苗藥吉祥草配伍余甘子抗Lewis肺癌細(xì)胞增殖組分的篩選*

黃興文，劉 煒

（1.廣東云浮中醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院，廣東 云浮 527400；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550001）

吉祥草和余甘子均收載于《貴州十大苗藥研究》。吉祥草[Reineckia carnea（Andr.）Kunth.]又名小葉萬年青、觀音草等，為百合科吉祥草屬植物。吉祥草味甘，性涼，具有清肺止咳、解毒利咽、涼血止血等作用，為貴州十大苗藥之一[1-2]。吉祥草是苗族人民用于治療肺部疾?。ǚ卧锟却㈥幪摽人缘龋┑某Ｓ盟嶽3]。余甘子（Phyllanthus emblicaL.）別名橄欖、滇橄欖、油柑子、山油甘、庵摩勒、牛甘子、喉甘子等，為大戟科葉下珠屬植物余甘子的干燥成熟果實(shí)[4]，具有清熱涼血、消食健胃、生津止咳等功效[5-7]，主要用于治療咳嗽、喉痛、口干、血熱血瘀、消化不良等[5]。余甘子系藏族、苗族等民族習(xí)用藥材[4,8]。2020年國(guó)際癌癥研究中心（International Agency for Research on Cancer，IARC）發(fā)布的全球癌癥負(fù)擔(dān)的最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，全球肺癌死亡病例約180萬例，居全球癌癥死亡病例的首位[9-10]。我國(guó)肺癌的發(fā)病率和死亡率也居高不下，2020年中國(guó)新發(fā)肺癌約82萬例，死亡約71萬例[9]。藏醫(yī)學(xué)中，早已有以余甘子為主藥的方劑治療肺癌的歷史[11-12]。吉祥草18 g與余甘子9 g配伍，是在邱德文教授分別對(duì)兩味藥深入研究并在臨床抗腫瘤應(yīng)用方面取得成效的基礎(chǔ)上確立的[12]。課題組前期已進(jìn)行了吉祥草配伍余甘子抗非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer）的藥效學(xué)研究[12]。因此本研究將兩種苗族及藏族具有民族特色的治療肺癌的習(xí)用藥材配伍在一起，利用方劑配伍原理、膜分離技術(shù)有機(jī)結(jié)合起來，以體外細(xì)胞模型作為評(píng)價(jià)手段，探索兩藥配伍后治療非小細(xì)胞肺癌的有效物質(zhì)，以期為吉祥草配伍余甘子抗腫瘤制劑開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞株 Lewis肺癌細(xì)胞株（昆明細(xì)胞庫，編號(hào)：KCB 20781YJ）。

1.2 藥物與試劑 吉祥草：采購于貴州貴陽，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室孫慶文教授鑒定為百合科吉祥草屬植物吉祥草[Reineckia carnea（Andr.）Kunth]。

余甘子：采購于貴州貴陽，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室孫慶文教授鑒定為大戟科葉下珠屬植物余甘子的成熟果實(shí)（Phyllanthus emblicaL.）。

康萊特注射液（浙江康萊特藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1706236-1）；DMEM高糖培養(yǎng)基（美國(guó)Hyclone公司，批號(hào)：SH30021.01B）；胰蛋白酶-EDTA消化液（0.25%）（美國(guó)Hyclone公司，批號(hào)：SH30061.01）；雙抗（青鏈霉素混合液）（美國(guó)Hyclone公司，批號(hào)：SV30064）；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）（美國(guó)Solarbio公司，批號(hào)：M8180）；二甲基亞砜（DMSO）（美國(guó)Amresco公司，批號(hào)：0231-500mL）；磷酸鹽緩沖液（美國(guó)Solarbio 公司，批號(hào)：P1010-2）；胎牛血清（澳大利亞AusGeneX公司，批號(hào)：FBS500-S）。

