康萊特注射液對Lewis 肺癌小鼠TAM及HIF-1α的影響

閆　哲，彭麗麗，申　婷，張洪珍，2

(1. 河北醫(yī)科大學研究生學院，河北 石家莊 050017；2. 河北省人民醫(yī)院，河北 石家莊 050051)

康萊特注射液對Lewis 肺癌小鼠TAM及HIF-1α的影響

閆哲1，彭麗麗1，申婷1，張洪珍1，2

(1. 河北醫(yī)科大學研究生學院，河北 石家莊 050017；2. 河北省人民醫(yī)院，河北 石家莊 050051)

[摘要]目的研究康萊特注射液對Lewis 肺癌小鼠腫瘤相關巨噬細胞(TAM)及缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)表達的影響。方法將造模成功Lewis 肺癌荷瘤小鼠隨機分為模型組、康萊特組、順鉑組及康萊特+順鉑組，模型組給予生理鹽水腹腔注射，其余組均分別給予相應藥物腹腔注射。干預14 d后處死各組小鼠取瘤組織，流式細胞儀檢測TAM的比例，實時定量PCR檢測HIF-1αmRNA的表達情況。結果康萊特組、順鉑組及康萊特+順鉑組小鼠瘤質量均明顯低于模型組(P均<0.05)；康萊特+順鉑組與順鉑組抑瘤率均明顯高于康萊特組(P均<0.05)，但康萊特+順鉑組與順鉑組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。順鉑組小鼠脾指數明顯低于其他3組(P均<0.05)，康萊特組小鼠脾指數明顯高于其他3組(P均<0.05)，而康萊特+順鉑組與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)?？等R特組和康萊特+順鉑組TAM比例均明顯低于模型組(P均<0.05)，康萊特組和康萊特+順鉑組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，康萊特+順鉑組明顯低于順鉑組(P<0.05)?？等R特組、順鉑組、康萊特+順鉑組HIF-1α表達量均明顯低于模型組(P均<0.05)，康萊特+順鉑組HIF-1α表達量均明顯低于康萊特組、順鉑組(P均<0.05)，而康萊特組與順鉑組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論康萊特注射液具有抗腫瘤作用，與順鉑聯(lián)用可增強化療療效、提高小鼠免疫功能，可能是通過降低TAM水平、改善缺氧實現的。

[關鍵詞]康萊特注射液；Lewis 肺癌；腫瘤相關巨噬細胞；缺氧誘導因子-1α

肺癌在世界范圍內死亡率居惡性腫瘤的首位。鉑類為主的化療藥物在肺癌綜合治療中占有重要地位，但毒副作用限制了其應用。多項研究表明康萊特注射液對化療具有增效減毒作用[1]，但具體機制尚不十分明確。本研究從腫瘤免疫微環(huán)境中腫瘤相關巨噬細胞(TAM)和缺氧微環(huán)境標志之一缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)出發(fā)，研究了康萊特注射液聯(lián)合順鉑對Lewis肺癌荷瘤小鼠的影響及其相關機制，現將結果報道如下。

1實驗資料

1.1動物健康雄性昆明種小鼠，4～6周齡，體質量18～24 g，購自河北省實驗動物中心(動物合格證編號：1409008)，給予常規(guī)飼料喂養(yǎng)，不控制飲水，由河北省人民醫(yī)院臨研中心提供SPF級動物飼養(yǎng)室。

1.2細胞株小鼠Lewis肺癌細胞株，購自河北醫(yī)科大學免疫教研室，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，在37 ℃、5%二氧化碳的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3主要藥品及試劑康萊特注射液購于浙江康萊特藥業(yè)有限公司，國藥準字Z10970091；注射用順鉑購于齊魯制藥有限公司，規(guī)格:10 mg,國藥準字H20023461。四季青胎牛血清為浙江天杭生物科技有限公司產品；DMEM高糖培養(yǎng)液為美國Gibco公司產品。逆轉錄試劑盒購自R&D Systems,Inc.USA。PE-CD11b、FITC-F4/80 mAb購自美國eBioscience公司。

1.4實驗方法

1.4.1模型的建立及分組干預Lewis肺癌細胞株復蘇后傳代，取傳至3～4代生長良好的Lewis肺癌細胞，臺盼藍計數活性>95%，配制細胞濃度為5×107個/mL的細胞懸液，0.2 mL/只注射于小鼠左前腋窩皮下。接種6～7 d后，小鼠左前腋皮下可觸及2～3 mm直徑硬結，證實移植瘤模型建立成功。隔日定時用游標卡尺測量腫瘤最長徑(a)及最短徑(b)，待最長徑為0.8～1 cm時，舍棄腫瘤過大(ab>2.5 cm2) 或過小(ab<0.20 cm2) 的小鼠,挑選腫瘤大小較均一的荷瘤小鼠24只，隨機分為模型組、康萊特組、順鉑組及康萊特+順鉑組，每組6只。模型組給予生理鹽水腹腔注射，其余組均分別給予相應藥物腹腔注射。其中生理鹽水、康萊特注射液按12.5 mL/kg，順鉑按1 mg/kg(將10 mg順鉑溶于125 mL氯化鈉注射液中)每天腹腔注射，兩次注射之間間隔12 h，連續(xù)注射14 d。

