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    pH 和pCO2 對抗體五聚甘露糖修飾水平的影響研究

    2023-12-18 13:09:02陳孝歡孫瑞強(qiáng)
    生物化工 2023年5期
    關(guān)鍵詞:糖苷酶酸化比例

    陳孝歡,孫瑞強(qiáng)

    (1.復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,上海 200438;2.上海藥明生物技術(shù)有限公司,上海 200131)

    目前,生物制藥領(lǐng)域的主流藥物類型仍然是重組抗體類蛋白藥物,該類藥物的糖基化修飾對藥效有重要影響,由于N-型糖基化修飾中的五聚甘露糖(Man 5)能與人體細(xì)胞中的甘露糖受體結(jié)合,可以顯著加速抗體類蛋白藥物在人體中的清除速率。人體內(nèi)源性抗體的高聚甘露糖含量極少(<0.1%)[1],而通過中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)表達(dá)的重組抗體的高聚甘露糖比例更高,通常在1%~20%[2]。細(xì)胞培養(yǎng)過程中許多工藝參數(shù)均會影響目的蛋白的Man 5 修飾比例,例如培養(yǎng)基、添加物、溫度、滲透壓和pH等[3]。其中關(guān)于pH 對Man 5 修飾水平影響的研究中,極端pH 條件(pH <6.5 或pH >7.5)均會影響高爾基體功能,從而使Man 5 修飾水平大大提高[4]。而在常規(guī)pH 培養(yǎng)范圍內(nèi),有學(xué)者觀察到高pH 有利于降低Man 5 比例[5];也有學(xué)者提出,不同細(xì)胞系下,pH 對Man 5 的影響作用存在差異[6]。由于哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)常使用CO2氣體降低培養(yǎng)體系中的pH,所以低pH 條件下通常還伴隨高pCO2的情況,在未詳細(xì)探究pCO2對Man 5 影響的情況下,將Man 5 水平變化的原因歸結(jié)為pH 稍顯片面,有可能忽略真實原因。

    本文使用鹽酸和CO2對pH 和pCO2分別進(jìn)行控制,并通過完全析因?qū)嶒炘O(shè)計方法(簡稱全因子設(shè)計,cfDoE),研究了胞外pH(pHe)和pCO2與Man 5修飾水平的關(guān)系[pH 的研究水平分別為6.85±0.05 和7.35±0.05,pCO2的研究水平分別為(30±10) mmHg和(130±10) mmHg],通過胞內(nèi)pH(pHi)檢測、細(xì)胞周期檢測和關(guān)鍵糖苷酶轉(zhuǎn)錄水平檢測初步探究了在工藝條件影響下,Man 5 水平發(fā)生變化的潛在內(nèi)因。

    1 材料與方法

    1.1 細(xì)胞株

    本文所用細(xì)胞株為重組了Fc 端融合蛋白基因的單克隆,由上海藥明生物技術(shù)有限公司細(xì)胞株構(gòu)建部使用CHO-K1 宿主轉(zhuǎn)染構(gòu)建而成,可正常生長和表達(dá)目的蛋白。

    1.2 試劑與儀器

    培養(yǎng)所用培養(yǎng)基均為化學(xué)限定培養(yǎng)基。基礎(chǔ)培養(yǎng)基CD CHO,美國Introgen 公司;基礎(chǔ)培養(yǎng)基ActiPro以及補(bǔ)料培養(yǎng)基Cell Boost 7a 和Cell Boost 7b,美國Cytiva 公司;pH 指示劑pHrodo Green AM Intracellular,美國Thermo Fisher 公司;碘化丙啶/核糖核酸酶染色緩沖液PI/RNase Staining Buffer,美國BD 公司;pCO2電極,美國Metteler Toledo 公司;3 L 玻璃生物反應(yīng)器,荷蘭Applikon 公司;生物反應(yīng)器控制器,美國Thermo Fisher 公司;Vi-CELL XR 細(xì)胞計數(shù)儀,美國Beckman公司;Cedex Bio HT 生化分析儀,瑞士Roche 公司;BGA 348EX 血氣分析儀,美國Siemens 公司;Accuri C6 流式分析儀,美國BD 公司;ISF1-X CO2搖床,瑞士Kuhner 公司。

