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    MOFs 仿生酶傳感器構筑及對肌氨酸的高靈敏檢測

    2023-12-18 13:08:56吳瑋軒楊欣趙鐘興
    生物化工 2023年5期
    關鍵詞:底物電化學電極

    吳瑋軒,楊欣,趙鐘興

    (廣西大學 化學化工學院,廣西南寧 530004)

    前列腺癌作為一種常見的惡性腫瘤嚴重危害人體的健康,其早期的診斷技術以篩查重要的腫瘤標志物為主[1-3]。目前最常用的前列腺腫瘤標志物為前列腺特異性抗原(PSA)和肌氨酸(Sar),PSA 并非前列腺癌的特異性抗原,以PSA 作為標志物對前列腺癌的檢測常常出現(xiàn)假陰性和假陽性的情況[4-7]。近年來對Sar 的研究發(fā)現(xiàn),Sar 在血液和尿液中的濃度與前列腺癌關系密切,是更理想的前列腺腫瘤標志物,如何快速、靈敏、低成本檢測Sar 的濃度對前列腺癌的早期診斷至關重要[8]。

    金屬-有機框架材料(Metal-Organic Frameworks,MOFs)是由金屬離子或金屬簇與有機配體,通過配位鍵自組裝形成的,具有獨特孔道結構的多孔結晶材料[9]。由于其獨特的孔結構、良好的穩(wěn)定性以及特殊的催化位點,MOFs 材料在納米酶傳感器方面獲得廣泛關注[10-12]。設計新型MOFs 納米酶傳感器并探究其實際應用仍是當下研究的熱點。ZHAO 等[13]利用鐵基金屬有機框架(NH2-MIL88B(Fe),NM88B)作為過氧化氫酶納米酶,將H2O2催化生成·OH,進而將3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)氧化為藍色的TMBox。當通過NM88B 對多巴胺分子(DA)進行檢測時,DA 消耗·OH 從而抑制氧化反應,導致藍色的TMBox 消失,并且DA 還可以通過電子轉移的方式將NM88B 的藍色熒光猝滅。因此,可以利用NM88B比色和熒光雙模式檢測DA,在實際樣品檢測中也具有較好的檢測效果,表明該MOFs 納米酶具有良好的實際應用價值。YANG 等[14]將鈷基金屬有機框架(ZIF-67)作為人工納米酶平臺電沉積到阿霉素硼納米片(BNSs-DOX)上,制備得到UOx@MOF/BNSs-DOX 納米電化學傳感器,用于尿酸(UA)的酶促和電化學檢測,納米酶的高效負載使UA 檢測下限可達0.025 μmol/L。因此,構筑具有良好催化活性的納米酶,并將其應用于生物傳感器是一個有實際價值的研究方向。

    本論文基于Sar 的酶級聯(lián)反應,提出復合仿生酶級聯(lián)的策略,設計出NH2-MIL88B(Fe)/ 核黃素(NM88B/Rf)電化學傳感器以促進催化H2O2的產生,并將級聯(lián)信號放大(從H2O2到·OH),來實現(xiàn)對Sar的高靈敏檢測。

    1 材料與方法

    1.1 試劑與儀器

    核黃素(Rf)、肌氨酸、六水合氯化鐵、2-氨基對苯二甲酸、氫氧化鈉,分析純,上海麥克林生化科技有限公司;N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、丙酮,分析純,天津市科密歐化學試劑有限公司;磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉,分析純,上海阿拉丁生化科技有限公司;無水乙醇,分析純,四川西隴科學股份有限公司;甲基藍(MB),98.5%,廣東光華科技有限公司。

    ME204E 型電子天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;DHG-9076A 型電熱恒溫鼓風干燥箱,上海精宏實驗設備有限公司;DZF-6051 型真空干燥箱,上海齊欣科學儀器有限公司;1702742S型超聲波清洗機,南京先歐儀器制造有限公司;01301T08913 型超薄磁力攪拌器,上海泰坦科技股份有限公司;PHS-3C 型pH 計,上海雷磁儀器有限公司;SU8020 型高分辨場發(fā)射掃描電鏡,日本日立公司;SMATLAB3KW 型X-射線衍射儀,日本理學株式會社;TU-1901 型紫外-可見分光光度計,深圳市億鑫儀器設備有限公司;PARSTAT 4000+型電化學工作站,美國阿美特克集團公司。