1.4.2腫瘤抑制率及脾臟指數計算干預第15天脫頸處死小鼠，完整剝離腫瘤及脾臟，分別稱質量，計算抑瘤率及脾臟指數。抑瘤率= (模型組平均瘤質量-干預組平均瘤質量)/模型組平均瘤質量×100%。脾臟指數=脾質量(mg)/小鼠體質量(g)。

1.4.3腫瘤組織TAM比例檢測將腫瘤組織機械法制備成細胞懸液，加入PE-F4/80+和FITC-CD11b+抗體各2 μL，用流式細胞儀檢測CD11b+ F4/80+細胞含量。

1.4.4腫瘤組織HIF-1αmRNA表達量檢測提取細胞總RNA，電泳鑒定完整性和純度，逆轉錄成cDNA后進行實時熒光定量PCR反應，反應條件：預變性94 ℃ 5 min，變性94 ℃ 30 s，退火58 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s,共30個循環(huán)，后延伸72 ℃ 10 min。按照RQ=2-△△Ct計算HIF-1α mRNA表達水平的RQ值，用于統(tǒng)計分析。GAPDH作內參照，上游引物序列為5’-TGAACGGGAAGCTCACTG-3’，下游為5’-GCTTCACCACCTTCTTGATG-3’，片段長度為121 bp；HIF-1α上游引物序列為5’-TCAAAGTCGGACAGCCTCA-3’，下游為5’-CCCTGCAGTAGGTTTCTGCT-3’，片段長度為90 bp。

2結果

2.1各組小鼠一般情況接種癌細胞后，早期無明顯變化，接種6～7 d后，小鼠左前腋皮下可觸及2～3 mm直徑硬結，皮下移植瘤生長，進食、活動較前減少，毛發(fā)欠光澤，有脫落。第10天絕大部分小鼠腫瘤最長徑0.8～1.0 cm。后期模型組部分荷瘤小鼠反應遲鈍，腫瘤局部皮膚可見點片狀潰爛、滲血、滲液，少數因瘤體積過大而出現左前肢運動障礙。而各給藥組小鼠較模型組小鼠進食多、活動敏捷。

2.2各組腫瘤抑制率比較康萊特組、順鉑組及康萊特+順鉑組小鼠瘤質量均明顯低于模型組(P均<0.05)；康萊特+順鉑組與順鉑組抑瘤率均明顯高于康萊特組(P均<0.05)，但康萊特+順鉑組與順鉑組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1　各組小鼠瘤質量及腫瘤抑制率比較

注：①與模型組比較，P<0.05；②與康萊特組比較，P<0.05。

2.3各組小鼠脾臟指數比較模型組、康萊特組、順鉑組、康萊特+順鉑組脾臟指數分別為(7.31±1.50)mg/g、(9.70±1.53)mg/g、(4.58±1.29)mg/g、(6.54±1.68)mg/g 。順鉑組小鼠脾指數明顯低于其他3組(P均<0.05)，康萊特組小鼠脾指數明顯高于其他3組(P均<0.05)，而康萊特+順鉑組與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.4各組腫瘤組織TAM比例模型組、康萊特組、順鉑組、康萊特+順鉑組TAM比例分別為(6.41±1.73)%、(4.27±1.44)%、(6.52±1.77)%、(4.08±0.67)%。康萊特組和康萊特+順鉑組TAM比例均明顯低于模型組(P均<0.05)，康萊特組和康萊特+順鉑組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，康萊特+順鉑組明顯低于順鉑組(P<0.05)。雙染色流式細胞儀檢測結果見圖1～4。

圖1　模型組腫瘤組織TAM比例

圖2　康萊特組腫瘤組織TAM比例

圖3　順鉑組腫瘤組織TAM比例

圖4　康萊特+順鉑組腫瘤組織TAM比例

2.5各組腫瘤組織中HIF-1αmRNA表達情況模型組、康萊特組、順鉑組、康萊特+順鉑組HIF-1αmRNA表達量分別為2.47±0.57，1.59±0.39，1.76±0.49，1.03±0.21?？等R特組、順鉑組、康萊特+順鉑組HIF-1α表達量均明顯低于模型組(P均<0.05)，康萊特+順鉑組的HIF-1α表達量均明顯低于康萊特組、順鉑組(P均<0.05)，而康萊特組與順鉑組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