    1.3 種子細(xì)胞培養(yǎng)

    從液氮罐中取出凍存細(xì)胞后,放置在37 ℃水浴2 min 復(fù)蘇,接種至裝有CD CHO 培養(yǎng)基的搖瓶中,置于36.5 ℃、6% CO2的搖床中120 r/min 懸浮培養(yǎng)。之后每3 天傳一次代,傳代初始密度為0.20×106cells/mL。

    1.4 批次補(bǔ)料培養(yǎng)

    將種子細(xì)胞以0.4×106cells/mL 接種至3 L 玻璃生物反應(yīng)器中,初始培養(yǎng)體積為1 500 mL,攪拌轉(zhuǎn)速為250 r/min, 初始培養(yǎng)溫度為36.5 ℃,培養(yǎng)第5 d 降溫至31 ℃;初始培養(yǎng)pH 為7.0±0.2,第6 d 更改pH設(shè)置,開啟pCO2控制,詳細(xì)控制方案如表1 所示。溶氧設(shè)置目標(biāo)值為40%,在培養(yǎng)第3 d、5 d、7 d、10 d分別進(jìn)行補(bǔ)料,CB7a 補(bǔ)料體積為45 mL,CB7b 補(bǔ)料體積為4.5 mL。

    表1 pHe 和pCO2 控制方案

    1.5 細(xì)胞培養(yǎng)日常參數(shù)檢測

    每日取樣3 mL 進(jìn)行日常參數(shù)檢測,檢測內(nèi)容包括細(xì)胞計數(shù)檢測活細(xì)胞密度和細(xì)胞活率,血氣分析儀檢測離線pH 和pCO2,生化分析儀檢測葡萄糖濃度和乳酸濃度。

    1.6 抗體表達(dá)量和糖基化分析

    抗體表達(dá)量由生化分析儀檢測完成;糖型分析由上海藥明生物技術(shù)有限公司分析科學(xué)部支持,使用高效液相方法完成。

    1.7 pHi 檢測

    對批次補(bǔ)料培養(yǎng)第8 d、10 d、12 d 和收獲日(14 d)的細(xì)胞進(jìn)行pHi檢測(檢測時間代號分別為D8、D10、D12、D14),依據(jù)pHrodo Green AM Intracellualr pH 試劑的protocol 染色孵育后,使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行熒光強(qiáng)度分析,激發(fā)波長為488 nm,接收波長為533 nm。熒光強(qiáng)度越高代表pHi值越低。

    1.8 細(xì)胞周期檢測

    對批次補(bǔ)料培養(yǎng)收獲日的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期檢測,使用PI/RNase Staining Buffer 避光染色孵育15 min后,使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行染色分析,以低流速進(jìn)樣20 000 events, 在PE-A/count 中標(biāo)取不同周期階段的細(xì)胞組群,單倍體峰為G0/G1 期,中間過渡區(qū)為S 期,二倍體峰為G2/M 期,并統(tǒng)計各期細(xì)胞的比例。

    1.9 GnT Ⅰ、α-Man Ⅱ和GnT Ⅱ酶轉(zhuǎn)錄水平檢測

    將批次補(bǔ)料培養(yǎng)收獲日細(xì)胞液300×g 離心5 min,收集細(xì)胞,-80 ℃凍存。由上海藥明生物技術(shù)有限公司蛋白質(zhì)科學(xué)部支持,對GnT Ⅰ、α-Man Ⅱ和GnTⅡ三種糖苷酶進(jìn)行RT-RNA 檢測。

