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    下調(diào)miR-31抑制心肌細胞凋亡并防止心肌缺血再灌注損傷的機制研究

    2023-12-19 04:38:54樊開凱路萬里阮昕華徐亞威師強偉梁振興
    中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志 2023年23期
    關(guān)鍵詞:心肌細胞心肌梗死心肌

    樊開凱 路萬里 阮昕華 徐亞威 師強偉 梁振興

    摘要目的:探究microRNA-31(miR-31)在心肌細胞缺氧/復(fù)氧(H/R)損傷及大鼠心肌缺血再灌注損傷(MIRI)中的作用。方法:通過inhibitor-miR-31及空病毒載體構(gòu)建miR-31低表達心肌細胞,采用H/R建立心肌細胞損傷模型,缺氧4 h再復(fù)氧2 h,采用定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)檢測細胞miR-31 mRNA相對水平,流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率,蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測細胞半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)、活化半胱氨酸蛋白酶3(Cleaved Caspase-3)、活化半胱氨酸蛋白酶9(Cleaved Caspase-9)、半胱氨酸蛋白酶9(Caspase-9)、Bcl相關(guān)X蛋白(Bax)、B細胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)蛋白表達。將Wistar大鼠分為對照組、MIRI組、MIRI+inhibitor-NC組和MIRI+inhibitor-miR-31組,每組24只,MIRI+inhibitor-NC組和MIRI+inhibitor-miR-31組大鼠心肌內(nèi)注射攜帶inhibitor-NC、inhibitor-miR-31的慢病毒載體,7 d后,采用左冠狀動脈結(jié)扎法構(gòu)建MIRI模型。慢病毒載體注射后14 d,超聲儀檢查大鼠心率(HR)、左心室壁厚度(LVWT)、左心室收縮末期容積(LVESV)和左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF),qRT-PCR檢測心肌組織miR-31 mRNA相對水平,氯化三苯基四氮唑(TTC)法檢測心臟梗死面積百分比,蘇木精-伊紅(HE)染色觀察大鼠心肌組織病理損傷,缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)染色觀察心肌組織凋亡率,酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清心肌肌鈣蛋白-I(cTnI)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)水平,Western Blot檢測心肌組織凋亡相關(guān)蛋白表達。結(jié)果:與對照組比較,H/R組心肌細胞miR-31 mRNA相對水平、細胞凋亡率和Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、Bax蛋白表達升高(P<0.05),Bcl-2蛋白表達降低(P<0.05);與H/R組比較,H/R+inhibitor-miR-31組心肌細胞miR-31mRNA相對水平、細胞凋亡率和Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、Bax蛋白表達降低(P<0.05),Bcl-2蛋白表達升高(P<0.05)。與對照組比較,MIRI組大鼠心肌組織miR-31 mRNA相對水平、梗死面積百分比、細胞凋亡率、LVESV和血清cTnI、CK、CK-MB水平升高(P<0.05),Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、Bax蛋白表達升高(P<0.05),HR、LVWT、LVEF、Bcl-2蛋白表達降低(P<0.05);與MIRI組比較,MIRI+inhibitor-miR-31組大鼠心肌組織miR-31 mRNA相對水平、梗死面積百分比、細胞凋亡率、LVESV和血清cTnI、CK、CK-MB降低(P<0.05),Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、Bax蛋白表達降低(P<0.05),HR、LVWT、LVEF和Bcl-2蛋白表達升高(P<0.05)。結(jié)論:抑制miR-31表達能通過增強心肌細胞抗凋亡作用,改善心肌缺氧再灌注損傷。

    關(guān)鍵詞心肌缺血再灌注損傷;心肌細胞損傷;microRNA-31;細胞凋亡;實驗研究

    doi:10.12102/j.issn.1672-1349.2023.23.007

    Effect of? miR-31 on? Cardiomyocytes Apoptosis and? Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury

    FAN Kaikai, LU Wanli, RUAN Xinhua, XU Yawei, SHI Qiangwei, LIANG Zhenxing

    First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, Henan, China, E-mail: fankaikai1980@163.com