3討論

隨著醫(yī)學科學的發(fā)展和醫(yī)療水平的提高，肺癌的治療已從單一方法治療逐步發(fā)展成手術、放化療、靶向治療、免疫治療等綜合治療[2]。2006年世界衛(wèi)生組織將包括肺癌在內的惡性腫瘤的定位從“不治之癥”轉變?yōu)椤翱梢钥刂频穆约膊　盵3]，但肺癌患者確診時30%～40%已是局部晚期，40%有遠處轉移，整體5年生存率并未隨治療手段的多樣化而顯著改善，其原因也與治療主要著眼于腫瘤細胞本身，而極少考慮其所處微環(huán)境有關。腫瘤微環(huán)境包括腫瘤細胞及其周圍的成纖維細胞、固有及特異性免疫細胞(中性粒細胞、巨噬細胞、肥大細胞、淋巴細胞等)、血管和淋巴管結構的組成細胞(上皮細胞、內皮細胞、毛細血管外膜細胞等) 及細胞外基質蛋白、生長因子和細胞因子等[4]，腫瘤的發(fā)生發(fā)展與其關系密切，按照其特點可分為腫瘤缺氧微環(huán)境、腫瘤酸性微環(huán)境及腫瘤免疫微環(huán)境。

TAM是腫瘤免疫微環(huán)境中數量最多的免疫細胞群，主要由外周循環(huán)中的單核細胞在多種趨化因子作用下招募至腫瘤組織，并分化增殖而來，在腫瘤微環(huán)境中，TAM具有抑制免疫、促進血管生成和組織重塑的作用[5]。研究認為TAM通過誘導多種生長因子如血管內皮生長因子(VEGF)、轉化生長因子-β(TGF-β)、促進細胞外基質降解、介導免疫逃逸、促進血管和淋巴管生成等方式，促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉移，導致不良預后[6]；其還可通過削弱Caspase凋亡信號通路[7]、高表達半胱氨酸組織蛋白酶[8]等途徑參與化療耐藥。HIF-1是在缺氧條件下廣泛存在于哺乳動物細胞核中的一種具有轉錄活性的核蛋白，由功能型α亞基和構成型β亞基組成，其生物效應由α亞基完成。HIF-1α通過激活下游靶基因如促紅細胞生成素(EPO)、葡萄糖載體蛋白1,3(GLUT1,3)、p53等，影響腫瘤及周圍組織的血管發(fā)生、紅細胞生成、糖代謝、細胞凋亡、上皮間質化等[9-10]，或調節(jié)酶活性降低活性氧簇(ROS)水平[11]促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉移。

近年來，“補充替代醫(yī)學”在惡性腫瘤的治療中應用越來越廣泛，中藥作為補充替代醫(yī)學的一大主要形式正逐步被廣泛應用?？等R特注射液是目前臨床用于肺癌的中藥制劑之一，提取自傳統(tǒng)利水滲濕類中藥薏苡仁，大量的基礎和臨床研究證實康萊特注射液具有抗腫瘤、化療增效減毒[11]、增強免疫、提高生活質量[12]等作用，有關機制涉及降低耐藥相關因子MDR1/P-gp、NF-κB/IκB等的水平，阻斷有絲分裂，促腫瘤細胞凋亡，抑制血管和淋巴管生成，抑制COX-2表達等。本實驗結果顯示，康萊特+順鉑組與順鉑組抑瘤率均明顯高于康萊特組，但康萊特+順鉑組與順鉑組比較差異無統(tǒng)計學意義；順鉑組小鼠脾指數明顯低于其他3組，康萊特組小鼠脾指數明顯高于其他3組，而康萊特+順鉑組與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義；康萊特組和康萊特+順鉑組TAM比例均明顯低于模型組，康萊特組和康萊特+順鉑組比較差異無統(tǒng)計學意義，康萊特+順鉑組明顯低于順鉑組；康萊特組、順鉑組、康萊特+順鉑組HIF-1α表達量均明顯低于模型組，康萊特+順鉑組HIF-1α表達量均明顯低于康萊特組、順鉑組，而康萊特組與順鉑組比較差異無統(tǒng)計學意義。

提示康萊特注射液單用及與順鉑聯(lián)用均可抑制腫瘤生長，能降低Lewis肺癌組織中TAM比例及HIF-1αmRNA表達量，兩者聯(lián)合應用效果更明顯，且康萊特注射液與順鉑聯(lián)用可顯著升高脾臟指數，說明康萊特除本身具有抗腫瘤作用外，還可改善化療藥物所致的免疫抑制。

綜上所述，康萊特注射液的抗腫瘤機制可能是通過提高機體免疫功能、降低腫瘤微環(huán)境中的TAM水平、改善缺氧實現的。

[參考文獻]

