優(yōu)選本土乳酸菌-酵母接種時序?qū)δM紅葡萄汁混菌發(fā)酵特性的影響

姜 嬌，史學(xué)容，柴夢淼，黃 蓉，張艾霞，宋育陽，秦 義，劉延琳*

（1 西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院 陜西楊凌712100 2 陜西省葡萄與葡萄工程技術(shù)研究中心 陜西楊凌712100 3 西北農(nóng)林科技大學(xué)寧夏賀蘭山東麓葡萄酒試驗示范站 寧夏永寧 750104）

傳統(tǒng)優(yōu)質(zhì)紅葡萄酒的釀造在酒精發(fā)酵（Alcoholic fermentation，AF）結(jié)束后往往需要自發(fā)或接種乳酸菌進(jìn)行蘋果酸-乳酸發(fā)酵（Malolactic fermentation，MLF）。乳酸菌的生長通常會受到酵母代謝物及惡劣的葡萄酒生境的脅迫，導(dǎo)致MLF 周期的延長[1]，如高酒精度會導(dǎo)致MLF 難以啟動、發(fā)酵緩慢、甚至中止。MLF 管理不當(dāng)還可能會產(chǎn)生一些葡萄酒不良代謝物，如生物胺等，嚴(yán)重影響了酒廠的經(jīng)濟效益，制約了葡萄酒行業(yè)的發(fā)展。將乳酸菌提前接入發(fā)酵體系，不僅可以促進(jìn)乳酸菌盡快適應(yīng)葡萄酒環(huán)境，確保發(fā)酵的順利進(jìn)行，還能夠最大化地保留各菌株的發(fā)酵特征[2]，對縮短葡萄酒釀造周期具有十分重要的現(xiàn)實意義。

混菌發(fā)酵時接種順序是影響發(fā)酵酒質(zhì)量的重要因素之一，除了傳統(tǒng)的順序接種外，乳酸菌還可與酵母同時、在AF 前、在酵母接種24 h 后、在AF進(jìn)行約2/3 時接種于發(fā)酵液中[3]，且不同的接種順序?qū)w數(shù)目的影響也存在差異。Lucio 等[4]在葡萄汁接種乳酸菌3 d 后接種釀酒酵母，測定菌株生長動力學(xué)，發(fā)現(xiàn)在酵母前接種乳酸菌較常規(guī)發(fā)酵而言，酵母會更早發(fā)生衰亡。適宜的接種順序還可能助于豐富葡萄酒的風(fēng)味結(jié)構(gòu)，提高葡萄酒的品質(zhì)[5-7]。Lucio 等[4]在混菌發(fā)酵結(jié)束后還檢測了pH值、乳酸、檸檬酸、蘋果酸等物質(zhì)的含量，發(fā)現(xiàn)最終葡萄酒酸度有所增加。王嘉偉[8]的研究表明乳酸菌-酵母菌共發(fā)酵蘋果酒時，能顯著降低果酒總酸含量，柔化果酒的口感，明顯提升其口感。這表明乳酸菌接種時序?qū)企w總酸的影響較為復(fù)雜，還需進(jìn)一步探究。另外，混合發(fā)酵能夠有效促進(jìn)丙酮酸和乙醛的合成，增加錦葵色素衍生花色苷（Vitisins）的含量，從而改善葡萄酒顏色的作用[9]。袁曉龍等[10]發(fā)現(xiàn)混菌發(fā)酵的不同接種順序?qū)婢苹A(chǔ)理化指標(biāo)及顏色等品質(zhì)指標(biāo)的影響存在差異。因此，明確乳酸菌接種時序?qū)ζ咸丫漆勗斓挠绊?，是研發(fā)混菌發(fā)酵配套工藝技術(shù)體系的重要內(nèi)容。

本研究采用商業(yè)釀酒酵母與3 株優(yōu)選乳酸菌以不同組合、不同順序接種于模擬紅葡萄汁中，定時監(jiān)控發(fā)酵進(jìn)程，測定發(fā)酵后部分理化指標(biāo)和花色苷含量的變化，對應(yīng)分析CIELab 顏色參數(shù)，尋找二者之間的相關(guān)性，綜合探究不同菌株組合及接種方式對葡萄酒理化指標(biāo)及酒樣顏色的影響。本研究通過優(yōu)化葡萄酒釀造工藝，優(yōu)選出最佳的酵母-本土乳酸菌的混菌發(fā)酵接種方式，縮短發(fā)酵周期，降低釀造成本，推動酵母-本土乳酸菌混菌發(fā)酵的實際應(yīng)用，為我國葡萄酒產(chǎn)區(qū)釀造獨特風(fēng)格的干紅葡萄酒提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株 商業(yè)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CECA，安琪酵母有限公司；本土優(yōu)選植物乳桿菌（Lactiplantibacillus plantarum）6-20[11]、本土優(yōu)選酒酒球菌（Oenococcus oeni）GZC3[12]，均源于西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院微生物種質(zhì)資源室；商業(yè)植物乳桿菌V22，科漢森有限公司。

