路路通益母膏質(zhì)量控制方法改進研究*

易燕群，黃煥靜，黃 相，童冰妮，麥志雄

（1.廣西梧州制藥（集團）股份有限公司，廣西 梧州 543000；2.廣西藥物提純工程技術(shù)研究中心，廣西 梧州 543000）

路路通益母膏為廣西梧州制藥（集團）股份有限公司的獨家生產(chǎn)品種，由人參、當歸、黃芪、麥冬、益母草、郁金、路路通、通草及麥芽9味藥材組成，具有補血養(yǎng)血、化瘀通絡的功效，用于婦女產(chǎn)后血虛血瘀所致的缺乳[1]?，F(xiàn)行標準建立了人參、麥冬、鹽酸水蘇堿、黃芪的鑒別及黃芪甲苷的含量測定方法；實際檢測過程發(fā)現(xiàn)麥冬鑒別展開劑含苯等高毒性試劑，鹽酸水蘇堿的薄層鑒別供試品溶液制備方法步驟多，做完1批鑒別需要2～3 d。黃芪甲苷含量檢驗所用方法偏差率高。故本研究針對以上問題進行探索，對麥冬、鹽酸水蘇堿、黃芪的鑒別及黃芪甲苷的含量測定方法進行了改進優(yōu)化，以便更好地對路路通益母膏進行質(zhì)量控制。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1260液相色譜儀，配備Agilent 1260 ELSD檢測器（美國Agilent公司）；XSE204電子分析天平（d=0.000 1 g）、XP56電子分析天平（d=0.001 mg）（梅特勒托利多公司）；KH-300PLUS全自動薄層色譜掃描儀（上海科哲生化科技有限公司）；Goodsee-20E薄層色譜成像系統(tǒng)（力揚企業(yè)有限公司）；HNY-500超聲波清洗機（廣州市華南超聲設備有限公司）。

1.2 材料 高效硅膠G板（規(guī)格：100 mm×100 mm，生產(chǎn)日期：2022年4月7日）購自青島海洋化工有限公司；薄層層析硅膠G（批號：02100328）購自青島海洋化工有限公司；D101大孔吸附樹脂購自西安藍曉科技新材料股份有限公司；強酸性陽離子交換樹脂（批號：Q164d1908010）購自廣西梧州制藥（集團）股份有限公司。乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑為分析純。麥冬對照藥材（批號：121013-201711）、黃芪對照藥材（批號：121462-201705）、黃芪甲苷對照品（批號：110781-202118，含量：96.8%）、鹽酸水蘇堿對照品（批號：110712-201916，含量：99.2%）均購于中國食品藥品檢定研究院；路路通益母膏（批號：220301，220501，220601）為廣西梧州制藥（集團）股份有限公司提供。路路通益母膏陰性對照品：路路通益母膏（缺麥冬）、路路通益母膏（缺黃芪）及路路通益母膏（缺益母草）均稱取處方藥材減去對應的藥材后按工藝制備而成。

2 方法與結(jié)果

2.1 麥冬鑒別

2.1.1 現(xiàn)行標準方法檢驗 取路路通益母膏（批號：220301，220501，220601）、麥冬對照藥材以及按處方及制法制成缺麥冬的陰性對照樣品，按現(xiàn)行標準方法麥冬薄層鑒別項下進行實驗；薄層鑒別圖譜可見陰性對照品與供試品和麥冬對照藥材在相同位置均有一個墨綠色的斑點，說明該方法專屬性差（見圖1）。并且薄層展開劑為苯-丙酮（4∶1），苯為高毒性有機溶劑，具有致癌性，需要改良方法。

圖1 路路通益母膏現(xiàn)行標準方法麥冬薄層鑒別圖

2.1.2 新建立方法 取路路通益母膏10 g，用10 mL水溶解，溶液通過D101大孔吸附樹脂柱（柱的直徑為2 cm，高為18 cm）吸附，用水洗脫，直至流出的液體接近無色，再用80 mL質(zhì)量分數(shù)為0.1%的NaOH溶液洗脫，再按順序用以下不同濃度100 mL的乙醇溶液（30%、40%、50%）洗脫，棄去；再用120 mL的體積分數(shù)為60%的乙醇溶液進行洗脫并收集，蒸干，殘渣用無水乙醇溶解制成1 mL的供試品溶液。陰性對照溶液由路路通益母膏（缺麥冬）稱取10 g，按上述制備方法制成。稱取麥冬對照藥材約2 g，加水適量，回流提取1 h，趁熱過濾，濃縮至20 mL，然后按上述方法制備成對照藥材溶液。按照薄層色譜法（通則0502）試驗，按下述條件進行試驗：點樣量為3～6 μL，點長條形；薄層板為高效硅膠G薄層板；展開劑為三氯甲烷-甲醇-水（26∶13∶4）10 ℃以下放置過夜的下層溶液，顯色方式為噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃下加熱2～5 min；檢視方式為置紫外光燈365 nm下觀察。圖2的色譜圖顯示有2個亮藍色的熒光斑點同時存在于供試品與對照藥材溶液的相應位置上，陰性對照則沒有這2個斑點，說明此方法分離度好，專屬性強，可用于路路通益母膏的麥冬鑒別。

