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    基于三聯(lián)體和金門克隆的快速TALE 模塊組裝技術(shù)

    2023-12-18 13:08:58周繼曾楊洋鹿璇李雙鵬鄒慶劍張焜
    生物化工 2023年5期
    關(guān)鍵詞:克隆技術(shù)菌液靶向

    周繼曾,楊洋,鹿璇,李雙鵬,鄒慶劍,張焜,*

    (1.廣東工業(yè)大學(xué) 生物醫(yī)藥學(xué)院,廣東廣州 510530;2.五邑大學(xué) 生物科技與大健康學(xué)院,廣東江門 529020)

    轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物(Transcription Activator-Like Effector,TALE)是一種能識(shí)別特定DNA 序列的蛋白,最早由科學(xué)家在植物病原菌黃單胞菌(Xanthomonas)中發(fā)現(xiàn),其天然功能是直接調(diào)節(jié)宿主基因表達(dá)。在通過(guò)細(xì)菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)侵染進(jìn)入宿主細(xì)胞后,TALE 進(jìn)入細(xì)胞核,與宿主基因啟動(dòng)子中的效應(yīng)器特異性序列結(jié)合并激活轉(zhuǎn)錄[1]。TALE 主要由N 端、C 端和中間的DNA 結(jié)合域(DNA Binding Domain,DBD)三部分組成。DNA 結(jié)合域由含34 個(gè)氨基酸(Amino Acid,AA)重復(fù)序列串聯(lián)組成,每段重復(fù)序列模塊的第12 和13 位氨基酸為重復(fù)可變二殘基(Repeat Variable Di-residues,RVD),其中4 種常見(jiàn)的RVD 是NI、NG、HD 和NN,分別識(shí)別核苷酸A、T、C 和G[2]。與CRISPR/Cas9 系統(tǒng)相比,TALE具有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。例如,TALE 可以靈活地融合各種蛋白,如與核酸內(nèi)切酶Fok Ⅰ融合靶向目標(biāo)序列進(jìn)行DNA 雙鏈切割[3]、與轉(zhuǎn)錄調(diào)控域融合進(jìn)行基因激活[4],以及與核酸酶或脫氨酶融合實(shí)現(xiàn)CRISPR/Cas9 系統(tǒng)難以完成的線粒體基因組編輯,作為線粒體疾病治療的潛在工具[5-8]。此外,TALE 核酸酶(TALENs)的識(shí)別范圍為10 ~31 個(gè)堿基對(duì)(bp),具有脫靶風(fēng)險(xiǎn)低的優(yōu)勢(shì)[9-10],比CRISPR/Cas9 系統(tǒng)更適用于臨床應(yīng)用。然而,目前常用的TALE 組裝方法,如金門(Golden Gate)克隆技術(shù)[11]、solid-phase 克隆技術(shù)[12]和 Gibson克隆技術(shù)[13]等都存在組裝時(shí)間長(zhǎng)、高成本、難操作的問(wèn)題,限制了TALE 工具在基因打靶中的應(yīng)用。

    筆者開(kāi)發(fā)了一種由Cas9/sgRNA 和TALE 組成的雙導(dǎo)航系統(tǒng)的新型單堿基編輯器——TaC9-BE[14-15],它不僅能在不產(chǎn)生DNA 雙鏈切割的情況下在靶位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)高效的堿基C-T 或A-G 替換,而且沒(méi)有可預(yù)測(cè)DNA 脫靶效應(yīng),為基因治療和轉(zhuǎn)基因生物的產(chǎn)生提供了一種安全的工具。然而,TALE 構(gòu)建的復(fù)雜性成為TaC9-BE 應(yīng)用的主要障礙。本研究通過(guò)新開(kāi)發(fā)的TALE 三聯(lián)體結(jié)合金門克隆技術(shù)建立一種新的TALE 構(gòu)建技術(shù)——Trimer-Golden Gate(Tri-GG),該方法可高效、快速、簡(jiǎn)易地組裝TALE,為TaC9-BE系統(tǒng)提供了便捷的TALE 服務(wù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 質(zhì)粒與細(xì)胞

