大黃炭炮制過(guò)程中“增效”和“減毒”潛在質(zhì)量標(biāo)志物的變化規(guī)律研究*

楊 麗，楊冬平，孫 靜，董 玲，陳建波

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700）

大黃藥用歷史悠久，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，有瀉下攻積、清熱瀉火、利濕退黃、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)之效，因其功效獨(dú)特而被廣泛應(yīng)用于內(nèi)科、外科、婦科、兒科、骨傷科等各科[1]。大黃瀉下作用較強(qiáng)，是治療積滯便秘的要藥，其中熱結(jié)便秘尤為適宜[2]。因大黃生品苦寒，容易損傷脾胃，歷代醫(yī)家往往通過(guò)炮制改變其藥性，以增強(qiáng)藥物療效，糾正其偏性[3]，擴(kuò)大臨床應(yīng)用范圍。大黃炭是大黃的炮制品之一[4]，其降低了大黃瀉下的作用，保留并增強(qiáng)涼血化瘀等功效[5]。然而，由于缺乏具體的客觀量化指標(biāo)來(lái)衡量炒炭的程度[6-7]，大黃炭在炮制過(guò)程中的火候和時(shí)間很難準(zhǔn)確把握，導(dǎo)致市場(chǎng)上大黃炭的化學(xué)成分含量差異較大，難以充分保障臨床用藥的安全性和有效性。

從古至今，藥工通常以判斷大黃炭“表面焦黑色、內(nèi)部焦褐色”為炮制適中的條件，而這種判斷方式僅靠人工觀察顏色，不僅沒(méi)有客觀量化指標(biāo)，也沒(méi)有從藥效物質(zhì)方面闡釋顏色判斷的合理性。同時(shí)，2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)的大黃炭指標(biāo)成分與生大黃一致，規(guī)定大黃炭總蒽醌含量不得少于0.9%，游離蒽醌不得少于0.5%[4]，只是二者的最低含量發(fā)生了變化。大黃炭具有涼血、化瘀、止血的多重功效，通過(guò)單一的化學(xué)成分來(lái)表征大黃炭的質(zhì)量不夠完善[8-10]。所以，本研究嘗試從質(zhì)量標(biāo)志物的角度，找出可反映大黃炒炭前后藥效變化的標(biāo)志性成分，通過(guò)進(jìn)一步研究這些標(biāo)志性成分與顏色的量化關(guān)系，為大黃炒炭的終點(diǎn)判斷提供合理、客觀的理化指標(biāo)。

1 材料

1.1 藥材與試劑 原藥材采集于四川省成都大順中藥材責(zé)任有限公司，采集前均經(jīng)過(guò)廠家陰干處理。經(jīng)中國(guó)中藥協(xié)會(huì)首席科學(xué)家張世臣教授鑒定為蓼科植物掌葉大黃Rheum palmatumL.、藥用大黃Rheum officinaleBaill. 的干燥根和根莖。

沒(méi)食子酸（批號(hào)：201605，純度：98%）、5-HMF（批號(hào)：H12M9Z61023，純度：98%）、番瀉苷A（批號(hào)：P01S8F42887，純度：98%）和番瀉苷B（批號(hào)：P20A9F59262，純度：98%）均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。蘆薈大黃素-8-O-β-D葡萄糖苷（批號(hào)：6457，純度：98.4%）、大黃酸-8-O-β-D葡萄糖苷（批號(hào)：6474，純度：99.4%）、大黃酚-8-O-β-D葡萄糖苷（批號(hào)：6473，純度：99.3%）、大黃素-8-O-β-D葡萄糖苷（批號(hào)：6443，純度：99.2%）和大黃素甲醚-8-O-β-D葡萄糖苷（批號(hào)：6551，純度：99.1%）均購(gòu)自上海詩(shī)丹德生物技術(shù)有限公司；蘆薈大黃素（批號(hào)：110795-201710，純度：98.1%）、大黃酸（批號(hào)：110757-201607，純度：99.3%）、大黃素（批號(hào)：110756-201512，純度：98.7%）、大黃酚（批號(hào)：110796-201621，純度：99.2%）和大黃素甲醚（批號(hào)：110758-201616，純度：99.0%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；分析純甲醇（批號(hào)：190214）購(gòu)自廣東省精細(xì)化學(xué)品工程技術(shù)研究開(kāi)發(fā)中心；色譜級(jí)甲醇（批號(hào)：191614）購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；分析純醋酸（批號(hào)：20171026）、分析純磷酸（批號(hào)：20170225）均購(gòu)自北京化工廠；娃哈哈純凈水購(gòu)自杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司；去離子水自制。