    AbstractObjective:To explore the effects of microRNA-31(miR-31) on cardiomyocytes hypoxia-reoxygenation(H/R) injury and myocardial ischemia-reperfusion injury(MIRI) in rats.Methods:The cardiomyocytes with low-expression miR-31 were constructed by inhibitor-miR-31 and empty virus vector.The models of cardiomyocyte injury were constructed by H/R.After 4 h of hypoxia and 2 h of reoxygenation,relative level of miR-31 mRNA was detected by quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction(qRT-PCR).The cells apoptosis was detected by flow cytometry.The expressions of cysteine protease-3(Caspase-3),cleaved cysteine protease-3(Cleaved Caspase-3),cleaved cysteine protease-9(Cleaved Caspase-9),cysteine protease-9(Caspase-9),Bcl-associated X protein(Bax),and B-cell lymphoma/leukemia-2(Bcl-2) proteins were detected by Western Blot.Wistar rats were divided into control group,MIRI group,MIRI+inhibitor-NC group,and MIRI+inhibitor-miR-31 group,with 24 cases in each group.The rats in MIRI+inhibitor-NC group and MIRI+inhibitor-miR-31 group were given myocardial injection of lentiviral vectors carrying inhibitor-NC and inhibitor-miR-31.After 7 days,the MIRI models were constructed by left coronary ligation.At 14 d after injection of lentiviral vector,heart rate(HR),left ventricular wall thickness(LVWT),left ventricular end-systolic volume(LVESV),and left ventricular ejection fraction(LVEF) were detected by ultrasonic apparatus.The relative level of miR-31 mRNA in myocardial tissues was detected by qRT-PCR.The percentage of cardiac infarction area was detected by triphenyltetrazolium chloride(TTC).The pathological damage of myocardial tissues was observed by hemotoxylin-eosin(HE) staining.The apoptosis rate of myocardial tissues was observed by terminal deoxyribonucleotidyl transferase(TdT)-mediated dUTP nick end labeling(TUNEL) staining.The levels of cardiac troponin-I(cTnI),creatine kinase(CK) and creatine kinase MB(CK-MB) were detected by enzyme-linked immunosorbent assay.The expressions of apoptosis-related proteins in myocardial tissues were detected by Western blot.Results:Compared with the control group,relative level of miR-31 mRNA in cardiomyocytes,apoptosis rate,expression levels of Cleaved Caspase-3,Cleaved Caspase-9 and Bax proteins? increased in H/R group(P<0.05),while expression of Bcl-2 protein? decreased(P<0.05).Compared with H/R group,relative level of miR-31 mRNA in cardiomyocytes,apoptosis rate,expression levels of Cleaved Caspase-3,Cleaved Caspase-9 and Bax proteins? decreased in H/R+inhibitor-miR-31 group(P<0.05),while expression of Bcl-2 protein? increased(P<0.05).Compared with control group,relative level of miR-31 mRNA in myocardial tissues,percentage of infarction area,apoptosis rate,levels of LVESV,serum cTnI,CK and CK-MB? increased in MIRI group(P<0.05),expressions of Cleaved Caspase-3,Cleaved Caspase-9 and Bax proteins? increased(P<0.05),HR,LVWT,LVEF,and Bcl-2? decreased(P<0.05).Compared with MIRI group,relative level of miR-31 mRNA in myocardial tissues,percentage of infarction area,apoptosis rate,levels of LVESV,serum cTnI,CK and CK-MB? decreased in MIRI+inhibitor-miR-31 group(P<0.05),expressions of Cleaved Caspase-3,Cleaved Caspase-9 and Bax proteins? decreased(P<0.05),HR,LVWT,LVEF,and Bcl-2? increased(P<0.05).Conclusion:Inhibition of miR-31 expression can relive MIRI by enhancing anti-apoptotic effect of cardiomyocytes.