    質(zhì)粒EFS-ABE8EdelR153-TALE-EGFP(LacZ)和EFS-YE1-TALE-EGFP(LacZ)、nCas9-mCherry、UGI-nCas9-UGI-mCherry、gRNA 骨架載體、TALE三聯(lián)體庫(kù)等,均由五邑大學(xué)鄒慶劍課題組實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建,并存于-20 ℃冰箱;大腸桿菌(Escherichiacoli)感受態(tài)細(xì)胞DH5α 菌株和實(shí)驗(yàn)所需所有引物,均購(gòu)于廣州艾基生物技術(shù)有限公司;HEK293T 細(xì)胞,購(gòu)自美國(guó)ATCC 生物生物標(biāo)準(zhǔn)品資源中心。

    1.1.2 試劑

    DNA marker,日本Takara Bio 公司;Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶(Esp3I 和BbsI)、高糖培養(yǎng)基,美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司;T4 DNA 連接酶,美國(guó)New England Biolabs 公司;PCR 酶和質(zhì)粒提取試劑盒,南京諾唯贊生物科技股份有限公司;轉(zhuǎn)染試劑lipo 8000,上海碧云天生物技術(shù)有限公司;TE 緩沖液(Tris-EDTA)、0.5% NP-40、10 μg/mL 蛋白酶K,德國(guó)Merck 公司;10%胎牛血清,美國(guó)Cytiva 公司;1%胰蛋白胨、0.5%酵母粉(Gene Star),青島金斯達(dá)生物技術(shù)有限公司;1%氯化鈉,天津市大茂化學(xué)試劑廠。

    1.1.3 儀器

    LHG-3_G-F8 生物安全柜,新加坡Esco 公司;HERA cell 150i1 型細(xì)胞培養(yǎng)箱,美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司;OK-8D 三孔水浴鍋,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;IX73 熒光倒置顯微鏡,日本奧林巴斯公司;DYY-6C DNA 凝膠電泳儀,北京六一生物科技有限公司;2FD 超凈工作臺(tái),瑞智精密股份有限公司;T100 PCR 儀,美國(guó)Bio-Rad 公司;LRH-70 生化培養(yǎng)箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司。5425R 常溫離心機(jī),德國(guó)Eppendorf 公司;3000 超微量分光光度計(jì),美國(guó)Nanodrop 公司;1600 凝膠成像儀,上海天能生命科學(xué)有限公司;MoFlo? XDP 流式分選儀,美國(guó)Beckman Coulter 公司。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 TALE 的構(gòu)建

    TALE 三聯(lián)體由非重復(fù)的306 bp DNA 序列組成,其表達(dá)產(chǎn)物為3 個(gè)RVD 重復(fù)單元,可結(jié)合任意3 個(gè)連續(xù)DNA 核苷酸序列,如圖1(a)所示。以TALE三聯(lián)體為模板,設(shè)計(jì)具有特定末端序列的引物,通過(guò)PCR 擴(kuò)增出三聯(lián)體片段中末端具有Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶(Esp3I)的識(shí)別序列。不同引物對(duì)擴(kuò)增出的片段,經(jīng)酶切后產(chǎn)生突出末端可以按順序首尾互補(bǔ)配對(duì),如圖1(b)和表1 所示。三聯(lián)體擴(kuò)增體系:反應(yīng)總體系為20 μL,其中2×Phanta Max Master mix為10 μL,擴(kuò)增三聯(lián)體兩條引物(10 μmol/L)分別加0.5 μL,三聯(lián)體模板取10 ng,補(bǔ)充dd H2O 至20 μL。三聯(lián)體PCR 擴(kuò)增程序:98 ℃預(yù)變性1 min, 98℃變性10 s、60℃退火10 s、72 ℃延伸10 s,循環(huán)30 次。擴(kuò)增片段膠回收純化后,與TALE 骨架載體混合,反應(yīng)體系為1 μL 連接緩沖液,Esp3I 和T4 連接酶各0.5 μL,混合PCR 產(chǎn)物100 ng,TALE 骨架載體60 ng,加ddH2O 補(bǔ)充至總體系10 μL。反應(yīng)程序?yàn)?7 ℃酶切5 min 和16 ℃連接5 min,循環(huán)10 次,最終實(shí)現(xiàn)在一個(gè)反應(yīng)體系中實(shí)現(xiàn)多片段的有序連接,完成TALE模塊組裝,如圖1(c)所示。

