和MIRI組大鼠HR、LVWT、LVEF、LVESV比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表2。

2.6miR-31對MIRI大鼠心肌組織凋亡及凋亡關(guān)鍵蛋白表達的影響

各組大鼠心肌組織TUNEL染色結(jié)果顯示，與對照組比較，MIRI組大鼠心肌組織細胞凋亡率升高（P＜0.05）；與MIRI組比較，MIRI＋inhibitor-miR-31組心肌組織細胞凋亡率降低（P＜0.05）；MIRI＋inhibitor-NC組和MIRI組大鼠心肌組織細胞凋亡率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。詳見圖12、圖13。

與對照組比較，MIRI組大鼠心肌組織Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、Bax蛋白表達升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白表達降低（P＜0.05）；與MIRI組比較，MIRI＋inhibitor-miR-31組心肌組織Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、Bax蛋白表達降低（P＜0.05），Bcl-2蛋白表達升高（P＜0.05）；MIRI＋inhibitor-NC組和MIRI組Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、Bax、Bcl-2比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。詳見圖14、圖15。

3討論

動脈介入治療是可解除冠狀動脈狹窄、改善心肌血供、降低急性心肌梗死病死率的重要治療手段之一，但是其伴隨的MIRI問題也是臨床醫(yī)務(wù)工作者關(guān)注的重點［11］。隨著miRNA在心血管疾病中的深入研究，miRNA參與心血管疾病發(fā)生、進展過程，在心血管疾病治療方面表現(xiàn)出潛在的指導(dǎo)價值［12］。本研究通過體外心肌細胞H/R損傷模型、大鼠MIRI模型探索miR-31與心肌細胞凋亡的關(guān)系，以期為MIRI的治療提供理論依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，H/R心肌細胞miR-31 mRNA相對水平升高，且心肌細胞凋亡率、凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Caspase-9、Bax蛋白表達也升高，抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表達降低；抑制miR-31表達后，H/R心肌細胞凋亡率和Caspase-3、Caspase-9、Bax蛋白表達水平降低，Bcl-2蛋白表達升高。Bcl-2家族蛋白是細胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，抗凋亡、促凋亡蛋白動態(tài)平衡失調(diào)會導(dǎo)致細胞凋亡的抑制或促進［13］。Bcl-2抑制細胞色素C釋放和Caspase-3激活，而Bax對細胞色素C釋放和Caspase-3激活有促進作用［14］?；罨腃aspase-3是凋亡級聯(lián)反應(yīng)過程中的關(guān)鍵蛋白，在細胞凋亡過程中通過裂解其他Caspase和抗凋亡蛋白Bcl-2發(fā)揮作用［15］。研究表明，上調(diào)miR-31表達可促進自發(fā)性高血壓大鼠的氧化應(yīng)激反［16］。MIRI所致氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、炎癥等應(yīng)激反應(yīng)可使缺血心肌發(fā)生二次打擊，誘發(fā)心臟結(jié)構(gòu)和功能損傷［17-18］。本研究結(jié)果顯示，MIRI大鼠的心肌梗死區(qū)域心肌細胞腫脹、細胞分布散亂、排列紊亂、胞漿染色較淺，心肌梗死區(qū)域明顯，同時HR、LVWT、LVEF降低，LVESV和心肌損傷標(biāo)志物cTnI、CK、CK-MB水平升高；而抑制miR-31表達的MIRI大鼠的心肌梗死面積減少，心肌組織病理損傷得到改善，同時大鼠心功能及心肌損傷得到改善，表明抑制miR-31表達對MIRI大鼠心臟功能有改善作用［19］。本研究結(jié)果顯示，MIRI大鼠心肌組織凋亡相關(guān)蛋白表達趨勢與體外細胞趨勢結(jié)果一致，表明下調(diào)miR-31表達可抑制線粒體呼吸中斷、基質(zhì)腫脹，減少促凋亡因子從膜間隙沉積至細胞質(zhì)誘導(dǎo)凋亡性細胞死亡，實現(xiàn)對MIRI的保護作用。研究顯示，miR-31可通過激活核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）信號通路加重慢性阻塞性肺疾病大鼠炎癥反應(yīng)和凋亡進程，而NF-κB信號通路參與MIRI［20-21］。因此，推測miR-31可能通過靶向調(diào)控NF-κB信號通路蛋白的表達，影響心肌細胞凋亡。

綜上所述，抑制miR-3表達可能通過影響抗凋亡Bcl-2和促凋亡Bax、Caspase-3、Caspase-9表達發(fā)揮心肌保護作用，miR-31具有MIRI治療靶點潛在機制，用于防止MIRI誘導(dǎo)的心臟損傷，但其具體的作用機制還有待進一步深入研究。

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（收稿日期：2022-06-02）

（本文編輯鄒麗）