    Keywordsmyocardial ischemia-reperfusion injury; cardiomyocyte injury; microRNA-31; apoptosis; experimental study

    急性心肌梗死是臨床上致死率、致殘率較高的心血管疾病之一[1]。藥物或冠狀動脈介入術(shù)再灌注治療是急性心肌梗死治療的主要方式,但心肌組織血流供應(yīng)中斷一定時間后再次恢復(fù)血流灌注時,會引起心肌缺血再灌注損傷(MIRI),進一步加重心肌損傷程度[2]。目前,臨床尚無有效的MIRI的治療方案[3]。微小RNA(miRNA)作為一種內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA,通過降解靶mRNA或抑制其翻譯,調(diào)控相應(yīng)信號通路的變化進而影響相應(yīng)生理及病理過程[4]。研究表明,miRNA與多種心腦疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),其中,miR-31表達降低可減輕大腦中動脈閉塞后的神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷,進而發(fā)揮心臟保護作用[5-6]。本研究通過構(gòu)建心肌細胞缺氧/復(fù)氧模型、大鼠MIRI模型探討miR-31影響缺血再灌注損傷的通路及機制,為MIRI的治療提供實驗基礎(chǔ)。

    1材料與方法

    1.1實驗動物

    選取12~16周齡雌性Wistar大鼠100只,體質(zhì)量320~350 g,購自河南省實驗動物中心,動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(豫)2017—0001。動物房設(shè)置環(huán)境溫度25 ℃,相對濕度60%,12 h∶12 h明暗周期,大鼠自由攝食、飲水。動物處置方式均參照中國科學(xué)技術(shù)部發(fā)布的指導(dǎo)性意見[7]執(zhí)行。

    1.2實驗藥物及試劑

    綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記的inhibitor-miR-31及空病毒載體購自上海吉凱基因技術(shù)有限公司;脂質(zhì)體、Lipofectamine2000購自美國Thermo Fisher Scientific公司;10%胎牛血清購自美國Gibco公司;100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素購自美國Invitrogen公司;TRIzol Kit、Revertaid First Strand cDNA Kit購自Thermo Fisher科學(xué)公司;兔抗大鼠半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)、活化半胱氨酸蛋白酶3(Cleaved Caspase-3)、活化半胱氨酸蛋白酶9(Cleaved Caspase-9)、半胱氨酸蛋白酶9(Caspase-9)、Bcl相關(guān)X蛋白(Bax)、B細胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體購自美國Abcam公司;心肌肌鈣蛋白-I(cTnI)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司;細胞計數(shù)試劑盒購自碧云天公司。

    1.3實驗儀器

    高速冷凍離心機購自德國Beckman Coulter公司;正置熒光顯微鏡購自日本Thermo公司;Lightercylcer 1.2實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)儀購自德國羅氏公司;Vevo 770高分辨率成像系統(tǒng)超聲儀購自加拿大VISUALSONIC公司。

    1.4方法

    1.4.1原代心肌細胞制備、轉(zhuǎn)染及處理

    原代心肌細胞制備:選取4只Wistar大鼠,腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)和肝素(250 μg/kg),成功麻醉后,打開大鼠胸腔,保留主動脈,于主動脈瓣環(huán)上方3~4 mm處切下心臟,將心臟放入37 ℃、750 μmol/L Ca2+溶液中以排出多余血液。將主動脈根部固定于Langendorff灌注管口,使用37 ℃、750 μmol/L Ca2+溶液灌注2 min,再使用100 μmol/L Ca2+游離乙二醇四乙酸溶液灌注4 min,0.1%Ⅱ型膠原酶溶液灌注10~15 min。灌注完畢后取心尖組織并置于含有1%牛血清白蛋白的Ⅱ型膠原酶溶液中消化,使用200目尼龍篩過濾,過濾重復(fù)4~5次,過濾所得細胞液置37 ℃水浴自然沉降,棄上清,酶洗3次,M199培養(yǎng)基終止消化。使用層粘連蛋白預(yù)處理6孔板30 min,將消化所得細胞以104/cm2密度散布平板,加入無血清M199培養(yǎng)基孵育3 h,去除未貼壁細胞,再加入M199培養(yǎng)基,細胞培養(yǎng)過夜。

    心肌細胞轉(zhuǎn)染:參照Lipofectamine2000試劑盒操作說明將inhibitor-miR-31及空病毒載體(inhibitor-NC)轉(zhuǎn)染至心肌細胞,培養(yǎng)48 h,置于熒光顯微鏡下觀察,發(fā)出綠色熒光信號則視為轉(zhuǎn)染陽性。