1.2 儀器 LC-20AT高效液相色譜儀，配備SPD-20A型紫外檢測(cè)器、SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器（日本島津公司）；DHG-9070C型烘箱（上海培因?qū)嶒?yàn)儀器有限公司）；BJ-800A型多功能粉碎機(jī)（拜爾）；BT-25S電子分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；KH7200DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）。

2 方法

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè) 首先進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，即通過(guò)TCMSP[11]、TCM@Taiwan及TCMID數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)[12]，輸入大黃的中藥名稱(chēng)，搜索后得到大黃的化學(xué)成分，以口服生物利用度（OB）及類(lèi)藥性（DL）的篩選條件（OB≥30%，DL≥0.18）進(jìn)行篩選。除此之外，查閱文獻(xiàn)資料，找到因上述篩選條件而被刪除但對(duì)大黃炭的研究有一定潛在價(jià)值的化學(xué)成分，再通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，將文獻(xiàn)搜索的結(jié)果進(jìn)行篩選，得到藥物潛在靶點(diǎn)。采用DAVID 6.7數(shù)據(jù)平臺(tái)對(duì)所收集到的有效成分進(jìn)行KEGG通路富集分析[13]，預(yù)測(cè)基因功能與差異基因所在的信號(hào)通路。為進(jìn)一步明確大黃炭活性成分、潛在靶點(diǎn)與通路之間的相互作用，將活性成分利用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)將篩選出的核心靶點(diǎn)進(jìn)行生物信息分析，對(duì)大黃炭的KEGG通路進(jìn)行富集分析，并以P＜0.05作為顯著功能與通路的臨界值，通過(guò)Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建藥物-成分-靶點(diǎn)-通路的互作網(wǎng)絡(luò)，并分析關(guān)鍵通路的靶點(diǎn)和所涉及的主要生物活性成分，得出大黃炭的活性成分。

2.2 樣品制備 分別稱(chēng)取100 g掌葉大黃和藥用大黃各31份樣品飲片，運(yùn)用烘箱分別在160、180、200、220、240 ℃下加熱10、20、30、40、50、60 min，待樣品冷卻后稱(chēng)重。取一定量樣品粉碎后測(cè)定色度值和沒(méi)食子酸、5-HMF、蘆薈大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃酸-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃酚-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷、番瀉苷A、番瀉苷B、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的化學(xué)成分含量。

2.3 含量測(cè)定 色譜柱：Kromasil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm，體積流量為1 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL，柱溫35 ℃。以1%磷酸水溶液（A）-甲醇（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫程序：0～25 min：5%B～30%B；25～40 min：30%B～60%B；40～60 min：60%B～60%B；60～70 min：60%B～100%B；70～95 min：100%B～100%B。

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取14種對(duì)照品適量，分別置于若干個(gè)25 mL和50 mL容量瓶中，加70%的甲醇溶解，搖勻，配制成對(duì)照品溶液，質(zhì)量濃度分別為沒(méi)食子酸0.003～0.120mg/mL、5-HMF為0.002 5～0.050 0 mg/mL、蘆薈大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷0.002 8～0.280 0 mg/mL、大黃酸-8-O-β-D-葡萄糖苷0.006 5～0.2500mg/mL、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷0.012～0.240 mg/mL、大黃酚-8-O-β-D-葡萄糖苷0.008～0.160 mg/mL、大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷0.008～0.160 mg/mL、番瀉苷A0.028～0.560 mg/mL、番瀉苷B0.01～0.14 mg/mL、蘆薈大黃素0.005～0.200 mg/mL、大黃酸0.009～0.270 mg/mL、大黃素0.001～0.080 mg/mL、大黃酚0.01～0.40 mg/mL、大黃素甲醚0.007～0.210 mg/mL。