    1.2 NM88B 的制備

    分別稱量270 mg(1 mmol)FeCl3·6H2O 和181 mg(1 mmol)2-氨基對苯二甲酸于反應釜中,加入5 mL 的DMF,400 r/min 攪拌30 min;再加入0.4 mL氫氧化鈉溶液(2 mol/L),400 r/min 攪拌30 min;使用真空干燥箱在100 ℃下干燥12 h 可得到深褐色固體粉末狀材料。

    1.3 改性電極的制備

    在改性電極之前,使用0.30 μm 氧化鋁粉末拋光玻碳電極(GCE,d=5 mm),再使用蒸餾水洗滌GCE,洗滌后的GCE 放置在室溫下干燥。在改性電極時,將1.5 mg 的樣品NM88B 分散在1 mL 超純水中,于室溫下40 kHz 水浴超聲處理5 min 后形成均勻懸浮液,再將20 μL 的懸浮液滴涂在GCE 上并在紅外線燈的照射下干燥,得到改性電極NM88B/GCE。

    1.4 肌氨酸傳感器的制備

    將改性電極NM88B/GCE 放入1 100 mL 的核黃素水溶液中(1 mmol/L),在電化學工作站的STEP 模式下設置-0.6 V 電壓,時間90 s 的條件下電沉積,再將電極取出,使用超純水清洗電極表面1 次。室溫干燥后即得NM88B/Rf/GCE。

    1.5 NM88B 結構表征

    掃描電子顯微鏡(SEM):將微量NM88B 固定于樣品臺上,在10 kV 電壓下放大50 倍圖像即可觀察NM88B 的形貌。

    X 射線晶體衍射(XRD):將2 mg NM88B 壓制于顯微鏡載片上,于室溫下進行測量。

    1.6 NM88B 電化學表征

    實驗采用三電極體系。循環(huán)伏安法(CV)的掃描電位范圍為-0.4 ~0.6 V,掃描速度為50 mV。電化學阻抗譜(EIS)掃描頻率為0.1 ~105 Hz;實驗溫度為室溫。

    1.7 NM88B 的類酶催化

    分 別 將20 μL 的NM88B(1 mg/mL)、TMB(0.5 mmol/L)與不同濃度H2O2底物(0.4 mmol/L、0.8 mmol/L、1.2 mmol/L、1.6 mmol/L、2.4 mmol/L 和2.8 mmol/L)進行穩(wěn)態(tài)動力學實驗;保持NM88B 添加量(20 μL,1 mg/mL)和H2O2濃度(30 mmol/L)不變,改變TMB底物濃度(0.4 mmol/L、0.8 mmol/L、1.2 mmol/L、1.6 mmol/L、2.4 mmol/L 和2.8 mmol/L)進行穩(wěn)態(tài)動力學實驗。動力學數(shù)據(jù)可根據(jù)Michaelis-Menten 方程計算,見式(1):

    式中,Km為米氏常數(shù),mmol/L;Vmax為酶被底物飽和時的反應速度,μmol/(L·min);S為底物濃度,mmol/L;V為反應速率,μmol/(L·min)。

    1.8 傳感器對Sar 的定量檢測

    在PBS 緩沖液pH=7.5、NM88B 滴涂量為1.5 mg/mL、Rf 電沉積時間為90 s 的條件下進行Sar 的定量檢測實驗。加入500 μmol/L MB 參與級聯(lián)反應的催化中間體時,在-0.28 V 時出現(xiàn)明顯增加的電信號,因此采用信號增強的方式分析Sar 的濃度。

    1.9 傳感器的選擇性和時間穩(wěn)定性

    傳感器選擇性:將100 μmol/L 的絲氨酸(Ser)、葡萄糖(Glu)、賴氨酸(Lys)、半胱氨酸(Cys)、氯化鉀(KCl)和氯化鈉(NaCl)分別加入含有MB 的溶液中進行抗干擾檢測,其余實驗條件及步驟與Sar 定量檢測相同。