[1]Liu X,Yang Q,Xi Y,et al. Kanglaite injection combined with c-hemotherapy versus chemotherapy alone in the treatment of advanced non-small cell lung carcinoma[J]. J Cancer Res Ther,2014,10(Suppl 1):46-51

[2]Siegel R,Ma J,Zou Z,et al. Cancer Statistics, 2014[J]. CA Cancer J Clin,2014,64(1):9-29

[3]孫燕. 進一步提高中西醫(yī)結合防治腫瘤的臨床研究水平[J]. 中國新藥雜志,2011,20(17):1588-1591；1611

[4]Yang JD,Nakamura I,Roberts LR. The tumor microenvironment in hepatocellular carcinoma: current status and therapeutic targets[J]. Semin Cancer Biol,2011,21(1):35-43

[5]Mantovani A,Germano G,Marchesi F,et al. Cancer-promoting tumor-associated macrophages:new vistas and open questions[J]. Eur J Immunol,2011,41(9):2522-2525

[6]Qian BZ,Pollard JW. Macrophage diversity enhances tumor progression and metastasis[J]. Cell,2010,141(1):39-51

[7]Zheng Y,Cai Z,Wang S,et al. Macrophages are an abundant component of myeloma microenvironment and protect myeloma cells from chemotheropy drug-induced apoptosis[J]. Blood,2009,114(17):3625-3628

[8]Shree T,Olson OC,Elie BT,et al. Macrophages and cathepsin proteases blunt chemotherapeutic response in breast cancer[J]. Genes Dev,2011,25(29):2465-2479

[9]Lei Wang,Young-Ok Son,Songze Ding,et al. Ethanol Enhances Tumor Angiogenesis In Vitro Induced by Low-Dose Arsenic in Colon Cancer Cells Through Hypoxia-Inducible Factor 1 Alpha Pathway[J]. Toxicol Sci,2012,130(2):269-280

[10] Xu Z,Liu E,Peng C,et al. Role of hypoxia-inducible-1α in hepatocellular carcinoma cells using a Tet-on inducible system to regulate its expression in vitro[J]. Oncol Rep,2012,27(2):573-578

[11] Guan D,Su Y,Li Y,et al. Tetramethylpyrazine inhibits CoCl2 -induced neurotoxicity through enhancement of Nrf2/GCLc/GSH and suppression of HIF1α/NOX2/ROS pathways[J]. J Neurochem,2015,134(3):551-565

[12] 楊曉玲. 康萊特注射液對晚期惡性腫瘤患者生活質量及免疫功能影響的臨床觀察[J]. 山西中醫(yī),2013,29(11):20-21

Effects of Kanglaite injection on TAM and expression of HIF-1α in vivo in Lewis lung carcinoma mice

YAN Zhe1, PENG Lili1, SHEN Ting1, ZHANG Hongzhen1,2

(1. Graduate School of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, Hebei, China；2. Hebei General Hospital, Shijiazhuang 050051, Hebei, China)

Abstract:Objective It is to investigate the effects of Kanglaite injection (KLT) on tumor associated macrophage (TAM)and expression of hypoxia inducible factor-1 alpha(HIF-1α) in Kunming mice with Lewis lung carcinoma. Methods The models sucessfully established of Kunming mice with Lewis lung carcinoma were randomly divided into four groups: the control (NS)group, KLT group, cisplatin(DDP) group and DDP+KLT group. Tumors were harvested 14 days after corresponding interventions. The percentage of TAM was determined by flow cytometry and HIF-1αmRNA was detected by realtime-PCR. Results Tumor weight of mice in KLT group, DDP group and DDP+KLT group was significantly lower than that of NS group(P<0.05); Tumor growth inhibition rate in DDP+KLT group was higher than DDP group,without statistical significance(P>0.05). The spleen index was lower in DDP group than in NS group(P<0.05),but was significantly increased when combined with KLT (P<0.05). The percentage of TAM was higher in DDP group than in NS group, but was not statistically significant(P>0.05), and the combination with KLT significantly decreased the percentage(P<0.05). Expression of HIF-1αwas lower in KLT group,DDP group and DDP+KLT group than in NS group,and it decreased more in DDP+KLT group(P<0.05). Conclusion KLT has pronounced antitumor activity in mice with Lewis lung carcinoma.It enhances the chemotherapy effect and improve immunity function when combined with cisplatin,which can be accomplished by decreasing the TAM level and improving hypoxia status.

Key words:Kanglaite; Lewis lung carcinoma；tumor associated macrophage; hypoxia inducible factor-1α

[作者簡介]閆哲，女，碩士，研究方向為放療為主的惡性腫瘤綜合治療。 [通信作者]張洪珍，E-mail: 1256596529@qq.com

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.10.007

[中圖分類號]R-332

[文獻標識碼]A

[文章編號]1008-8849(2016)10-1047-04

[收稿日期]2015-10-30