    1.10 cfDoE 方案與結(jié)果分析方法

    使用Minitab軟件設(shè)計兩因子兩水平的全析因?qū)嶒灒琾He的高低水平分別為7.35±0.05 和6.85±0.05,pCO2的高低水平分別為(130±10) mmHg和(30±10) mmHg,中心點重復(fù)兩次,詳細(xì)實驗方案如表1。實驗完成后依次將Man 5 比例、G0/G1 期細(xì)胞比例、GnT Ⅰ、α-Man Ⅱ和GnT Ⅱ三種糖苷酶轉(zhuǎn)錄水平作為響應(yīng)變量進(jìn)行統(tǒng)計分析,以P<0.05 為顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn),識別pHe、pCO2和pHe*pCO2交互作用對各響應(yīng)變量影響的顯著性。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 細(xì)胞生長結(jié)果

    本實驗的pH 和pCO2控制曲線如圖1(A)和圖1(B),從6 d 開始設(shè)置cfDoE 控制條件后,pH 和pCO2基本維持在目標(biāo)范圍。細(xì)胞生長結(jié)果如圖1(C)和圖1(D),各實驗條件的活細(xì)胞密度曲線基本可比,而細(xì)胞活率存在差異,其中低低水平組合(BR 1)的細(xì)胞活率下降最明顯,高高水平組合(BR 4)的細(xì)胞活率維持最高。本實驗的代謝結(jié)果如圖1(E),高高組合在7 ~9 d 乳酸濃度最高,隨后緩慢消耗。總體來看,高pCO2條件下有明顯后期堆積乳酸的趨勢,是一個不穩(wěn)定因素,而低pH 條件可以更好地穩(wěn)定乳酸代謝表現(xiàn)。

    圖1 細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果

    2.2 蛋白產(chǎn)量結(jié)果

    本實驗蛋白產(chǎn)量結(jié)果如圖2,從培養(yǎng)4 d 開始,發(fā)酵液中有少量產(chǎn)物蛋白產(chǎn)生,8 ~12 d 為產(chǎn)量快速增長時期,由此提示,外界環(huán)境對產(chǎn)物蛋白產(chǎn)生影響的關(guān)鍵時期為培養(yǎng)6 d 后,進(jìn)一步佐證了批次補(bǔ)料培養(yǎng)中將影響Man 5 的條件設(shè)置在降溫后的合理性。

    圖2 蛋白產(chǎn)量結(jié)果

    本實驗?zāi)康牡鞍桩a(chǎn)量的析因分析P值匯總?cè)绫?,從P值來看,各條件對蛋白產(chǎn)量無顯著性影響,因子效應(yīng)圖不再展示。此結(jié)果充分說明析因結(jié)果中的響應(yīng)效應(yīng)是由實驗設(shè)計因子引起,而非因子條件下蛋白產(chǎn)量降低所引起。

    表2 蛋白產(chǎn)量析因分析P 值匯總

    2.3 pHe 和pCO2 對Man 5 水平影響的析因分析

    pHe和pCO2對Man 5 水平影響的主效應(yīng)和交互效應(yīng)如圖3 和圖4 所示,對應(yīng)的效應(yīng)P值如表3 所示。從析因分析結(jié)果來看,從培養(yǎng)8 d 開始,pCO2即對Man 5 有顯著性負(fù)效應(yīng),該效應(yīng)一直維持至培養(yǎng)結(jié)束;pCO2對Man 5 產(chǎn)生顯著性影響的時間早,影響效果最顯著,是降低Man 5 修飾比例的關(guān)鍵因子。而pH 對Man 5 比例產(chǎn)生影響的時間較晚,從12 d 才開始表現(xiàn)正效應(yīng),影響效果相對輕微。兩者的交互作用也是從12 d 開始產(chǎn)生,呈微弱反向交互作用;在低pCO2情況下,pH 越低Man 5 修飾比例越低;在高pCO2情況下,pH 越高M(jìn)an 5 修飾比例越低。

    圖3 cfDoE 實驗設(shè)計主效應(yīng)圖

    圖4 cfDoE 實驗設(shè)計交互效應(yīng)圖

    表3 cfDoE 實驗Man 5 比例P 值匯總

    2.4 pHi 檢測結(jié)果

    本實驗的pHi檢測結(jié)果如圖5 所示,由于實驗數(shù)據(jù)較多,為方便比較,以中位熒光值代表pHi強(qiáng)度,采用熱圖對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,顏色越深代表中位熒光值越高,pHi越低;顏色越淺代表中位熒光值越低,pHi越高。