2.3.2 供試品溶液的制備 將不同批次的樣品粉碎過(guò)5號(hào)篩后，分別準(zhǔn)確稱(chēng)取各批次粉末0.25 g，置于50 mL錐形瓶中，精密加入25 mL 70%甲醇，稱(chēng)定質(zhì)量后超聲處理30 min，超聲功率為400 W，頻率為30 kHz，超聲結(jié)束后放冷再次稱(chēng)定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足至超聲前的質(zhì)量。采用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4 體外抗炎活性評(píng)價(jià) 本部分基于中醫(yī)理論，選擇大黃炭“涼血化瘀”的傳統(tǒng)功效，以廣泛應(yīng)用于抗炎活性藥物篩選的LPS誘導(dǎo)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelium cells，HUVEC）作為“涼血化瘀”體外研究模型[14]。將所篩選得到的潛在質(zhì)量標(biāo)志物作用于細(xì)胞模型，進(jìn)一步篩選出潛在質(zhì)量標(biāo)志物的生物活性差異。

2.5 色度測(cè)定 將紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)起止波長(zhǎng)設(shè)為780～380 nm；測(cè)量時(shí)按設(shè)定的條件進(jìn)行基線校正操作，校正完成后取出樣品的標(biāo)準(zhǔn)白板，取適量大黃加熱樣品粉末（過(guò)五號(hào)篩）壓制于石英測(cè)色皿中，蓋上石英玻璃片。然后將石英玻璃片與石英皿外側(cè)用擦鏡紙擦拭干凈放入測(cè)量?jī)x中進(jìn)行測(cè)量，變換位置，平行3次拍照，計(jì)錄樣品顏色的L*、a*、b*數(shù)值。

2.6 數(shù)據(jù)分析 通過(guò)SPSS、SIMCA 14.1、GraphPad Prism 8.0.2等軟件對(duì)樣品所得生物活性結(jié)果、化學(xué)成分含量和顏色量化值進(jìn)行數(shù)值的關(guān)聯(lián)性分析和數(shù)學(xué)模型建立。

3 結(jié)果

3.1 大黃炭潛在質(zhì)量標(biāo)志物篩選

3.1.1 大黃炭的化學(xué)成分及靶點(diǎn)信息 通過(guò)TCMSP等數(shù)據(jù)庫(kù)和文獻(xiàn)共檢索到大黃炭的成分86個(gè)，包括沒(méi)食子酸、大黃酸等。接著從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取每種活性成分的靶蛋白，將相關(guān)靶點(diǎn)合并去重后共得到121個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)，主要包括白細(xì)胞介素-6（IL-6）、細(xì)胞間黏附分子1（ICAM1）等炎癥因子，還有花生四烯酸鹽-脂氧合酶、腺苷受體A1、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶ATR及PI3激酶等。

3.1.2 KEGG通路富集 為了闡明大黃炭靶點(diǎn)的生物學(xué)功能，利用David數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)所得靶點(diǎn)進(jìn)行了KEGG通路富集。KEGG通路富集分析共得到75條通路。其中24條通路的P＜0.05，見(jiàn)圖1。大黃炭化學(xué)成分與乙型肝炎（Hepatitis B）、TNF信號(hào)通路（TNF signaling pathway）、MAPK信號(hào)通路（MAPK signaling pathway）、胰島素抵抗（Insulin resistance）等疾病通路關(guān)系密切。其中以TNF和MAPK通路為代表的多個(gè)疾病相關(guān)通路均與調(diào)控炎癥活性相關(guān)，抗炎相關(guān)通路在數(shù)量上占據(jù)優(yōu)勢(shì)且具有較高的富集因子值（Rich Factor）。大黃炭中的化學(xué)成分可能主要通過(guò)這些炎癥通路發(fā)揮作用，進(jìn)而影響多種疾病的生理過(guò)程。