    心肌細胞缺氧/復(fù)氧(H/R)處理:心肌細胞均在混合低氧氣體(95%N2+5%O2)下平衡2 h以上,之后在缺氧培養(yǎng)箱(95%N2+5%CO2)37 ℃缺氧處理4 h,更換培養(yǎng)基,95%空氣+5%CO2下培養(yǎng)2 h復(fù)氧;對照組細胞常規(guī)條件培養(yǎng)。設(shè)置H/R組、H/R+inhibitor-NC組、H/R+inhibitor-miR-31組。

    1.4.2大鼠分組、預(yù)處理及MIRI模型建立

    預(yù)處理操作:選取72只大鼠,用1.5%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉,稱重后固定在哈佛嚙齒動物呼吸機上(潮氣量2~3 mL,呼吸頻率60次/min),胸部常規(guī)脫毛后用碘伏消毒、斜切皮膚后,鈍性分離組織和肌肉,縱向切開第3肋骨、第4肋骨,切開心包暴露心臟,使用無菌微型注射器在4個不同的點,將總體積為200 μL的慢病毒溶液注射到大鼠左心室前壁[8-9],手術(shù)后胸部逐層閉合。觀察大鼠自主呼吸30 min,呼吸穩(wěn)定后拔除氣管插管,繼續(xù)喂養(yǎng)7 d,再用于MIRI模型制備。大鼠MIRI模型制備:參考文獻[10]中造模方法,在左側(cè)開胸手術(shù)后暴露心臟,關(guān)閉胸腔以產(chǎn)生缺血前,使用4-0縫合線環(huán)和塑料管將左前降支附近的2 mm部分結(jié)扎,心電圖ST段抬高,結(jié)扎線下心肌組織呈磚紅色或蒼白,證實心肌缺血模型成功;左前降支結(jié)扎30 min后,取出塑料管進行再灌注,用于檢測心功能的各組大鼠在MIRI治療后保持胸腔存活,其余大鼠處死取材用于其他檢測。在處死大鼠之前測量體質(zhì)量。再灌注120 min。對照組的縫合線置于左前降支下方,不進行結(jié)扎,假手術(shù)持續(xù)150 min。大鼠分組預(yù)處理:將余下的96只大鼠隨機分為對照組、MIRI組、MIRI+inhibitor-NC組和MIRI+inhibitor-miR-31組,每組24只。MIRI組、MIRI+inhibitor-NC組和MIRI+inhibitor-miR-31組大鼠用于MIRI造模。在MIRI造模前,MIRI+inhibitor-NC組和MIRI+inhibitor-miR-31組大鼠分別于左心室前壁注射inhibitor-NC、inhibitor-miR-31慢病毒溶液預(yù)處理。

    1.4.3大鼠心功能檢測

    每組選取6只大鼠,于預(yù)處理后14 d,使用Vevo 770高分辨率成像系統(tǒng)超聲儀(探頭頻率40 MHz)檢測大鼠心率(HR)、左心室乳頭肌水平二維左心室短軸切片用于檢查左心室壁厚度(LVWT)、左心室收縮末期容積(LVESV)和左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)。連續(xù)測量4個心動周期,取平均值進行統(tǒng)計分析。

    1.4.4氯化三苯基四氮唑(TTC)測定心肌梗死面積百分比

    再灌注120 min后,每組隨機選取6只大鼠,快速處理后取心臟,超低溫-80 ℃條件下冷凍7 min,從心尖至心臟底部切5片置于1% TTC溶液中避光、37 ℃孵育25 min,10%甲醛固定24 h,相機拍攝切片染色情況,用Image J軟件計算心肌梗死面積百分比=白色梗死區(qū)面積/紅色正常區(qū)面積×100%。