1.1.2 試劑 蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；瓊脂，北京索萊寶科技有限公司；葡萄糖、磷酸氫二鉀、檸檬酸氫二銨、七水合硫酸鎂、硫酸錳、放線菌酮，Sigma Aldrich 公司；吐溫80，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；天然葡萄皮色素，San Jqaquin 公司；蘋果酸試劑盒（KLAL-116A），Megazyme 公司。

1.1.3 儀器 Elx800 酶標(biāo)儀，美國BioTek 公司；SX-500700 高壓蒸汽滅菌鍋，日本TOMY 公司；UV1800 紫外-可見分光光度計，日本島津公司；MQL-61R 恒溫培養(yǎng)箱，上海旻泉儀器有限公司；PB-10 pH 計，德國Sartorius 公司；6890-5975 液相色譜儀，德國安捷倫公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 配制模擬紅葡萄汁培養(yǎng)基 在模擬白葡萄汁[13]的基礎(chǔ)上，添加10 g/L 天然葡萄皮色素，混勻，制成模擬紅葡萄汁，調(diào)整其糖含量為200 g/L、蘋果酸為3 g/L、總酚和總花色苷均為2 276 mg/L，pH 值為3.8，0.22 μm 過濾除菌后待用。

1.2.2 種子液制備 取-80 ℃冰箱保藏的酵母及乳酸菌的甘油保藏液，分別劃線于YPD 和MRS固體培養(yǎng)基，其中MRS 培養(yǎng)基添加20 μg/mL 放線菌酮，以排除真菌對乳酸菌生長的干擾。酵母菌在30 ℃、150 r/min 搖床培養(yǎng)24 h，乳酸菌在25 ℃靜置培養(yǎng)48 h 后，分別挑取形態(tài)整齊的單菌落轉(zhuǎn)接于50 mL YPD 液體和MRS 液體培養(yǎng)基中，用與上述相同培養(yǎng)條件制成種子液備用。

1.2.3 發(fā)酵方案 酵母菌與乳酸菌接種量均控制在2×106CFU/mL 左右，按表1 方案分別接種于150 mL 的紅模擬葡萄汁中。

表1 接種方案Table 1 Inoculation modalities

1.2.4 發(fā)酵監(jiān)測 發(fā)酵期間，每24 h 使用DNS 比色法[14]測定還原糖含量，待殘?zhí)呛啃∮? g/L 且不再降低時視為酒精發(fā)酵結(jié)束。每48 h 取酒樣進(jìn)行梯度稀釋（10-1，10-2，10-3，10-4，10-5）后，用于計菌落數(shù)，其中酵母菌用YPD 固體培養(yǎng)基平板進(jìn)行計數(shù)，乳酸菌用添加20 mg/L 放線菌酮的MRS 培養(yǎng)基平板進(jìn)行計數(shù)。將點涂稀釋菌液后的平板置于37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)后計算菌落數(shù)。在發(fā)酵的4個關(guān)鍵時期（啟酵前、發(fā)酵初期、發(fā)酵旺盛期及發(fā)酵末期）進(jìn)行取樣，使用蘋果酸試劑盒測蘋果酸含量變化。發(fā)酵結(jié)束后參照GB/T 15038 -2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》分析酒樣的總酸、揮發(fā)酸、pH 值等指標(biāo)[15]；使用福林酚法[16]測定總酚含量；pH 示差法[17]進(jìn)行總花色苷含量的測定；CIELab 相關(guān)參數(shù)參考李運奎等[18]的方法測定。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 使用Microsoft Office Excel 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計；IBM SPSS Statistics 22 軟件進(jìn)行One-Way ANOVA 顯著性分析；Prism 8.0.1 軟件繪制數(shù)據(jù)圖；Adobe Photoshop CS6 軟件模擬酒樣的特征顏色。