    表1 三聯(lián)體擴(kuò)增引物序列

    圖1 簡(jiǎn)并密碼三聯(lián)體金門法組裝TALE 的流程

    1.2.2 菌液PCR 鑒定及測(cè)序鑒定

    將金門克隆反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)化,冰浴30 min 后放入42 ℃水浴熱激1 min后,繼續(xù)冰浴3 min。最后加入含有X-Gal(200 μg/mL)和IPTG(1 mmol/L)的LB 平板上,放置37 ℃培養(yǎng)箱中12 h。第二天,觀察平板菌落,挑取白色單菌落,加入含氨芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)基中,37 ℃搖菌8 h。取10 μL 菌液高溫裂解后,用作PCR 鑒定的擴(kuò)增模板。PCR 鑒定引物序列如下,CEXU-F:A A C G T G G C G G C G T G A C C G C A;C E X U-R:GGTGGTCGTTGGTCAACGCGG。 菌液PCR 體系:2×Rapid Taq Master Mix 5 μL,兩引物(10 μmol/L)各0.5 μL,裂解后的菌液0.5 μL,補(bǔ)充ddH2O 至總體系10 μL。PCR 擴(kuò)增程序:98 ℃預(yù)變性1 min,98 ℃變性10 s、55 ℃退火10 s、72 ℃延伸20 s,循環(huán)30 次。PCR 產(chǎn)物凝膠電泳,初步鑒定正確的菌液樣品,然后測(cè)序進(jìn)一步驗(yàn)證載體序列是否正確。引物為CEXU-F和CEXU-FR。測(cè)序正確的TALE 載體用于后續(xù)細(xì)胞水平的功能性測(cè)試。

    1.2.3 gRNA 載體的構(gòu)建

    根據(jù)5 個(gè)靶位點(diǎn)序列合成sgRNA 寡核苷酸鏈,將100 μmol/L 的正鏈和反鏈各取1 μL 混合,加ddH2O至20 μL,進(jìn)行退火。退火程序:95 ℃孵育10 min后以0.1 ℃/s 的速度降低樣品溫度,直到16 ℃。退火后,與線性化gRNA 骨架載體(BbsI 酶切)混合,配制連接反應(yīng)體系:連接緩沖液1 μL,T4 連接酶0.5 μL,退火產(chǎn)物5 μL,gRNA 骨架載體100 ng,加ddH2O 補(bǔ)充至10 μL,16 ℃孵育1 h。反應(yīng)完成后,加入DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化過(guò)程同1.2.2步驟。最后提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定,測(cè)序正確的樣品用于后續(xù)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。sgRNA 的引物名稱和序列見(jiàn)表2。

    表2 sgRNA 引物序列

    1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和流式分選

    用lipo8000 轉(zhuǎn)染試劑將gRNA、TALE-EGFP和nCas9-mCherry 表達(dá)質(zhì)粒按1 ∶1 ∶2 的比例共轉(zhuǎn)染到293T 細(xì)胞中,同時(shí)將gRNA 和ABE8EdelR153-mCherry 或YE1-BE4max-mCherry 作為對(duì)照共轉(zhuǎn)染到293T 細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h 后,細(xì)胞通過(guò)流式分選儀進(jìn)行分選收集帶紅色熒光和綠色熒光的細(xì)胞。