1.3 儀器設(shè)備 超濾膜（上海摩速科學(xué)器材有限公司，型號(hào)：MSC80001，MSC80005，MSC80010，MSC80030）；超濾杯（上海摩速科學(xué)器材有限公司，型號(hào)：MSC800）；氮?dú)馄浚ㄉ綎|永安合力特種裝備有限公司，型號(hào)：10L）；磁力加熱攪拌器（常州普天儀器制造有限公司，型號(hào)：79-1）；板式酶標(biāo)儀（北京市新風(fēng)機(jī)電技術(shù)公司，型號(hào)：ZS-2）；8聯(lián)排移液器（德國(guó)普蘭德有限公司，型號(hào)：Transferpette-820-200 μL）；移液器[芬蘭百得實(shí)驗(yàn)室儀器（中國(guó)）有限公司，型號(hào)：1-ch100 μL]；超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，型號(hào)：BHC-1300）；二氧化碳培養(yǎng)箱（日本三洋公司，型號(hào)：MCO-175）；奧林巴斯生物顯微鏡（日本奧林巴斯公司，型號(hào)：CKX-41）；25 cm正方透氣蓋斜口細(xì)胞培養(yǎng)瓶（美國(guó)Corning公司，型號(hào)：430639-25 cm）；75 cm正方透氣蓋斜口細(xì)胞培養(yǎng)瓶（美國(guó)Corning公司，型號(hào)：430641-75 cm）；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（美國(guó)Corning公司，型號(hào)：3599）；針頭式濾器（33 mm、0.22 μm PES膜）（美國(guó)Millipore公司，型號(hào)：SLGP033RB）。

2 方法

2.1 吉祥草配伍余甘子不同組分制備

2.1.1 不同提取方法組分制備 通過鮮藥榨汁、傳統(tǒng)水煎、滲漉等提取方法制得吉祥草配伍余甘子的不同提取物。

水煎液組：稱取干藥材吉祥草36 g，余甘子18 g，即m（吉祥草）∶m（余甘子）=2∶1。按傳統(tǒng)的水煎煮法，加入8倍量的水浸泡30 min，提取2次，每次提取時(shí)間1 h，合并兩次提取液，減壓干燥得到提取物，使用時(shí)配至所需濃度。

50%乙醇滲漉組：稱取干藥材吉祥草36 g，余甘子18 g，即m（吉祥草）∶m（余甘子）=2∶1。剪碎，50%乙醇潤(rùn)濕，裝筒，排氣，往滲漉筒加入50%乙醇浸漬12 h后按1 mL/min滲漉速度滲漉，溶劑為藥材質(zhì)量的15倍，收集滲漉液，減壓干燥得到提取物，使用時(shí)配至所需濃度。

95%乙醇滲漉組：稱取干藥材吉祥草36 g，余甘子18 g，即m（吉祥草）∶m（余甘子）=2∶1。剪碎，95%乙醇潤(rùn)濕，裝筒，排氣，往滲漉筒加入95%乙醇浸漬12 h后按1 mL/min滲漉速度滲漉，溶劑為藥材質(zhì)量的15倍，收集滲漉液，減壓干燥得到提取物，使用時(shí)配至所需濃度。

鮮藥組：稱取新鮮藥材吉祥草36 g，余甘子18 g，即m（吉祥草）∶m（余甘子）=2∶1。剪碎，加定量的水用榨汁機(jī)攪拌至碎，壓榨取汁，減壓干燥得到提取物，使用時(shí)配至所需濃度。