    1.4.5心肌損傷血清標(biāo)志物水平檢測

    再灌注120 min后,取腹主動脈血2 mL,3 000 r/min離心15 min,收集上清液,使用試劑盒檢測血清cTnI、CK、CK-MB水平。

    1.4.6蘇木精-伊紅(HE)染色觀察心肌組織病理改變

    再灌注120 min后,每組隨機選取6只大鼠,麻醉處死后,取大鼠左心室缺血處心肌組織于甲醛固定過夜后,行常規(guī)脫水、透明、包埋、切片制成石蠟切片,HE染色試劑盒對切片進行HE染色,在光鏡下觀察心肌組織的病理變化,每張切片隨機選取5個視野拍照。

    1.4.7實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)檢測miR-31 mRNA相對水平

    采用TRIZOL法提取細胞或心肌組織總RNA,然后將所得RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,以cDNA為模板,采用SYBR-Green PCR Master Mix進行PCR,使用Fast Rea-l time PCR 7300操作系統(tǒng)分析miR-31 mRNA水平,以U6作為內(nèi)參基因計算miR-31 mRNA相對水平,采用2-△△Ct法計算mRNA表達量。引物序列:miR-31正向引物為5′-AGGCAAGATGCTGGCATAGCT-3′,反向引物為5′-GCGAGCAGAGAATTAATACGAC-3′;U6正向引物為5′-CTCGCTTCGGGCAGCACA-3′,反向引物為5′-AACGCTCTCACGAATTTGCGT-3′。

    1.4.8流式細胞儀檢測細胞凋亡率

    將各組心肌細胞接種至6孔板(2×105個/mL),按照上述細胞H/R方式處理細胞,收集細胞,使用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗滌2次,調(diào)整細胞濃度至1×106/mL。將5 μL AnnexinV-異硫氰酸熒光素(FITC)和5 μL PI混合加入重懸細胞液中混勻,室溫避光5 min,行流式細胞儀檢測,使用儀器自帶軟件繪制流式圖。

    1.4.9缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測心肌細胞凋亡情況

    取各組固定好的心肌組織切片脫蠟、乙醇梯度洗滌復(fù)水。加入蛋白酶K溶液并將樣品在室溫下孵育30 min,100 μL含有末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)平衡緩沖液室溫下孵育10~30 min,然后將5 μL TdT溶液和45 μL熒光素標(biāo)記的脫氧尿苷三磷酸(dUTP)添加到每個樣品中并充分混合。根據(jù)樣品量制備TUNEL反應(yīng)溶液,樣品密封、反應(yīng)溶液覆蓋37 ℃溫育60~90 min。465~495 nm的綠色熒光激發(fā)波長下分析標(biāo)記的凋亡細胞,并計算凋亡細胞率。

    1.4.10蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測凋亡相關(guān)蛋白表達

    收集心肌細胞、大鼠缺血心肌組織,置于-80 ℃條件下凍存,使用放射免疫沉淀法緩沖液(RIPA裂解液)提取總蛋白,二喹啉甲酸(BCA)對蛋白濃度進行測定。取50 μg總蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳、電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜(PVDF),室溫密封2 h,加入兔抗鼠Cleaved Caspase-3、Caspase-3、Cleaved Caspase-9、Caspase-9、Bax、Bcl-2、GAPDH一抗4 ℃孵育過夜,Tris緩沖鹽水與吐溫20(TBST)漂洗后,加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗孵育1 h,TBST漂洗后,電化學(xué)發(fā)光法(ECL)發(fā)光液顯色,采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值,以GAPDH為內(nèi)參蛋白。

    1.5統(tǒng)計學(xué)處理

    采用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA),兩兩比較采用SNK法檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2結(jié)果

    2.1各組心肌細胞中miR-31 mRNA相對水平比較

    與對照組比較,H/R組心肌細胞中miR-31 mRNA相對水平升高(P<0.05);與H/R組比較,H/R+inhibitor-miR-31組miR-31 mRNA相對水平降低(P<0.05);H/R+inhibitor-NC組與H/R組miR-31 mRNA相對水平比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖1。