圖2 路路通益母膏麥冬薄層鑒別圖

2.2 黃芪鑒別

2.2.1 現(xiàn)行標準方法檢驗 取路路通益母膏（批號：220301，220501，220601）、黃芪對照藥材、黃芪甲苷對照品及路路通益母膏（缺黃芪），按現(xiàn)行標準方法進行檢驗；圖3顯示供試品的圖譜與對照藥材及對照品在相應的位置上，日光燈及紫外光（365 nm）下均顯相同顏色的斑點；路路通益母膏（缺黃芪）對鑒別無影響。

圖3 路路通益母膏現(xiàn)行標準方法黃芪薄層鑒別圖

2.2.2 新建立方法 取路路通益母膏5 g，精密稱定，按乙肝寧顆粒含量測定供試品制備方法[2]，制備供試品溶液。取黃芪甲苷對照品適量用甲醇制成1 mg/mL的對照品溶液。取黃芪對照藥材2 g，用水煎煮1 h，濾過，濾液水浴濃縮至10 mL，按供試品溶液的制備方法制成對照藥材溶液。取路路通益母膏（缺黃芪）5 g，按供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。按照薄層色譜法[2]進行試驗，試驗條件如下：點樣方式條帶狀，對照品溶液點樣量為5 μL，其他點樣量為10～15 μL；薄層板為硅膠G薄層板；展開劑為三氯甲烷-甲醇-水（26∶13∶4）10 ℃以下放置過夜的下層溶液；顯色方式為噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰，檢視方式為日光及紫外光（365 nm）下觀察。圖4顯示供試品的圖譜與對照藥材及對照品在相應的位置上，日光燈以及紫外光（365 nm）下均顯相同顏色的斑點；路路通益母膏（缺黃芪）對鑒別無影響。

圖4 路路通益母膏黃芪薄層鑒別圖

2.3 鹽酸水蘇堿鑒別

2.3.1 現(xiàn)行標準方法檢驗 取路路通益母膏（批號：220301，220501，220601）、按處方及制法制成缺益母草的陰性對照樣品以及鹽酸水蘇堿對照品，按現(xiàn)行標準方法鹽酸水蘇堿薄層鑒別項下進行實驗，結(jié)果見圖5。該檢測方法的供試品溶液制備時采用硅藻土分散后回流提取與過中性氧化鋁柱子純化等步驟，步驟較多、繁雜，展開時間長，并且需要二次展開，檢測周期需要3 d，檢測周期長。

圖5 路路通益母膏現(xiàn)行標準方法鹽酸水蘇堿薄層鑒別圖

2.3.2 新建立方法 取路路通益母膏20 g，加乙醇50 mL，超聲處理1 h，冷卻后過濾，蒸干濾液，殘渣加適量0.01 mol/L鹽酸溶液溶解；通過已預處理好的強酸性陽離子交換樹脂柱（內(nèi)徑為2 cm，柱高為15 cm）上，用純化水洗至流出液近無色，再以氨試液80 mL洗脫，收集氨試液，蒸干，加甲醇溶解制成1 mL的供試品溶液。取路路通益母膏（缺益母草）20 g，按上述方法制成陰性對照溶液。取鹽酸水蘇堿對照品適量，加甲醇制成2 mg/mL的對照品溶液。按照薄層色譜[2]試驗，試驗條件如下：點樣量為5～10 μL，為條狀點樣；薄層板為羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板；展開劑為丙酮-無水乙醇-鹽酸（10∶7∶1）；顯色方式為置于105℃條件下烘5～10min，放冷，再噴以新配置的稀碘化鉍鉀試液-1%三氯化鐵無水乙醇溶液（1∶1）混合液；檢視方式為日光下檢視。圖6顯示有同一顏色的斑點同時存在于供試品與對照品溶液圖譜的在相同位置上，陰性對照則無此斑點。該方法供試品溶液的制備操作簡單，準確性高，檢測周期大大縮短，薄層斑點明顯，專屬性、重現(xiàn)性好，可用于路路通益母膏的質(zhì)量控制。