    圖5 cfDoE 實驗pHi 檢測結(jié)果

    從結(jié)果來看,條件添加后的pHi隨時間變化而變化,且與培養(yǎng)條件有一定相關(guān)性:在條件添加早期(培養(yǎng)8 d),pCO2越高,pHi酸化越明顯;但是隨著培養(yǎng)時間增加,pHi逐漸堿化,且初始酸化越明顯的條件,堿化越迅速,堿化強(qiáng)度也越大;而低pCO2組在條件添加早期酸化并不明顯,但是隨著培養(yǎng)時間增加,pHi逐步酸化。這一現(xiàn)象與高pCO2降低Man 5 比例效應(yīng)時間早、效果強(qiáng),而HCl 控制的低pH 降低Man 5 比例的效應(yīng)時間晚、效果相對較弱有一定對應(yīng)關(guān)系。

    以上現(xiàn)象說明高pCO2和低pH 兩個因素均能酸化胞內(nèi)pH,兩者的作用方式存在差異:(1)無論pH高低,由于CO2的可透膜性,高pCO2條件均可快速酸化生物膜內(nèi)環(huán)境,胞質(zhì)pH 在被酸化后,細(xì)胞啟動內(nèi)環(huán)境調(diào)節(jié)系統(tǒng),從而呈現(xiàn)了后期的堿化現(xiàn)象;(2)而低pCO2下的低pH 條件可能是由于細(xì)胞長期處于低pH 環(huán)境中,緩慢滲透適應(yīng),使得胞內(nèi)pH 逐步降低。由此猜測,以上兩種酸化方式導(dǎo)致胞內(nèi)不同細(xì)胞器所處的環(huán)境有所差異,從而表現(xiàn)出不同的代謝和糖基化現(xiàn)象。在高pCO2條件下,大量的CO2不僅可以跨過細(xì)胞膜,還可以穿透細(xì)胞器膜[7],從而影響各細(xì)胞器的功能,線粒體因為過度酸化而功能受損,乳酸代謝因此異常,而高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能由于酸化環(huán)境得到保護(hù)和維持,有利于蛋白的翻譯后修飾,Man 5比例因此而降低;而在低pCO2低pHe條件下,通過細(xì)胞膜上離子通道對H+的轉(zhuǎn)運調(diào)節(jié)僅能影響胞質(zhì)pH,其他細(xì)胞器不易受到影響,所以該條件下的細(xì)胞代謝穩(wěn)定,Man 5 修飾水平降低不明顯。

    由此可見,pHi越早酸化,且酸化程度高時,糖蛋白從被表達(dá)開始就能被充分糖基化修飾,Man 5 修飾水平則可以維持在較低水平。

    2.5 細(xì)胞周期檢測結(jié)果

    培養(yǎng)結(jié)束時G0/G1 期細(xì)胞比例的因子效應(yīng)圖如圖6 所示,pHe的影響P值為0.086,pCO2的影響P值為0.046,此時G0/G1 期細(xì)胞比例與pCO2水平有明顯正相關(guān)性,即pCO2水平越高,G0/G1 期細(xì)胞比例越高。當(dāng)細(xì)胞處于不同的周期時,其生命活動形式有所差異,G0/G1 期的細(xì)胞為下一次分裂繁殖做準(zhǔn)備,會大量合成蛋白質(zhì),產(chǎn)物蛋白也在這一時期被表達(dá)修飾,當(dāng)G0/G1 期細(xì)胞占比更大時,說明承擔(dān)蛋白質(zhì)表達(dá)修飾的載體工具較多,蛋白翻譯后修飾越充分,這也許也是高pCO2條件下Man 5 比例低的原因之一。