    1.2.5 PCR 擴(kuò)增和測(cè)序

    將分選的細(xì)胞樣品離心收集后,加入10 μL 的NP40/蛋白酶K 裂解液,裂解程序?yàn)?6 ℃裂解1 h,95 ℃處理10 min 使酶失活。裂解產(chǎn)物作為PCR 鑒定的模板。PCR 反應(yīng)體系:2×PhantaMax Master mix 10 μL,靶位點(diǎn)上下游引物(10 μmol/L)2 μL,細(xì)胞裂解物2 μL,ddH2O 補(bǔ)充至20 μL。PCR 擴(kuò)增程序同1.2.1 步驟。收集PCR 產(chǎn)物,通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳及膠回收純化目標(biāo)條帶。最后將目標(biāo)產(chǎn)物送金維智公司進(jìn)行一代測(cè)序。目的條帶的擴(kuò)增引物序列見(jiàn)表3。測(cè)序結(jié)果通過(guò)EditR(https://moriaritylab.shinyapps.io/editr_v10/)分析,并用GraphPad Prism8 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

    表3 靶位點(diǎn)及其擴(kuò)增引物序列

    2 結(jié)果與分析

    2.1 TALE 的構(gòu)建

    常用的TALE 靶序列長(zhǎng)度為13 ~18 bp,筆者構(gòu)建的TALE靶向AAVS1 site位點(diǎn)序列為GGGTACTTTTATC(13 bp),以GGG TAC TTT TAT CNN 對(duì)應(yīng)的三聯(lián)體為模板,分別用引物對(duì)1F+1R、2F+2R、3F+3R、4F+4R、5F+R+1 擴(kuò)增出5 個(gè)三聯(lián)體片段,其中1 ~4 的片段大小為306 bp,5 的片段大小為102 bp。TALE 靶向ABE site2、ABE site1、HEK site 和RNF site 的靶序列分別為14 bp、16 bp、17 bp 和18 bp。同理,分別按順序每3 個(gè)核苷酸對(duì)應(yīng)的三聯(lián)體為模板,每個(gè)模板按順序用相應(yīng)的引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物PCR 凝膠電泳圖見(jiàn)圖2(a)。

    圖2 擴(kuò)增TALE 三聯(lián)體片段及連接轉(zhuǎn)化

    PCR 產(chǎn)物回收后,與TALE 骨架載體通過(guò)金門克隆技術(shù)快速組裝。轉(zhuǎn)化后在通過(guò)藍(lán)白斑篩選平板中長(zhǎng)出的單菌落均為白斑[圖2(b)],說(shuō)明載體連接效率高,沒(méi)有原載體轉(zhuǎn)化克隆。對(duì)白色菌落進(jìn)行PCR鑒定。由于TALE 模塊的序列的重復(fù)性,具有正確模板的PCR 產(chǎn)物在凝膠電泳上形成了一系列DNA 階梯帶(約300 bp 間隔)。

    5 個(gè)TALE 載體構(gòu)建的電泳條帶正確率平均超過(guò)50%(AAVS1 site TALE 7/10、ABE site1 TALE 4/10、ABE site2 TALE 5/10、HEK site TALE 5/10、RNF site TALE 6/10),如圖3(a)所示。經(jīng)進(jìn)一步測(cè)序比對(duì),證實(shí)PCR 條帶為大小正確的載體。經(jīng)測(cè)序比對(duì),發(fā)現(xiàn)其中有約40%與預(yù)計(jì)序列完全相同[圖3(b)],為成功構(gòu)建的TALE 載體。

    圖3 菌液PCR 鑒定及測(cè)序統(tǒng)計(jì)

    2.2 通過(guò)細(xì)胞基因編輯驗(yàn)證Tri-GG TALE 的功能

    TaC9-BE 編輯系統(tǒng)為雙向?qū)Щ蚓庉嬈鳎瑑蓚€(gè)向?qū)Х謩e為sgRNA 和TALE。5 個(gè)TALE 載體已經(jīng)成功構(gòu)建的前提下,根據(jù)其識(shí)別序列的上游6 ~10 bp 處設(shè)計(jì)sgRNA靶向位點(diǎn)。gRNA和TALE識(shí)別序列見(jiàn)表4。經(jīng)測(cè)序,5 個(gè)位點(diǎn)的gRNA 載體成功構(gòu)建。