圖6 路路通益母膏鹽酸水蘇堿薄層鑒別圖

2.4 黃芪甲苷含量測定

楊力生急忙便說：“哦，相親是好事，相親是好事。不過，像妹子這么漂亮，心眼又好，無論如何也得找個稱心如意的?？刹荒荞R馬虎虎就跟人定下親事?！?/p>

2.4.1 色譜條件 使用Inertisil ODS-3色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-水（32∶68）為流動相，流速為1.0 mL/min，柱溫為25℃，進樣體積為20 μL，蒸發(fā)光散射檢測器檢測，理論塔板數(shù)以黃芪甲苷計算不低于4 000。

2.4.2 對照品溶液的制備 精密稱定黃芪甲苷對照品用甲醇制成1.018 3 mg/mL的儲備液，備用。

2.4.3 供試品溶液的制備 取路路通益母膏5 g，精密稱定，按“2.2.2”項供試品溶液制備方法制備，即得。

2.4.4 陰性對照溶液的制備 取路路通益母膏（缺黃芪）5 g，精密稱定，按“2.2.2”項的供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。

2.4.5 方法學驗證

2.4.5.1 系統(tǒng)適用性試驗 分別精密吸取20 μL的黃芪甲苷對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液，按“2.4.1”的色譜條件，進行試驗。結(jié)果黃芪甲苷峰保留時間為12.83 min，分離度為4.8，理論塔板數(shù)為10 231；未見陰性對照品對試驗有干擾。（見圖7）

圖7 系統(tǒng)適用性試驗色譜圖

2.4.5.2 線性關(guān)系考察 分別精密吸取儲備液用甲醇稀釋成含黃芪甲苷0.101 8、0.2037、0.3055、0.4073、0.5092、0.6110 mg/mL的系列對照品溶液。分別精密吸取上述對照品溶液20 μL注入液相色譜儀，按“2.4.1”色譜條件試驗，繪制標準曲線以濃度對數(shù)為橫坐標，峰面積對數(shù)為縱坐標，結(jié)果回歸方程為：Y=1.58X+9.92；r=0.999 3；表明黃芪甲苷線性關(guān)系考察進樣量2.036～12.220 μg與其對應的峰面積呈良好的Log-Log線性關(guān)系。

2.4.5.3 精密度試驗 取路路通益母膏（批號：220501）按擬定方法制備供試品溶液，連續(xù)進樣6次，計算6次的峰面積的相對標準偏差，結(jié)果黃芪甲苷峰面積RSD值為1.27%（n=6），表明該儀器的精密度良好。

取同一批路路通益母膏（批號：220501）4份，分別由甲、乙兩人，于不同的時間，用同一臺設備，按擬定的含量測定方法測定。結(jié)果黃芪甲苷含量的平均值為0.174 mg/g，RSD值為2.21%（n=4）。表明建立的含量測定方法精密度良好。

2.4.5.4 穩(wěn)定性試驗 取路路通益母膏（批號：220501），按“2.4.3”方法制備供試品溶液，按“2.4.1”色譜條件，在0～24 h內(nèi)，每隔3 h進樣測定1次，結(jié)果黃芪甲苷峰面積RSD值為3.61%（n=9），表明供試品溶液24 h內(nèi)測定基本穩(wěn)定。

2.4.5.5 重復性試驗 取同一批路路通益母膏（批號：220501）6份，每份5 g，精密稱定，按擬定的方法提取測定。結(jié)果含量平均值為0.168mg/g，RSD值為2.94%（n=6）。表明本法的重復性較好。

2.4.5.6 加樣回收率試驗 稱取已知含量的路路通益母膏（批號：220501，含量：0.166 mg/g）6份，每份5 g，精密稱定，分別精密加入1.0 mL黃芪甲苷對照品溶液（0.810 2 mg/mL），按“2.4.3”項供試品溶液制備方法提取，最終甲醇溶解定容至5 mL，搖勻，用0.45 μm濾膜過濾后按“2.4.1”項色譜條件測定，計算回收率。結(jié)果平均加樣回收率為104.66%，RSD值為3.81%。表明本法符合定量分析的要求[3]。（見表1）