    2.2miR-31對H/R心肌細胞凋亡率的影響及細胞凋亡相關(guān)蛋白表達情況

    與對照組比較,H/R組心肌細胞凋亡率、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、Bax蛋白表達升高(P<0.05),Bcl-2表達水平降低(P<0.05);與H/R組比較,H/R+inhibitor-miR-31組心肌細胞凋亡率、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、Bax蛋白表達降低(P<0.05),Bcl-2蛋白表達水平升高(P<0.05);H/R+inhibitor-NC組和H/R組細胞凋亡率、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、Bax、Bcl-2蛋白表達比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖2~圖5。

    2.3miR-31對MIRI大鼠心肌損傷的影響

    與對照組比較,MIRI組大鼠的心肌組織miR-31 mRNA相對水平和蛋白表達、心肌梗死面積百分比升高(P<0.05);與MIRI組比較,MIRI+inhibitor-miR-31組大鼠的心肌組織miR-31 mRNA相對水平和蛋白表達、心肌梗死面積百分比降低(P<0.05);MIRI+inhibitor-NC組和MIRI組miR-31 mRNA相對水平和蛋白比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖6~圖10。

    各組大鼠心肌組織HE染色顯示,對照組大鼠心肌細胞排列整齊,心肌間質(zhì)少,細胞核大小及胞漿染色均勻;MIRI組和MIRI+inhibitor-NC組大鼠心肌細胞分布散亂,排列紊亂;MIRI+inhibitor-miR-31組大鼠心肌細胞結(jié)構(gòu)散亂情況明顯減輕。詳見圖11。

    2.4miR-31對MIRI大鼠血清cTnI、CK、CK-MB水平的影響

    與對照組比較,MIRI組大鼠血清cTnI、CK、CK-MB水平升高(P<0.05);與MIRI組比較,MIRI+inhibitor-miR-31組大鼠血清cTnI、CK、CK-MB水平降低(P<0.05);MIRI+inhibitor-NC組和MIRI組血清cTnI、CK、CK-MB水平比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

    2.5miR-31對MIRI大鼠心臟功能的影響

    與對照組比較,MIRI組大鼠HR、LVWT、LVEF降低(P<0.05),LVESV升高(P<0.05);與MIRI組比較,MIRI+inhibitor-miR-31組大鼠的HR、LVWT、LVEF升高(P<0.05),LVESV降低(P<0.05);MIRI+inhibitor-NC組和MIRI組大鼠HR、LVWT、LVEF、LVESV比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2。

    2.6miR-31對MIRI大鼠心肌組織凋亡及凋亡關(guān)鍵蛋白表達的影響

    各組大鼠心肌組織TUNEL染色結(jié)果顯示,與對照組比較,MIRI組大鼠心肌組織細胞凋亡率升高(P<0.05);與MIRI組比較,MIRI+inhibitor-miR-31組心肌組織細胞凋亡率降低(P<0.05);MIRI+inhibitor-NC組和MIRI組大鼠心肌組織細胞凋亡率比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖12、圖13。

    與對照組比較,MIRI組大鼠心肌組織Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、Bax蛋白表達升高(P<0.05),Bcl-2蛋白表達降低(P<0.05);與MIRI組比較,MIRI+inhibitor-miR-31組心肌組織Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、Bax蛋白表達降低(P<0.05),Bcl-2蛋白表達升高(P<0.05);MIRI+inhibitor-NC組和MIRI組Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、Bax、Bcl-2比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖14、圖15。

    3討論

    動脈介入治療是可解除冠狀動脈狹窄、改善心肌血供、降低急性心肌梗死病死率的重要治療手段之一,但是其伴隨的MIRI問題也是臨床醫(yī)務(wù)工作者關(guān)注的重點[11]。隨著miRNA在心血管疾病中的深入研究,miRNA參與心血管疾病發(fā)生、進展過程,在心血管疾病治療方面表現(xiàn)出潛在的指導(dǎo)價值[12]。本研究通過體外心肌細胞H/R損傷模型、大鼠MIRI模型探索miR-31與心肌細胞凋亡的關(guān)系,以期為MIRI的治療提供理論依據(jù)。