圖1 大黃炭通路氣泡圖

3.1.3 基于大黃炭活性成分、作用靶標(biāo)的質(zhì)量標(biāo)志物初步預(yù)測(cè) 通過(guò)Cytoscape3.7.2軟件建立大黃炭“成分-靶標(biāo)-通路”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系（見(jiàn)圖2），并對(duì)結(jié)果進(jìn)行綜合分析。結(jié)果顯示，沒(méi)食子酸、大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素、兒茶素、槲皮素的靶點(diǎn)、通路呈高度相關(guān)，推測(cè)其在功效上存在疊加效應(yīng)。而5-HMF具有相對(duì)獨(dú)立的靶點(diǎn)ADH1B和ADH1C，可能是通過(guò)不同的靶點(diǎn)發(fā)揮藥效，其他化合物則沒(méi)有作用靶點(diǎn)或作用靶點(diǎn)較少。在以上這6種化合物中，因槲皮素在多種中藥中均有所分布[15]，并且其藥理作用廣泛[16]，故選擇暫不納入大黃炭的化學(xué)指標(biāo)中。此外，由于沒(méi)食子酸和兒茶素在止血方面的作用機(jī)理一致[17]，故選擇現(xiàn)代研究方法較多、范圍較廣的沒(méi)食子酸作為大黃炭的藥效成分。最后網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)部分驗(yàn)證出可將沒(méi)食子酸、5-HMF、大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素初步作為大黃炭的潛在質(zhì)量標(biāo)志物。

圖2 大黃炭“成分-靶標(biāo)-通路”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

3.1.4 含量測(cè)定方法學(xué)考察

3.1.4.1 線性關(guān)系考察 將“2.3.1”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液分別按一定的倍數(shù)稀釋為一系列不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，采用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)后分別進(jìn)樣測(cè)定，每次10.0 μL，檢測(cè)完畢后記錄各個(gè)待測(cè)物質(zhì)的色譜峰面積。以進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制各個(gè)成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明14個(gè)待測(cè)成分在一定進(jìn)樣質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，峰面積與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系。（見(jiàn)表1）

表1 18 批樣品中14 種成分的線性考察結(jié)果

3.1.4.2 精密度試驗(yàn) 取同一混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10.0 μL，記錄各待測(cè)成分的色譜峰面積。結(jié)果顯示沒(méi)食子酸、5-HMF、蘆薈大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、番瀉苷B、大黃酸-8-O-β-D-葡萄糖苷、番瀉苷A、大黃酚-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚14個(gè)待測(cè)物質(zhì)峰面積的RSD值分別為0.40%、0.45%、0.40%、0.65%、0.34%、1.08%、0.87%、1.28%、1.78%、0.36%、0.85%、1.75%、0.82%、1.80%，均小于2.00%，表明儀器的精密度良好。

3.1.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于制備后0、2、4、6、12、24 h內(nèi)進(jìn)樣測(cè)定，記錄各待測(cè)物質(zhì)的色譜峰面積，計(jì)算沒(méi)食子酸、5-HMF、蘆薈大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、番瀉苷B、大黃酸-8-O-β-D-葡萄糖苷、番瀉苷A、大黃酚-8-Oβ-D-葡萄糖苷、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚14個(gè)待測(cè)物質(zhì)峰面積的RSD值。結(jié)果顯示，14個(gè)待測(cè)物質(zhì)在24 h內(nèi)色譜峰面積的RSD值均小于3.00%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.1.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次（S2）的大黃樣品粉末0.25 g（過(guò)5號(hào)篩），共6份，精密稱(chēng)定，按照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。準(zhǔn)確吸取各供試品溶液各10.0 μL注入HPLC進(jìn)行測(cè)定，記錄各色譜峰面積。結(jié)果顯示6份供試溶液中沒(méi)食子酸、5-HMF、蘆薈大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、番瀉苷B、大黃酸-8-O-β-D-葡萄糖苷、番瀉苷A、大黃酚-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的RSD值分別為0.68%、0.73%、0.85%、0.78%、0.28%、0.79%、1.95%、2.13%、1.42%、1.71%、1.79%、1.29%、1.52%、2.54%。

3.1.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批次已測(cè)定的大黃樣品（S2）粉末0.10 g（過(guò)5號(hào)篩），精密稱(chēng)定，置于50 mL棕色量瓶中，分別加入相同質(zhì)量的對(duì)照品物質(zhì)，最后加入70%甲醇溶液25 mL，按照“2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定各成分的色譜峰面積，計(jì)算含量和回收率。結(jié)果顯示14個(gè)待測(cè)成分的平均回收率為95.78%～102.84%，RSD值為3.25%～4.98%，表明方法的準(zhǔn)確性較好。