2.1.2 不同分子量區(qū)間段組分制備 按“2.1.1”優(yōu)選出的最佳提取方法制備組分，并將其減壓濃縮至生藥質(zhì)量濃度為0.2 g/mL，從超濾杯的加料口加入，通過軟管連接氮?dú)馄颗c超濾杯；將裝好的超濾杯放在磁力攪拌器，打開磁力攪拌器使攪拌轉(zhuǎn)子以合適的轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)動(dòng)，打開氮?dú)馄块y，調(diào)整壓力為0.10～0.22 MPa，收集膜分離產(chǎn)物；超濾膜使用順序依次為MWCO 30 KD、MWCO 10 KD、MWCO 5 KD、MWCO 1 KD，得到膜分離產(chǎn)物分子量≥30KD組分、分子量10～30 KD組分（不含10 KD、30 KD）、分子量5～10 KD組分（不含5 KD，含10 KD）、分子量1～5 KD組分（不含1KD，含5KD）、分子量≤1KD組分。不同分子量的膜分離產(chǎn)物用95%乙醇復(fù)溶轉(zhuǎn)移至已恒重的蒸發(fā)皿減壓干燥得到不同分子量區(qū)間段組分，使用時(shí)配至所需濃度。

2.2 接種細(xì)胞 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Lewis肺癌細(xì)胞株以0.25%胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液，顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞量，調(diào)整至1×105個(gè)/mL細(xì)胞懸液，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，鋪板過程中需不斷輕搖混懸液使細(xì)胞分布均勻。放入37 ℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞覆蓋孔底達(dá)90%時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.3 吉祥草配伍余甘子不同組分干預(yù)

2.3.1 不同提取方法組分干預(yù) 取水煎液組分、50%乙醇滲漉組分、95%乙醇滲漉組分及鮮藥組分用適量的DMSO助溶，之后分別用無血清DMEM培養(yǎng)基按10倍梯度稀釋，DMSO最終含量≤0.1%，用0.22 μm濾器過濾除菌即可用于干預(yù)細(xì)胞?？等R特注射液（陽性藥）用生理鹽水稀釋15倍后作為母液備用。參考文獻(xiàn)[13]計(jì)算，體外實(shí)驗(yàn)藥物質(zhì)量濃度（μg/mL）=50×D/5 000/50%×103。D為臨床用藥劑量[mg/（kg·d）]。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)過程中的結(jié)果設(shè)定始濃度，用無血清DMEM培養(yǎng)基按10倍梯度稀釋。各組設(shè)4個(gè)濃度，分別將不同提取方法的4種藥物組分及康萊特注射液加入細(xì)胞孔板，分別為鮮藥組、水煎液組、50%乙醇滲漉組、95%乙醇滲漉組、康萊特陽性組、0.1% DMSO溶媒劑組、對(duì)照組（不含干預(yù)藥物，其余步驟一致）、調(diào)零孔（不含干預(yù)藥物、細(xì)胞，其余步驟一致）。每孔100 μL，各組設(shè)置3個(gè)平行孔，放入37 ℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h。

2.3.2 不同分子量區(qū)間段組分干預(yù) 最佳提取方法組分經(jīng)膜分離技術(shù)得到的不同區(qū)間段組分，分子量≥30 KD、分子量10～30 KD、分子量5～10 KD、分子量1～5 KD、分子量≤1 KD，用適量的DMSO助溶，之后分別用無血清DMEM培養(yǎng)基按10倍梯度稀釋，DMSO最終含量≤0.1%，用0.22 μm濾器過濾除菌即可用于干預(yù)細(xì)胞?？等R特注射液用生理鹽水稀釋15倍后作為母液用，無血清DMEM培養(yǎng)基按10倍梯度稀釋。各組設(shè)3個(gè)濃度。分別將不同分子量區(qū)間段組分及康萊特注射液加入細(xì)胞孔板，分別為分子量≥30 KD組、分子量10～30 KD組、分子量5～10 KD組、分子量1～5 KD組、分子量≤1 KD組、康萊特陽性組、對(duì)照組（含細(xì)胞，不加藥物干預(yù)）、調(diào)零孔（不含干預(yù)藥物、細(xì)胞，其余一致）。每孔100 μL，各組設(shè)置3個(gè)平行孔，放入37 ℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