2 結(jié)果與分析

2.1 混菌發(fā)酵過程檢測

首先探究了乳酸菌-酵母混菌發(fā)酵對AF 的影響。所有處理最終酒樣殘?zhí)蔷陀?.0 g/L（圖1），說明AF 順利完成，且乳酸菌的接入時間不影響AF 順利完成，這與Massera 等[19]和閆彬等[20]的結(jié)果一致。乳酸菌的接種時間會影響AF 的發(fā)酵周期，如多數(shù)處理在15 d 左右完成AF，然而B2+Y/2 d 與B2+Y/4 d（圖1e）處理AF 耗時延緩2～4 d。與發(fā)酵周期相對應(yīng)，上述2 個處理的酵母菌落水平也始終低于其它處理（圖1b），這說明本土乳酸菌菌株6-20（B2）可能抑制酵母菌的生長。此外，不同混菌組合在AF 不同階段的發(fā)酵速率也存有差異。比如，相較于CECA 純種發(fā)酵，AF 前接種乳酸菌會減緩酵母的起酵，而一旦進(jìn)入AF 旺盛期后發(fā)酵速率則顯著加快（圖1a、圖1c），表明酵母-乳酸菌菌株間的相互作用會影響酵母發(fā)酵速率，這與King 等[21]的結(jié)果一致。

圖1 不同發(fā)酵處理后酵母菌數(shù)（a～c）與糖含量（d～f）變化Fig.1 Changes in yeast count（a-c）and sugar content（d-f）after different fermentation treatments

L-蘋果酸是葡萄酒產(chǎn)生強烈尖酸味的重要組分之一，其在葡萄酒發(fā)酵期間的變化是衡量蘋乳發(fā)酵是否啟動和完成的重要依據(jù)[22]。在探究混菌發(fā)酵對MLF 發(fā)酵的影響（圖2）時發(fā)現(xiàn)，各混菌發(fā)酵組對MLF 在不同階段的發(fā)酵速率也存在差異，乳酸菌的接種時間會顯著影響L-蘋果酸的降解速率。如在AF 發(fā)酵結(jié)束后，先接種乳酸菌4 d 后接種酵母菌時，L-蘋果酸含量降解速率更為徹底，由最初的3 g/L 降到0.3 g/L 左右（圖2d、2e、2f）；而在先接種酵母的發(fā)酵中，L-蘋果酸含量僅降至0.5 g/L 左右（圖2d、2e、2f），說明先接種乳酸菌更有利于MLF 的進(jìn)行。此外，MLF 與AF 同時進(jìn)行的發(fā)酵中，AF 發(fā)酵結(jié)束后，L-蘋果酸含量約為0.5 g/L 左右（圖2d、2e、2f），而先接種乳酸菌發(fā)酵組的L-蘋果酸的降解更為徹底，表明先接乳酸菌組的MLF 時長相對先接酵母菌發(fā)酵組的較短。這是由于隨著AF 發(fā)酵的進(jìn)行，酵母的發(fā)酵活力的不斷提高，酒精含量逐漸增加，強化了對乳酸菌的生長的脅迫，使得MLF 發(fā)酵速率變慢，從而導(dǎo)致后接乳酸菌蘋果酸降解速率始終低于其它處理。發(fā)酵期間乳酸菌菌落水平間也存在差異，在整個發(fā)酵期間商業(yè)乳酸菌V22（B1）和本土乳酸菌GZC3（B3）的菌落數(shù)變化趨勢大致相似（圖2a、2c），而本土乳酸菌6-20（B2）的菌落數(shù)在發(fā)酵旺盛期明顯高于另外2 株（圖2b），表明酵母對菌株6-20 的抑制作用更小。另外，相同接種方式下引起乳酸菌菌落數(shù)及發(fā)酵速率差異的潛在原因，除了乳酸菌與酵母的相互作用外，還可能與菌株特異性相關(guān)[23-24]。

圖2 不同發(fā)酵處理下乳酸菌數(shù)（a～c）與蘋果酸含量（d～f）變化Fig.2 Changes in the number of lactic acid bacteria（a-c）and malic acid content（d-f）under different fermentation treatments

由圖1、圖2 綜合可知，各處理的發(fā)酵曲線均正常，大多數(shù)處理發(fā)酵結(jié)束時的殘?zhí)?、蘋果酸符合國標(biāo)（GB/T 15037-2006《葡萄酒》）要求，說明本試驗所使用3 株乳酸菌與釀酒酵母之間存在良好適配性，在發(fā)酵時間充足時均能夠順利完成發(fā)酵。先接乳酸菌的處理中酵母菌落水平始終較低，AF 較其它接種方式緩慢，更有利于MLF 迅速進(jìn)行；先接酵母菌則有相反的結(jié)果，這與李憑等[25]的研究結(jié)果一致。乳酸菌與酵母同時接種情況下，其AF與MLF 速率均較高，原因可能是相同數(shù)量級的乳酸菌與酵母同時接入，各菌株所需的營養(yǎng)物質(zhì)比其它接種方式中更豐富，更利于菌株間的協(xié)同作用的發(fā)生[26]，在一定程度上還可以抵消不同菌株之間的競爭造成的負(fù)面影響。