    圖6 cfDoE 實驗G0/G1 期細(xì)胞比例效應(yīng)圖

    2.6 關(guān)鍵糖苷酶轉(zhuǎn)錄水平檢測結(jié)果

    培養(yǎng)結(jié)束時GnT Ⅰ、α-Man Ⅱ和GnT Ⅱ三種酶轉(zhuǎn)錄水平的因子效應(yīng)圖如圖7 所示。pHe對以上三者的影響P值分別為0.745、0.557 和0.827,pCO2對以上三者的影響P值分別為0.402、0.323 和0.202,說明pHe和pCO2對三種糖苷酶轉(zhuǎn)錄水平無顯著性影響,由此可見各條件未對細(xì)胞的糖苷酶表達(dá)量水平產(chǎn)生實際影響,Man 5 水平的改變更有可能是高爾基體中糖苷酶所處pH 環(huán)境改變后,酶活性改變引起的。這也側(cè)面印證了pHi是影響糖基化修飾水平的關(guān)鍵因素。

    圖7 cfDoE 實驗糖苷酶轉(zhuǎn)錄水平主效應(yīng)圖

    2.7 討論

    兩因素兩水平的析因?qū)嶒灲Y(jié)果確定了降低Man 5修飾比例的主要因素是高pCO2,pHe以及pHe和pCO2的交互作用為次要因素。主因子和交互因子對蛋白產(chǎn)量均無統(tǒng)計學(xué)意義上的顯著性影響,可以排除蛋白產(chǎn)量對Man 5 比例的影響,進(jìn)一步確認(rèn)了因子效應(yīng)的有效性。在乳酸代謝方面,僅低pCO2低pHe條件有穩(wěn)定的代謝表現(xiàn),所有高pCO2條件均有乳酸代謝異常的風(fēng)險,而中心點水平的pCO2(80 mmHg)乳酸代謝正常,這為高pCO2應(yīng)用在降Man 5 時的參數(shù)范圍提供參考。在降低Man 5 比例的機(jī)理研究方面,pHi和G0/G1期細(xì)胞比例均與效應(yīng)因子呈一定相關(guān)性,其中高pCO2降低Man 5 的主要原因可能有兩方面:(1)可能是由于大量CO2快速透膜酸化胞質(zhì)pH 環(huán)境,穩(wěn)定了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體的低pH 狀態(tài),為糖基化修飾提供了安全穩(wěn)定的場所;(2)可能是由于高pCO2環(huán)境下,G0/G1 期細(xì)胞比例上升,糖基化修飾場所增加,糖蛋白的糖基修飾更充分。此外,研究條件下三個糖苷酶轉(zhuǎn)錄水平在效應(yīng)因子作用下無顯著性變化。

    綜合來看,高pCO2是降低Man 5 的關(guān)鍵因素,也是引起細(xì)胞培養(yǎng)乳酸代謝異常的風(fēng)險因素,低pHe一定程度上也能降低Man 5 比例,雖然效果不及高pCO2,但是能很好地控制乳酸代謝,穩(wěn)定細(xì)胞培養(yǎng)表現(xiàn)。

    3 結(jié)論

    對于培養(yǎng)pH 影響Man 5 修飾水平方面,前人的研究僅停留在pH 一個方面,忽略了pH 變化所引起的pCO2改變對Man 5 的影響,從而有相互沖突的研究結(jié)論,對降低Man 5 修飾水平的工藝策略制定存在一定誤導(dǎo)性。本研究對培養(yǎng)pH 和培養(yǎng)pCO2進(jìn)行分別控制,通過全因子設(shè)計的研究方法,全面評估了pH(6.85 ~7.35)和pCO2(30 ~130 mmHg)對Man 5 的影響,確認(rèn)了影響Man 5 修飾水平的主要因素是pCO2;同時,pHi、G0/G1 期細(xì)胞比例和GnT Ⅰ、α-Man Ⅱ和GnT Ⅱ酶轉(zhuǎn)錄水平檢測結(jié)果進(jìn)一步揭示了pCO2引起Man 5 水平變化的真相。本研究為降低Man 5 修飾水平提供了新的思路,也加深了細(xì)胞培養(yǎng)工藝參數(shù)對抗體Man 5 修飾水平影響的認(rèn)識。

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