3.1.5 基于抗炎活性篩選大黃炭的潛在質(zhì)量標(biāo)志物 以文獻(xiàn)內(nèi)容為基礎(chǔ)，本部分增加了大黃酚和大黃素甲醚2個(gè)游離蒽醌類(lèi)化合物，同時(shí)增加了與游離蒽醌可互相轉(zhuǎn)化[18]、具有瀉下作用的結(jié)合蒽醌大黃酸-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素-8-Oβ-D-葡萄糖苷、大黃酚-8-O-β-D-葡萄糖苷、蘆薈大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷，且瀉下成分番瀉苷A和番瀉苷B[19]同時(shí)作為大黃炭的潛在質(zhì)量標(biāo)志物。結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)中沒(méi)食子酸、5-HMF、大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素共14個(gè)成分作為大黃炭的潛在質(zhì)量標(biāo)志物，通過(guò)研究潛在質(zhì)量標(biāo)志物的抗炎活性進(jìn)一步篩選大黃炭的質(zhì)量標(biāo)志物。

研究表明，大黃酸在大黃中含量最高，且是游離蒽醌類(lèi)成分入血后體內(nèi)的主要存在形式[20]，故選取大黃酸及其苷類(lèi)大黃酸-8-O-β-D-葡萄糖苷，同時(shí)選取瀉下成分番瀉苷A、止血作用的沒(méi)食子酸和顏色相關(guān)的成分5-HMF[7]共5類(lèi)成分為化學(xué)指標(biāo)進(jìn)行大黃炭“涼血化瘀”的生物活性的研究。其中，大黃酸濃度為1～50 μmol/L（濃度為100 μmol/L時(shí)有細(xì)胞毒性），大黃酸-8-O-β-D-葡萄糖苷為1～100 μmol/L，其他成分濃度為1～200 μmol/L。

各化合物對(duì)腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和NO釋放量的作用所得結(jié)果見(jiàn)圖3。其中游離蒽醌大黃酸及結(jié)合蒽醌大黃酸-8-O-β-D-葡萄糖苷均隨著濃度的增加，對(duì)TNF-α、IL-1β和NO釋放量的抑制作用增加，與模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。沒(méi)食子酸、5-HMF和番瀉苷A不同濃度中，抑制TNF-α、IL-1β和NO作用在較低濃度下無(wú)差異（P＞0.05），而在較高濃度100 μmol/L和200 μmol/L時(shí)，各指標(biāo)均具有差異（P＜0.001）。比較5個(gè)化合物抑制TNF-α、IL-1β和NO釋放量的水平，在相同濃度下大黃酸抑制作用最強(qiáng)，大黃酸-8-O-β-D-葡萄糖苷次之，沒(méi)食子酸、5-HMF和番瀉苷A的抑制作用最弱。因此，推測(cè)相同濃度下抗炎活性強(qiáng)弱為：游離蒽醌＞結(jié)合蒽醌＞沒(méi)食子酸、5-HMF和番瀉苷。說(shuō)明游離蒽醌在大黃炭發(fā)揮抗炎作用時(shí)是起到主要作用的一類(lèi)化合物。