    本研究結(jié)果顯示,H/R心肌細胞miR-31 mRNA相對水平升高,且心肌細胞凋亡率、凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Caspase-9、Bax蛋白表達也升高,抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表達降低;抑制miR-31表達后,H/R心肌細胞凋亡率和Caspase-3、Caspase-9、Bax蛋白表達水平降低,Bcl-2蛋白表達升高。Bcl-2家族蛋白是細胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,抗凋亡、促凋亡蛋白動態(tài)平衡失調(diào)會導(dǎo)致細胞凋亡的抑制或促進[13]。Bcl-2抑制細胞色素C釋放和Caspase-3激活,而Bax對細胞色素C釋放和Caspase-3激活有促進作用[14]?;罨腃aspase-3是凋亡級聯(lián)反應(yīng)過程中的關(guān)鍵蛋白,在細胞凋亡過程中通過裂解其他Caspase和抗凋亡蛋白Bcl-2發(fā)揮作用[15]。研究表明,上調(diào)miR-31表達可促進自發(fā)性高血壓大鼠的氧化應(yīng)激反[16]。MIRI所致氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、炎癥等應(yīng)激反應(yīng)可使缺血心肌發(fā)生二次打擊,誘發(fā)心臟結(jié)構(gòu)和功能損傷[17-18]。本研究結(jié)果顯示,MIRI大鼠的心肌梗死區(qū)域心肌細胞腫脹、細胞分布散亂、排列紊亂、胞漿染色較淺,心肌梗死區(qū)域明顯,同時HR、LVWT、LVEF降低,LVESV和心肌損傷標(biāo)志物cTnI、CK、CK-MB水平升高;而抑制miR-31表達的MIRI大鼠的心肌梗死面積減少,心肌組織病理損傷得到改善,同時大鼠心功能及心肌損傷得到改善,表明抑制miR-31表達對MIRI大鼠心臟功能有改善作用[19]。本研究結(jié)果顯示,MIRI大鼠心肌組織凋亡相關(guān)蛋白表達趨勢與體外細胞趨勢結(jié)果一致,表明下調(diào)miR-31表達可抑制線粒體呼吸中斷、基質(zhì)腫脹,減少促凋亡因子從膜間隙沉積至細胞質(zhì)誘導(dǎo)凋亡性細胞死亡,實現(xiàn)對MIRI的保護作用。研究顯示,miR-31可通過激活核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)信號通路加重慢性阻塞性肺疾病大鼠炎癥反應(yīng)和凋亡進程,而NF-κB信號通路參與MIRI[20-21]。因此,推測miR-31可能通過靶向調(diào)控NF-κB信號通路蛋白的表達,影響心肌細胞凋亡。

    綜上所述,抑制miR-3表達可能通過影響抗凋亡Bcl-2和促凋亡Bax、Caspase-3、Caspase-9表達發(fā)揮心肌保護作用,miR-31具有MIRI治療靶點潛在機制,用于防止MIRI誘導(dǎo)的心臟損傷,但其具體的作用機制還有待進一步深入研究。

    參考文獻:

    [1]王仁學(xué),毛琳霜,姜子超,等.急性ST段抬高型心肌梗死患者經(jīng)皮冠狀動脈介入治療后發(fā)生微循環(huán)堵塞的關(guān)聯(lián)因素研究[J].解放軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2021,42(12):1254-1258.

    [2]郭曉嵐,衛(wèi)攀,李粉娜,等.急性心肌梗死PCI術(shù)后患者5 d心臟康復(fù)程序效果研究[J].空軍醫(yī)學(xué)雜志,2021,37(1):54-58.

    [3]鄒青,盧少平,張明明,等.FIB和TNF-α聯(lián)合檢測對冠心病患者PCI術(shù)后心肌缺血再灌注損傷的預(yù)測價值[J].臨床誤診誤治,2021,34(6):71-75.

    [4]陳宇飛,徐煦,王曉建,等.microRNA-31在β-氨基丙腈誘導(dǎo)的主動脈瘤/夾層小鼠主動脈中的表達[J].中國分子心臟病學(xué)雜志,2021,21(5):4242-4247.

    [5]高華,楊嘉君,張新華.miR-19b-3p、MnSOD、NO/ET-1與腦梗死后血管性癡呆預(yù)測效能[J].分子診斷與治療雜志,2021,13(6):865-868;872.