2.4 MTT法呈色及酶標(biāo)儀檢測(cè) 分別于藥物作用24、48 h各取出1批96孔板進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)。取出96孔板，棄培養(yǎng)基，每孔加入質(zhì)量濃度為5 mg/mL的MTT溶液30 μL，避光繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸出每孔內(nèi)上清液，加入DMSO 150 μL，輕輕振蕩至結(jié)晶充分溶解，用酶標(biāo)儀在540 nm波長(zhǎng)下測(cè)定每孔的吸光度值（A），進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（）表示，計(jì)量資料符合正態(tài)分布且方差齊，采用單因素方差分析進(jìn)行比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 不同提取方法組分干預(yù)結(jié)果 鮮藥組、水煎液組、50%乙醇滲漉組對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞不呈增殖抑制作用。干預(yù)24 h，95%乙醇滲漉組3 600.0 μg/mL、360.0 μg/mL、36.0 μg/mL抑制率分別為46.74%、22.35%、10.49%；康萊特陽性組666.700μg/mL、66.670 μg/mL、6.667 μg/mL抑制率分別為47.75%、36.26%、21.40%。干預(yù)48 h，95%乙醇滲漉組3 600.0 μg/mL、360.0 μg/mL、36.0 μg/mL抑制率分別為47.54%、21.88%、10.05%；康萊特陽性組666.700 μg/mL、66.670 μg/mL、6.667 μg/mL抑制率分別為52.23%、36.90%、22.28%。干預(yù)24 h抑制率與48 h比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見表1、圖1～3）

圖1 不同提取方法組分干預(yù)24 h 抑制率比較 （，n=6）

圖2 不同提取方法組分干預(yù)48 h 抑制率比較 （，n=6）

圖3 95%乙醇滲漉組、康萊特陽性組抑制率曲線圖

表1 不同提取方法的組分OD 值及抑制率比較（，n=6）

表1 不同提取方法的組分OD 值及抑制率比較（，n=6）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.01。

?

3.2 不同分子量區(qū)間段組分干預(yù)結(jié)果 分子量10～30 KD組：3 600 μg/mL抑制率為24.26%，360 μg/mL抑制率為15.05%；分子量≤1 KD組：3 600 μg/mL抑制率為30.81%，360 μg/mL抑制率為19.95%；康萊特陽性組：666.700 μg/mL抑制率為41.06%，66.670 μg/mL抑制率為19.54%。上述各組OD值與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（見表2、圖4）

圖4 干預(yù)24 h 不同分子量區(qū)間段組分抑制率比較（，n=6）

表2 干預(yù)24 h 不同分子量區(qū)間段組分OD 值及抑制率比較（，n=6）

表2 干預(yù)24 h 不同分子量區(qū)間段組分OD 值及抑制率比較（，n=6）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.01，bP＜0.05。

?

分子量≥30 KD組：3 600 μg/mL抑制率為10.12%；分子量5～10KD組：3 600 μg/mL抑制率為10.02%；分子量1～5 KD組：3 600 μg/mL抑制率為10.79%，36 μg/mL抑制率為9.48%；分子量≤1 KD組：36 μg/mL抑制率為8.23%。上述各組OD值與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（見表2、圖4）