2.2 理化指標(biāo)

2.2.1 常規(guī)理化指標(biāo) 發(fā)酵結(jié)束后對酒樣的基本理化指標(biāo)進(jìn)行測定（表2），不同發(fā)酵處理間的總酸、揮發(fā)酸含量存在顯著差異。各發(fā)酵組的總酸含量在4.66～5.25 g/L（以酒石酸計）之間，揮發(fā)酸含量則為0.32～0.55 g/L（以乙酸計），均符合葡萄酒國家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 15037-2006《葡萄酒》）。乳酸菌的接種時間對葡萄酒酸度的影響也存在差距，除Y+B3/2 d、Y+B3/4 d 外，其余先接酵母處理組的總酸含量均低于對應(yīng)菌株同時接種及先接乳酸的處理；此外，先接乳酸菌后酵母菌的接入時間越遲，其酒樣的總酸含量越高；而較Y 處理（4.48 g/L）而言，雖然Y+B2、Y+B3/2 d 和Y+B3/4 d 總酸有所增加，但無顯著差異，表明混菌發(fā)酵體系中越早接入乳酸菌，最終葡萄酒的酸度就越高。不同的乳酸菌菌株對葡萄酒酸度的影響也大不相同，如在各混菌發(fā)酵組中，Y+B1、B1+Y/2 d、Y+B3/2 d、B3+Y/2 d 與B3+Y/4 d 的揮發(fā)酸含量均高于Y，且彼此間存在顯著差異；而其它處理的揮發(fā)酸均與低于或等于Y，這表明酒酒球菌GZC3（B3）與2 株植物乳桿菌相比，混菌發(fā)酵時更易產(chǎn)揮發(fā)酸，這與Valdés 等[27]和Lucio 等[28]的研究結(jié)果一致。

表2 不同處理酒樣的理化指標(biāo)Table 2 Physiochemical parameters of wines using different inoculation approaches

2.2.2 總酚與總花色苷 紅葡萄酒酚類物質(zhì)是顏色和風(fēng)味的重要指標(biāo)，也是葡萄酒的研究熱點之一。本研究不同處理間的總酚及花色苷含量存在差異（圖3），所有處理的總酚與花色苷質(zhì)量濃度均低于初始質(zhì)量濃度（2 276 mg/L 與885 mg/L），總酚含量最高的為Y+B3/2 d 處理（2 001.27 mg/L），含量最低的是B1+Y/4 d 處理（1 717.10 mg/L）。與Y 處理（1 901.88 mg/L）相比，大部分處理的總酚水平下降，可能是發(fā)酵過程中乳酸菌代謝釋放的丙酮酸、乙醛等次級產(chǎn)物到發(fā)酵體系中，與發(fā)酵液中的多酚類物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，合成聚合色素等大分子衍生物[29-30]。不同菌株在相同發(fā)酵體系的總酚含量也存在差異。如6-20 與GZC3 參與的混菌發(fā)酵組的總酚水平較Y 顯著下降；而V22 相關(guān)的混菌發(fā)酵的總酚水平與Y 的差異較小。

圖3 不同處理酒樣的總酚與總花色苷含量Fig.3 Total phenols and total anthocyanins content of wines samples with different treatments

花色苷與紅葡萄酒酒體顏色具有很強的相關(guān)性。不同處理間的總花色苷含量在不同但差異不顯著（圖3）。其中，Y+B3/2 d 處理花色苷含量最高，為690.10 mg/L，含量最低的是B3+Y/2 d 處理（560.65 mg/L），而絕大多數(shù)處理的花色苷含量與Y 處理（656.98 mg/L）相近?；ㄉ蘸繙p少的原因可能是AF 期間酵母與花色苷發(fā)生聚合反應(yīng)，對花色苷產(chǎn)生吸附作用[31]。相比之下，B2 與酵母菌無論以任何方式接種，對總花色苷的含量影響都很小。