表1 加樣回收率試驗結(jié)果

2.4.5.7 耐用性 取同一供試品溶液（批號：220501），按擬定的測定法，分別用Inertsil ODS-3柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）、ACE Excel 5 C18-AR柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters Xbridge C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）3種品牌的色譜柱測定；結(jié)果黃芪甲苷含量平均值為0.169 mg/g，RSD值為3.86%。（見表2）

表2 黃芪甲苷含量測定-不同色譜柱比較

2.4.6 與現(xiàn)行標準方法比較 取路路通益母膏樣品3批（批號：220301、220501、220601）分別按擬定方法及現(xiàn)行標準方法進行黃芪甲苷含量測定，結(jié)果見表3。本試驗方法所測含量更高，準確性也更好，更適合用于路路通益母膏黃芪甲苷含量的測定。

表3 黃芪甲苷含量測定結(jié)果 （mg/g）

3 討論

路路通益母膏現(xiàn)行標準中麥冬的薄層鑒別展開劑為苯和丙酮。本研究對麥冬鑒別的最初目的是尋找適宜的展開劑替換掉高毒性的苯，減少苯的使用。前期實驗發(fā)現(xiàn)，改進的展開劑正己烷-乙酸乙酯（2∶1）也能滿足鑒別需求，但進一步做陰性對照試驗時發(fā)現(xiàn)，標準中的提取方式制備的供試品溶液無論是改進后還是標準的展開劑，結(jié)果都是陰性對照對鑒別有干擾。故本試驗開展了麥冬鑒別全面的研究，嘗試了多種薄層鑒別方法如麥冬藥材藥典方法[3]、甲醇提取后三氯甲烷萃取法[4]、酸性水溶液提取后三氯甲烷萃取法[5]、正丁醇萃取法[6]等均未達到專屬性要求。麥冬中含有甾體皂苷[7-8]、高異黃酮[9-10]、多糖[11]、揮發(fā)油[12]等成分，甾體皂苷、高異黃酮和麥冬多糖具有多種藥理活性[13-17]。本試驗從提取純化麥冬皂苷類成分[18]方向獲得啟發(fā)，根據(jù)路路通益母膏的性質(zhì)改進了麥冬皂苷提取方式，獲得了專屬性好的2個熒光條帶作為鑒別指標。

原標準中鹽酸水蘇堿鑒別的提取方式步驟較多，比較繁雜，并且展開劑展開時間長，還需二次展開，比較耗時。故本研究針對其提取方式和展開劑進行研究，擬修改其提取方式和展開劑，提高工作效率。有研究分別用中性氧化鋁[19]，活性炭-中性氧化鋁[20]、強酸性陽離子交換樹脂[21]對樣品進行純化提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)中性氧化鋁、活性炭-中性氧化鋁過柱比較困難，而且薄層色譜圖上未見待檢成分的斑點。強酸性陽離子交換樹脂提取得到的供試品溶液，其薄層色譜圖上待檢成分的斑點明顯，重現(xiàn)性相對較好，操作簡單，故本鑒別方法采用強酸性陽離子交換樹脂進行純化提取。在展開劑選擇方面，本研究對正丁醇-鹽酸-水、正丁醇-乙酸乙酯-鹽酸、丙酮-無水乙醇-鹽酸等體系進行了比較，結(jié)果以丙酮-無水乙醇-鹽酸（10∶7∶1）效果最好。

目前文獻報道的黃芪甲苷含量測定方法有薄層掃描法[22]、HPLC-ELSD[23]、UPLC-MS/MS[24]、HPLC-MS/MS[25]等方法。路路通益母膏現(xiàn)行標準的黃芪甲苷測定方式為薄層掃描，該方法目前手動操作比較多，人為的影響因素大，重現(xiàn)性不好，而且供試品溶液制備提取方式步驟較多，比較繁雜。本研究以2020年版《中華人民共和國藥典》一部“黃芪藥材含量測定”項和文獻資料[26]為參考，根據(jù)實際情況進行研究，并進行了方法學考察。最終本研究確認了黃芪甲苷的HPLC-ELSD檢測含量測定方法，該法準確性、重現(xiàn)性、可操作性均比薄層掃描法好。

本研究改進的方法專屬性好、操作便捷，重復性好，比現(xiàn)行標準檢驗時間縮短了一半的檢驗時間，旨在提高檢驗效率，節(jié)約人工成本，同時也避免了高毒性溶劑苯及麻醉劑乙醚的使用，對環(huán)境污染、消防安全、職業(yè)健康做出了巨大的改善。