    傳感器時間穩(wěn)定性:同時制備3 個相同的NM88B/Rf/GCE 傳感器,分別在-4 ℃下儲存1 d 和7 d,在包含1.0 μmol/L Sar 的0.1 mol/L PBS 緩沖液(pH=6.5)中進行實驗。

    2 結果與分析

    2.1 NM88B 的結構表征

    從圖1(b)中可看到,通過溶劑熱法所制備的NM88B 材料顆粒大小和尺寸較均勻,平均尺寸約為500 nm,晶體結構規(guī)整,表面光滑,呈現(xiàn)出紡錘形結構,與文獻報道一致[15]。圖1(a)為溶劑熱法合成NM88B 的XRD 譜圖,在2θ=9.2°、10.3°、13.1°、16.7°、18.5°、20.7°和29.5°出現(xiàn)衍射峰,分別對應(002)、(101)、(102)、(103)、(200)、(202) 和(302)晶面。衍射峰與晶體學信息文件(CCDC No. 647646)中建立的NM88B 結構模擬譜圖一致,說明NM88B 材料成功制備。

    圖1 NM88B 的結構表征結果

    2.2 電化學表征

    圖2 為在含有0.1 mmol/L KCl 的5 mmol/L [Fe(CN)6]3-/[Fe(CN)6]4-溶液下的CV 和EIS 曲線。從圖2(a)可知,裸電極具有較大的峰值電位分離(?EP=321.8 mV),對[Fe(CN)6]3-/4-探針具有較小的電流響應(Ipa=108.5 μA,Ipc=-121.3 μA);而NM88B/GCE 的響應電流明顯高于裸電極(Ipa=238.1 μA,Ipc=-256.7 μA),峰值電位明顯減?。?EP=133.2 mV),這主要是由于在電極上滴涂了大比表面積的NM88B,增大了電極的表面積,促進了電極的電子轉移。相比于NM88B/GCE,NM88B/Rf/GCE 傳感器的電位峰分離幾乎不變(?EP=135.9 mV),而其響應電流顯著減小(Ipca=158.6 μA,Ipc=-177.2 μA),這說明由電沉積將電子傳遞能力較弱的Rf 引入MOFs 骨架中,NM88B 孔道被部分阻塞導致氧化還原峰電流降低。

    圖2 裸電極、NM88B/GCE 以及NM88B/Rf/GCE 的電化學表征

    圖2(b)為1.0 ~100.0 kHz 的開路電位條件下測量所得EIS 譜,通過Zview 軟件對所得數(shù)據(jù)進行擬合,得到其阻抗參數(shù)。NM88B/GCE 和NM88B/Rf/GCE電荷轉移電阻(Rct)分別為169.5 Ω 和174.1 Ω,與NM88B/Rf/GCE 的Rct 相比,NM88B/Rf/GCE 的轉移電阻較大,這是因為在原材料上電沉積了電子傳遞能力較弱的Rf,這也側面說明了Rf 的成功負載。此外,EIS 擬合所得數(shù)據(jù)和CV 測試圖結果一致,再次說明了NM88B 的成功制備和Rf 的成功負載。

    2.3 NM88B 的類酶催化

    通過測定反應的表觀穩(wěn)態(tài)動力學參數(shù),進一步分析了NM88B 的類過氧化物酶活性,通過改變H2O2或TMB 的濃度,得出Michaelis-Menten 方程,并通過該方程斜率和截距計算出最大反應速度(Vmax)和米氏常數(shù)(Km)。已知,Km和Vmax是量化酶催化能力的兩個關鍵參數(shù),其中Km是酶對底物的親和力,Km值越小,酶對底物的親和力越高。從圖3 可知,H2O2為底物的Km值為1.02 mmol/L,以TMB 為底物的Km值為1.11 mmol/L。相較于類似實驗報道的辣根過氧化物酶(HRP)的Km值(H2O2和TMB 的Km分別為2.61 mmol/L 和0.53 mmol/L)[16],NM88B 以H2O2為底物的Km低于HRP,而以TMB 為底物的Km高于HRP,這說明NM88B 對H2O2的親和力大于HRP,對TMB 的親和力小于HRP。這是因為HRP 的活性中心只有一個Fe 離子,而NM88B 有多個Fe 離子,且材料的介孔結構有利于H2O2與Fe 離子的反應,同時也表明NM88B 具有良好的類過氧化氫酶催化活性。