圖3 各化合物對(duì)LPS 誘導(dǎo)的HUVEC 細(xì)胞NO、IL-1β 和TNF-α 釋放量的影響 （，n=3）

3.2 大黃炭潛在質(zhì)量標(biāo)志物與炮制過(guò)程顏色變化的關(guān)聯(lián)性

3.2.1 大黃炭潛在質(zhì)量標(biāo)志物在加熱過(guò)程中的變化規(guī)律 通過(guò)HPLC法測(cè)得沒(méi)食子酸、5-HMF等14種化學(xué)成分含量，掌葉大黃和藥用大黃各成分總含量見(jiàn)圖4～5。掌葉大黃結(jié)果表明，大黃在不同條件加熱過(guò)程中14種化合物呈兩種模式的變化模式，即在180 ℃和200 ℃溫度下，加熱前期游離蒽醌、5-HMF和沒(méi)食子酸含量出現(xiàn)峰值，后隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，三者含量均下降，呈先增加后減少的變化模式。在160 ℃和240 ℃溫度下，主要瀉下成分番瀉苷和結(jié)合蒽醌均呈單向遞減的變化模式，表明炒炭減弱了大黃瀉下的作用。此外在160 ℃和240 ℃時(shí)沒(méi)食子酸、5-HMF或游離蒽醌呈遞增或遞減的模式，說(shuō)明加熱不及時(shí)成分未被完全分解而未達(dá)到含量最大值，或加熱太過(guò)時(shí)成分被破壞。同樣藥用大黃在加熱過(guò)程中14種化合物也呈兩種變化模式，在180 ℃和200 ℃溫度下，隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，沒(méi)食子酸、5-HMF和游離蒽醌呈先增加后減少的變化模式，番瀉苷和結(jié)合蒽醌則均呈單項(xiàng)遞減的變化模式。

圖4 掌葉大黃不同加熱程度樣品含量變化趨勢(shì)圖

圖5 藥用大黃不同加熱程度樣品含量變化趨勢(shì)圖

3.2.2 大黃炭顏色量化值分析 本部分將傳統(tǒng)大黃炭表面“焦黑色”，內(nèi)部“焦褐色”的主觀顏色量化，得到掌葉大黃、藥用大黃色度值得率、L、a、b變化圖見(jiàn)圖6。結(jié)果表明粉末的色度值E*ab隨著加熱程度的增加而下降，其中在較低溫度160 ℃的樣品總E*ab值的下降趨勢(shì)較小，而超過(guò)這一溫度后的下降程度增大，說(shuō)明溫度越高，樣品顏色變黑的程度越明顯，加熱樣品為240 ℃條件下40～60 min時(shí)，總色值的變化趨于穩(wěn)定，也說(shuō)明加熱太過(guò)，樣品趨于黑色幾乎不發(fā)生改變。

圖6 不同加熱程度樣品色度變化圖

3.2.3 大黃炭顏色量化值和含量相關(guān)性分析 進(jìn)一步運(yùn)用Graphad等軟件將色度量化值與成分含量進(jìn)行線性或二次函數(shù)擬合。得出大黃在炭化過(guò)程中隨著顏色的逐漸加深，與結(jié)合蒽醌和番瀉苷類(lèi)呈線性相關(guān)。與游離蒽醌、沒(méi)食子酸和5-HMF二次相關(guān)，如圖7所示。根據(jù)大黃炭表面“焦黑色”，內(nèi)部“焦褐色”的傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)，顏色值L、a和b下降到某一范圍，潛在質(zhì)量標(biāo)志物番瀉苷和結(jié)合蒽醌含量接近為0可能是大黃炭合理的炒炭終點(diǎn)，對(duì)應(yīng)游潛在質(zhì)量標(biāo)志物離蒽醌含量達(dá)到拋物線的頂峰、上升或下降趨勢(shì)的某一高點(diǎn)時(shí)，炮制最佳，即符合傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)鑒別的要求[21]。

圖7 樣品粉末E*ab與成分變化關(guān)系圖

4 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，掌葉大黃和藥用大黃在加熱過(guò)程中，游離蒽醌、沒(méi)食子酸和5-HMF呈先增加后減少的變化模式，結(jié)合蒽醌和番瀉苷呈單項(xiàng)遞減的變化模式，課題組此前的研究亦發(fā)現(xiàn)唐古特大黃中的這5類(lèi)化合物具有與上述一致的變化規(guī)律[22]。本研究中單向減少的有瀉下成分番瀉苷和結(jié)合蒽醌，因結(jié)合蒽醌與番瀉苷含量變化規(guī)律一致，且結(jié)合蒽醌含量較高，可選擇結(jié)合蒽醌作為代表性的“減毒”質(zhì)量標(biāo)志物（Negative Q-marker）。炒炭過(guò)程中，先增后減的有抗炎止血等活性成分游離蒽醌、沒(méi)食子酸和5-HMF，因三者含量變化規(guī)律一致，且游離蒽醌的活性、含量都顯著高于沒(méi)食子酸、5-HMF，結(jié)合三類(lèi)成分在大黃炭中含量高低：游離蒽醌（按成分最高含量計(jì)）＞沒(méi)食子酸（12倍）＞5-HMF（70倍）。此外后兩個(gè)成分在其他炭藥也普遍存在，故游離蒽醌的專(zhuān)屬性、特征性也優(yōu)于沒(méi)食子酸和5-HMF，可以選擇游離蒽醌作為代表性的“增效”質(zhì)量標(biāo)志物（Positive Q-marker）。最終表明，在大黃炭炮制過(guò)程中，“減毒”質(zhì)量標(biāo)志物含量降低，對(duì)應(yīng)大黃的苦寒之性下降，瀉下作用減弱；“增效”質(zhì)量標(biāo)志物含量升高，對(duì)應(yīng)大黃炭涼血化瘀的功效增強(qiáng)。這也是大黃炭“減毒增效”的炮制變化機(jī)制。