4 討論

吉祥草在苗族地區(qū)使用時(shí)大多數(shù)用鮮品，鮮果嚼服也是余甘子的民間常用用藥形式[4]。本研究參照屠呦呦在研究青蒿素過程中查閱古醫(yī)籍的啟示（“青蒿一握，水一升漬，絞取汁服”）及苗族、藏族民間鮮品直接入藥的習(xí)慣，結(jié)合滲漉提取具有常溫狀態(tài)下操作，不容易破壞熱敏性有效成分，能提取完全、節(jié)能的優(yōu)點(diǎn)，在傳統(tǒng)水煎的基礎(chǔ)上同時(shí)設(shè)計(jì)鮮藥榨汁、滲漉法常溫提取藥效成分。不同提取方法組分干預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：鮮藥組、水煎液組、50%乙醇滲漉組對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞不呈增殖抑制作用；95%乙醇滲漉組及康萊特陽性組對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞增殖有抑制作用。這可能預(yù)示抑制Lewis肺癌細(xì)胞增殖的活性成分極性較小，而鮮藥榨汁、水煎煮及50%乙醇提取的成分極性相對(duì)較大。前期對(duì)吉祥草配伍余甘子的研究顯示60%、95%乙醇滲漉組分對(duì)小鼠非小細(xì)胞肺癌有抑制作用，水煎組分無抑制作用[12]。吉祥草的水提組分或水溶性好的成分藥效偏向于止咳、化痰、抗炎[14-16]，而95%乙醇提取組分或在95%乙醇提取組分基礎(chǔ)上用不同溶劑萃取的部位傾向于抗腫瘤的作用[17-24]。余甘子鮮果汁、水提組分以維生素、多糖等極性大的組分為主，含有黃酮類成分和少量的酚酸類成分。其藥效傾向于抗氧化、抗衰老[25]、抗誘導(dǎo)突變[26]、增強(qiáng)免疫力[27]、抗炎[28]。余甘子中的酚酸類成分是其抗腫瘤最主要的活性成分[29-31]。余甘子總酚酸為醇溶性成分，也溶于水，但是95%、70%乙醇組分抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用優(yōu)于水提組分[32]。余甘子中的酚酸類與黃酮類配伍使用，可提高腫瘤抑制率[32-33]。95%乙醇滲漉組及康萊特陽性組的增殖抑制作用呈劑量依賴性，表現(xiàn)為隨著藥物濃度的升高增殖抑制作用增強(qiáng)。本研究結(jié)果表明，95%乙醇滲漉組的增殖抑制最低劑量為36 μg/mL，康萊特陽性組的增殖抑制最低劑量為6.667 μg/mL。綜上所述，95%乙醇滲漉組分對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞有明顯增殖抑制作用，優(yōu)選出提取方法為95%乙醇滲漉法。

本研究根據(jù)藥效物質(zhì)“組合篩選”思路與方法[34]進(jìn)行了不同分子量區(qū)間段組分干預(yù)實(shí)驗(yàn)。多種分離技術(shù)能最大程度去除無效成分，富集有效成分，并以分離產(chǎn)物為“基本構(gòu)造單元”研究“基本構(gòu)造單元”與藥效效應(yīng)的關(guān)系。95%乙醇滲漉組分經(jīng)不同截留分子量的膜分離得到不同分子量區(qū)間段組分，分別為分子量≥30 KD組分、分子量10～30 KD組分、分子量5～10 KD組分、分子量1～5 KD組分、分子量≤1 KD組分。結(jié)果表明，各分子量區(qū)間段組分對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞呈不同程度增殖抑制作用。分子量≥30 KD組、分子量10～30 KD組、分子量5～10 KD組、分子量1～5 KD組、分子量≤1 KD組最高抑制率分別為10.12%、24.26%、10.02%、10.79%、30.81%；分子量≥30 KD組、分子量5～10 KD組、分子量1～5 KD組增殖抑制最低濃度為3 600 μg/mL；分子量10～30 KD組與分子量≤1 KD組增殖抑制最低濃度分別為360、36 μg/mL；分子量10～30KD組與分子量≤1 KD組的增殖抑制作用呈劑量依賴性，表現(xiàn)為隨著藥物濃度的升高增殖抑制作用增強(qiáng)。黃酮類、生物堿類、皂苷類、蒽醌類、酚酸類等成分是“天然組合化學(xué)庫”的主體，其分子量一般小于1 000[35]。綜上所述，分子量10～30 KD組分與分子量≤1 KD組分對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞增殖抑制作用最強(qiáng)；體外細(xì)胞模型優(yōu)選出的最佳分子量區(qū)間段組合為分子量10～30 KD與分子量≤1 KD。