    圖3 NM88B 模擬類過氧化氫酶穩(wěn)態(tài)動力學實驗

    2.4 NM88B/Rf/GCE 傳感器對Sar 的定量檢測

    如圖4 所示,·OH 的氧化峰電流隨著Sar 的濃度增加而增加,并在1 nmol/L ~10 mmol/L 的范圍內呈線性關系,線性方程為Ipa=3.18lgCSar+25.85(R2=0.999),檢出限(S/N=3)為0.43 nmol/L。從這些結果可以看出,NM88B/Rf/GCR 傳感器在MB 的存在下對Sar 的檢測具有高靈敏度和選擇性,其主要原因是NM88B 的結構有助于Rf 催化Sar 生成的H2O2立刻被NM88B 催化氧化成·OH,使酶級聯(lián)效應高效地發(fā)生。此外,和其他報道相比(表1),NM88B/Rf/GCR 傳感器對Sar 具有較低的檢出限和較寬的檢測范圍。

    表1 與不同修飾電極對Sar 的電化學檢測比較

    圖4 Sar 檢測標準曲線

    2.5 NM88B/Rf/GCE 傳感器的選擇性和時間穩(wěn)定性

    為了探究NM88B/Rf/GCE 對Sar 檢測的抗干擾能力,研究了幾種Sar 類似物存在下的DPV 曲線。如圖5所示,首先進行空白樣品(Blank)的測試,再加入其他干擾物不能引起氧化峰電流的顯著增加,其與空白值的相對誤差在±8%之間,說明NM88B/Rf/GCE 傳感器表現(xiàn)出優(yōu)異的抗干擾性。

    圖5 NM88B/Rf/GCE 傳感器的選擇性

    為了探究傳感器的時間穩(wěn)定性,對依次保存0 d、1 d 和7 d 的電極進行測試,三次實驗的電流響應值分別為27.68 μA、27.61 μA 和26.68μA,NM88B/Rf/GCE 傳感器對Sar 的響應沒有明顯下降,Sar 的電流響應值仍然保留在初始值的96.4%,表明NM88B/Rf/GCE 具有良好的穩(wěn)定性。

    3 結論

    本文通過溶劑熱法合成具有高比表面積、開放的活性金屬位點以及類過氧化物酶活性的NM88B材料,并將其與成本低、低毒性、穩(wěn)定性好的具有類肌氨酸氧化酶活性的Rf 通過氫鍵作用相結合,制備了能對前列腺癌標記物Sar 高靈敏檢測的電化學傳感器,并在檢測體系中加入能夠被·OH 氧化的MB 來增強電化學響應電流,結論如下:

    通過溶劑熱法合成NH2-MIL88B(Fe),其SEM 和XRD圖均與文獻報道一致,說明了合成方法的可行性。由穩(wěn)態(tài)動力學分析發(fā)現(xiàn)NM88B 具有類過氧化物酶活性,并且能將Rf 催化氧化Sar 生成的H2O2分解成·OH對MB 進行氧化,因此它可以作為電化學傳感器運用于Sar 的檢測。最后通過電化學工作站的CV、DPV技術對NM88B/Rf/GCE 進行電化學檢測,Sar 的檢測范圍為1 nmol/L~10 mmol/L,其檢出限為0.42 nmol/L。除此之外,在抗干擾性實驗中發(fā)現(xiàn)其他干擾物對傳感器的檢測影響相對誤差均小于±8%,-4 ℃保存一周后其電流響應值仍然保留在初始值的96.4%,說明了NM88B/Rf/GCE 傳感器穩(wěn)定性良好。

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