2.2.3 CIELab 顏色參數(shù) 葡萄酒的質(zhì)量與紅葡萄酒的色彩強度呈正相關(guān)[32]，而葡萄酒的顏色主要取決于酒體中的花色苷、酚類物質(zhì)、單寧的水平[33]，花色苷含量會影響葡萄酒的CIELab 顏色參數(shù)[34]。CIELab 三維空間坐標(biāo)包括亮度（L*）、紅/綠顏色參數(shù)（a*）和黃/藍(lán)顏色參數(shù)（b*）。其中，L*與葡萄酒的顏色深淺相關(guān)，a*、b*值與顏色的強度高低及顏色飽和度相關(guān)[35]。

由表3 可知，各酒樣間的亮度L*差異最為顯著，B1+Y/4 d 處理的亮度最高為22.4，顏色最明亮；B3+Y/2 d 處理的亮度最低，顏色最暗；而Y 處理為14.6，顏色適中。a*大部分在40.0 左右且彼此間存在差異顯著，說明各酒樣酒體顏色紅色調(diào)占比較大。b*整體較低，在3.8～18.2 之間，說明酒體顏色中黃色分量較小，且差異并不顯著。雷用東等[31]曾表示C*ab值越大，酒顏色越集中，色彩飽和度越高，而本試驗中不同處理間C*ab約在30～51.2之間且無顯著差異，表明酒樣的色度較分散，色彩飽和性較低。此外，不同處理間色調(diào)hab均低于30°，說明酒體顏色傾向于新紅葡萄酒的紫紅色。而總色差△E*ab表示酒樣間顏色總體差異程度，其值越大，差異越顯著，一般來說，6 以上的色差將帶來強烈的色彩差異感[36]。本試驗中各處理與Y處理的色差值在3.2～19.4 之間，說明不同菌株及接種順序處理的酒體顏色存在顯著差異。

表3 不同處理酒樣的CIELAB 參數(shù)Table 3 CIELAB parameters of wines using different inoculation approaches

CIELab 參數(shù)只能給出酒樣顏色參數(shù)，并無法對酒樣顏色進(jìn)行直觀表征，因此使用Photoshop 軟件對酒樣的顏色進(jìn)行模擬（圖4）。除B3+Y/2 d 和B3+Y/4 d 外，其它處理較Y 處理酒樣顏色偏紅；同時接種及先接酵母菌的處理，其酒樣顏色普遍比先接乳酸菌處理的明亮，且傾向于紅色。此外，相同接種方式下不同菌株對紅葡萄酒顏色的影響也不同，如接入V22（B1）與6-20（B2）的處理，其顏色普遍比接種GZC3（B3）的處理更顯明亮，這與L*、a*、b*所呈現(xiàn)出來的結(jié)果相符合。

圖4 不同處理酒樣的特征顏色圖Fig.4 Feature color of wines with different treatments

2.2.4 總酚、總花色苷含量與顏色參數(shù)的相關(guān)性

由表4 可知，不同接種方式下的葡萄酒的CIElab 參數(shù)之間有一定的相關(guān)性，總酚與總花色苷含量間雖存在顯著相關(guān)性，但與各個CIELab 顏色參數(shù)不存在顯著關(guān)系，而與C*ab參數(shù)間的相關(guān)性很強，L*與a*、b*、C*ab及hab無顯相關(guān)性，而a*、b*、C*ab及hab間存在極顯者正相關(guān)，說明葡萄酒顏色越紅、越深，酒體越傾向于瓦紅或磚紅，這與李運奎等[18]的研究結(jié)果一致。

表4 總酚含量、總花色苷含量與CIELAB 參數(shù)的相關(guān)系數(shù)Table 4 Pearson correlation coefficients between total phenols and total anthocyanins and CIELAB parameters

3 結(jié)論

本試驗所選菌株各混菌組合間具有良好適配性，相關(guān)指標(biāo)均符合國家葡萄酒標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 15037-2006《葡萄酒》）。相比于傳統(tǒng)的順序發(fā)酵而言，先接種乳酸菌的組合有利于MLF 迅速進(jìn)行，反之則更利于AF；同時接入二者對AF 和MLF 無顯著影響。酒樣顏色受菌株組合和接種方式顯著影響，其中乳酸菌與酵母同時接種的處理，酒樣顏色普遍比先接種乳酸菌的處理明亮。未來可進(jìn)一步探索本土乳酸菌與酵母菌的接種方式及接種比例復(fù)合效果對葡萄酒品質(zhì)的影響，以期探索更多節(jié)約釀造時間，降低釀造成本最優(yōu)的混菌發(fā)酵工藝，為釀造具有本土產(chǎn)區(qū)區(qū)域特色風(fēng)格的干紅葡萄酒提供理論依據(jù)。