    表4 基因位點(diǎn)的gRNA 和TALE 識(shí)別序列

    在成功構(gòu)建TALE 和sgRNA 載體的基礎(chǔ)上,將TALE 與脫氨酶TADA8EdelR153融合,與nCas9/gRNA組成TaC9-ABEdelR153編輯系統(tǒng),如圖4(a)所示;同理,TALE 與YE1 融合,與UGI-nCas9-UGI/gRNA 組成TaC9-CBEYE1編輯系統(tǒng),如圖4(b)所示。TaC9-ABEdelR153和TaC9-CBEYE1載體系統(tǒng)分別轉(zhuǎn)染試劑到HEK293T 細(xì)胞。收集細(xì)胞對(duì)目標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序證實(shí),TaC9-ABEdelR153能在五個(gè)位點(diǎn)都具有高效A 到G 的單堿基轉(zhuǎn)換,同樣,TaC9-CBEYE1能在5 個(gè)位點(diǎn)也具有高效C 到T 的單堿基轉(zhuǎn)換效率,如圖4(c)所示。經(jīng)統(tǒng)計(jì),在所有5 個(gè)位點(diǎn)的編輯TaC9-BE 編輯系統(tǒng)與常規(guī)胞苷或腺苷單堿基編輯系統(tǒng)具有相同的編輯能力,如圖4(d)和圖4(e)所示,說(shuō)明用Tri-GG 克隆技術(shù)構(gòu)建的TALE,具有高效靶向DNA 結(jié)合能力,有效應(yīng)用于基因編輯。

    圖4 TaC9-BE 系統(tǒng)的示意圖和在5 個(gè)基因位點(diǎn)上的編輯效率

    3 討論

    TALE 一直作為一項(xiàng)強(qiáng)大的DNA 靶向工具被廣泛使用,但由于構(gòu)建方法較為復(fù)雜、成本高、耗時(shí)長(zhǎng)等限制,其近年來(lái)被CRISPR/Cas9 系統(tǒng)所替代。由于TALE 自身獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),最近被用于消除可預(yù)測(cè)的脫靶效應(yīng)的TaC9-BE 系統(tǒng)和線粒體單堿基編輯中。通過(guò)傳統(tǒng)的Golden Gate 克隆技術(shù)組裝TALE 需要分兩步進(jìn)行組裝,復(fù)雜且耗時(shí)長(zhǎng)。本研究通過(guò)TALE 三聯(lián)體庫(kù)結(jié)合Golden Gate 組成的新的克隆技術(shù)Tri-GG,具有易操作、低成本且僅需一步反應(yīng)即可組裝TALE的優(yōu)勢(shì),且能保證TALE 靶向DNA 的功能性。

    在用Tri-GG 法構(gòu)建TALE 識(shí)別序列為13 bp、16 bp 時(shí),擴(kuò)增的最后一個(gè)三聯(lián)體是單個(gè)TALE 模塊,由于條帶較小導(dǎo)致回收濃度較低。因此,建議在設(shè)計(jì)TALE 識(shí)別序列長(zhǎng)度時(shí),盡量選擇3 的整數(shù)倍。在菌液PCR 鑒定正確而一代測(cè)序結(jié)果出現(xiàn)點(diǎn)突變時(shí),可嘗試更換高保真的PCR 酶或連接酶來(lái)提高正確率。對(duì)于構(gòu)建識(shí)別序列長(zhǎng)度超過(guò)18 bp 的TALE 時(shí),建議擴(kuò)大連接反應(yīng)的循環(huán)數(shù)。

    4 結(jié)論

    本研究通過(guò)TALE 三聯(lián)體結(jié)合金門克隆技術(shù)建立一種新的TALE 構(gòu)建技術(shù)——Tri-GG,成功構(gòu)建了5 個(gè)位點(diǎn)的TALE 載體。將TALE 與脫氨酶融合后,與nCas9/gRNA 組成Tac9-BE 系統(tǒng),在293T 細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了高效的單堿基編輯。本技術(shù)為TALE 的構(gòu)建和應(yīng)用提供了一個(gè)新的簡(jiǎn)單快速的方法。

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