通過(guò)本研究可以看出，炒炭的原理可能是減少“減毒”質(zhì)量標(biāo)志物含量，增加“增效”質(zhì)量標(biāo)志物含量，推測(cè)大黃炭炒炭的終點(diǎn)處“減毒”質(zhì)量標(biāo)志物應(yīng)基本消失，“增效”質(zhì)量標(biāo)志物相對(duì)于生大黃應(yīng)有所增加而沒(méi)有顯著的降低趨勢(shì)則較好。本研究發(fā)現(xiàn)減毒標(biāo)志物最低點(diǎn)與增效標(biāo)志物最高點(diǎn)并不一致，這種情況下可結(jié)合傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)找出最佳的炮制點(diǎn)。

5 小結(jié)

本研究篩選出游離蒽醌是大黃炭的“增效”質(zhì)量標(biāo)志物，結(jié)合蒽醌是“減毒”質(zhì)量標(biāo)志物，為大黃炭的質(zhì)量研究和炮制工藝考察提供了一種新思路。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為血瘀證是由血行不暢或血流瘀滯而形成，即“脈道以通，血?dú)饽诵小?，“脈不通而血不流”，“其結(jié)絡(luò)者，脈結(jié)血不行，決之乃行”，可見(jiàn)脈的功能受損與血瘀證的發(fā)生有密切關(guān)系[23-24]。同時(shí)，人們?cè)谕飧酗L(fēng)溫之邪或熱病后遺毒于內(nèi)或情志郁結(jié)、飲食不節(jié)，造成熱毒內(nèi)盛，此時(shí)正氣耗傷但邪熱未去，熱毒內(nèi)陷營(yíng)血，灼傷脈絡(luò)，致血液溢出脈管化為瘀血引起氣機(jī)逆亂。此種病因病機(jī)多是由體內(nèi)殘留的炎癥引起，使臟腑功能失調(diào)，呈現(xiàn)邪實(shí)未去、正氣虛耗的虛實(shí)夾雜證候。本研究運(yùn)用HUVEC細(xì)胞篩選大黃炭質(zhì)量標(biāo)志物即很好的符合了大黃炭“涼血化瘀”的功效。

大黃藥材在炮制為大黃炭后，游離蒽醌作為大黃炭發(fā)揮“涼血化瘀”的主要化合物，含量明顯升高，故相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中應(yīng)規(guī)定游離蒽醌含量的下限值。結(jié)合蒽醌和番瀉苷作為大黃瀉下的主要成分，在大黃炭中的含量較少，所以相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)規(guī)定二者在大黃炭中的上限值，以有效控制大黃和大黃炭的質(zhì)量。同時(shí)，企業(yè)在炮制大黃炭時(shí)，可先測(cè)定大黃藥材中游離蒽醌和結(jié)合蒽醌的含量，炮制為大黃炭后，再通過(guò)二者的數(shù)值大小比較二者之間的成分變化情況，如此可判斷炮制的程度是否合理。同時(shí)，從節(jié)省能源和提高效率的角度考慮，生產(chǎn)工藝應(yīng)以“高溫度、少時(shí)間”的原則進(jìn)行炮制。需要強(qiáng)調(diào)的是，本研究是實(shí)驗(yàn)室規(guī)模實(shí)驗(yàn)，具體的上下限值應(yīng)結(jié)合中試實(shí)驗(yàn)得到最佳的參考范圍。