    [6]李潔,車玉琴.miR-31對小鼠大腦中動脈閉塞后神經(jīng)元炎癥反應(yīng)以及氧化應(yīng)激損傷的影響[J].免疫學(xué)雜志,2021,37(5):369-379.

    [7]史曉萍,宗阿南,陶鈞,等.《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》的研究[J].中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2007,36(4):493-493.

    [8]YOSHIMITSU M,HIGUCHI K,DAWOOD F,et al.Correction of cardiac abnormalities in fabry mice by direct intraventricular injection of a recombinant lentiviral vector that engineers expression of ALPHA galactosidase A[J].Circulation Journal,2006,70(11):1503-1508.

    [9]SYLVAIN F,ELEONORA S,CHRISTIAN Z,et al.Multiply attenuated,self-inactivating lentiviral vectors efficiently deliver and express genes for extended periods of time in adult rat cardiomyocytes in vivo[J].Circulation,2003,107(18):2375-2382.

    [10]SONG C L,LIU B,DIAO H Y,et al.Down-regulation of microRNA-320 suppresses cardiomyocyte apoptosis and protects against myocardial ischemia and reperfusion injury by targeting IGF-1[J].Oncotarget,2016,7(26):39740-39757.

    [11]唐泉,銀劍斌,吳剛,等.曲美他嗪對老年ST段抬高型心肌梗死患者冠狀動脈介入術(shù)后心肌缺血再灌注損傷的影響[J].中國老年學(xué)雜志,2019,39(7):1543-1546.

    [12]SCRLTESCU A I,MICHEU M M,POPA-FOTEA N M,et al.microRNAs in acute ST elevation myocardial infarction--a new tool for diagnosis and prognosis:therapeutic implications[J].International Journal of Molecular Sciences,2021,22(9):4799.

    [13]LADOKHIN A S.Regulation of apoptosis by the Bcl-2 family of proteins:field on a brink[J].Cells,2020,9(9):2121.

    [14]LUO Y,F(xiàn)U X Y,RU R Z,et al.CpG oligodeoxynucleotides induces apoptosis of human bladder cancer cells via caspase-3-Bax/Bcl-2-p53 axis[J].Archives of Medical Research,2020,51(3):233-244.

    [15]WANG J N,LI X W.Chamaejasmine induces apoptosis in human non-small-cell lung cancer A549 cells through increasing the Bax/Bcl-2 ratio,caspase-3 and activating the Fas/FasL[J].Minerva Medica,2021,112(3):413-414.

    [16]ZHOU B,WU L L,ZHENG F,et al.miR-31-5p promotes oxidative stress and vascular smooth muscle cell migration in spontaneously hypertensive rats via inhibiting FNDC5 expression[J]. Biomedicines, 2021,9(8):1009.

    [17]ZHANG J,HUANG L L,SHI X,et al.Metformin protects against myocardial ischemia-reperfusion injury and cell pyroptosis via AMPK/NLRP3 inflammasome pathway[J].Aging,2020,12(23):24270-24287.

    [18]GAO R R,WANG L J,BEI Y H,et al.Long noncoding RNA cardiac physiological hypertrophy-associated regulator induces cardiac physiological hypertrophy and promotes functional recovery after myocardial ischemia-reperfusion injury[J].Circulation,2021,144(4):303-317.

    [19]梅長鳴,周正平,吳玉華.血清CK、CK-MB、Mb、cTnI及NT-proBNP預(yù)測運動性心臟損傷的效果分析[J].貴州醫(yī)藥,2021,45(1):49-51.

    [20]WU H,MIAO Y,SHANG L Q,et al.MiR-31 aggravates inflammation and apoptosis in COPD rats via activating the NF-κB signaling pathway[J]. European Review for Medical and Pharmacological Sciences,2020,24(18):9626-9632.

    [21]BAI Y J,LI Z G,LIU W H,et al.Biochanin A attenuates myocardial ischemia/reperfusion injury through the TLR4/NF-κB/NLRP3 signaling pathway[J].Acta Cirurgica Brasileira,2019,34(11):e201901104.

    (收稿日期:2022-06-02)

    (本文編輯鄒麗)

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