水產(chǎn)品中氯霉素酶聯(lián)免疫吸附分析法的構建與應用

張 彪，蔡丹鳳，姚天擇，郎一涵，傅炎勇，申屠旭萍，俞曉平

（1 中國計量大學生命科學學院 杭州310018 2 杭州銘治醫(yī)學檢驗實驗室有限公司 杭州 310020）

氯霉素（Chloramphenieol，CAP）作為廣譜抑菌抗生素，曾作為特效藥應用于治療人類的傷寒、副傷寒及敏感菌所致的嚴重感染性疾病[1]，也曾作為畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖投入品，多用于畜禽、水產(chǎn)品中厭氧菌感染和敏感微生物所致各種感染性疾病[2-4]。消費者長期使用氯霉素易引起造血系統(tǒng)、消化系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)疾??；氯霉素殘留易誘發(fā)致病菌的耐藥性，且經(jīng)食物鏈被攝入消費者體內(nèi)后，長期慢性積累后具有潛在的危害[5-7]。因此，歐美等國家已明令禁止使用氯霉素，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部也相繼發(fā)布并完善了《食品動物禁用的獸藥及其它化合物清單》《動物性食品中獸藥最高殘留限量》，規(guī)定氯霉素不得用于食品和動物，動物性食品中不得檢出氯霉素[8-9]。然而，由于利益的驅(qū)使以及檢測難度大，動物性食品特別是水產(chǎn)品中氯霉素非法使用問題未得到有效控制和解決，仍然較為突出。因此開發(fā)一種操作簡單、檢測快速、高效靈敏的氯霉素分析方法顯得極為重要。

目前，氯霉素的分析方法主要有高效液相色譜法（HPLC）[10]、氣相色譜法（GC）[11]、液質(zhì)聯(lián)用法（LC-MS/MS）[12]、氣質(zhì)聯(lián)用法（GC-MS）[13]、微生物法[14]和酶聯(lián)免疫分析法[15-17]。液相與氣相色譜法分析氯霉素，檢測樣本少，難以實現(xiàn)大規(guī)模樣品檢測；與前兩種色譜法相比，液質(zhì)聯(lián)用法和氣質(zhì)聯(lián)用法雖然靈敏度高，檢測限低，但需要專業(yè)化人員操作，儀器成本和維護費用昂貴，不宜大規(guī)模應用；微生物法操作時間長且誤差大，靈敏度不高，難以大規(guī)模普及應用[18-19]。因此，急需開發(fā)一種檢測成本低、檢測效率高的氯霉素快速檢測方法。

近年來，抗體-抗原免疫分析技術因具有靈敏度高、檢測成本低、產(chǎn)品可商業(yè)化及可實現(xiàn)現(xiàn)場即時檢測等優(yōu)點，而成為最具有發(fā)展和應用前景的痕量分析技術之一[20]。本研究利用氯霉素抗體與抗原，系統(tǒng)優(yōu)化工作條件，構建氯霉素的間接競爭酶聯(lián)免疫吸附測定法（ic-ELISA），并應用水產(chǎn)品中氯霉素殘留量的快速檢測，以期為其它小分子目標物酶聯(lián)免疫吸附測定法的開發(fā)，動物性食品中氯霉素的快速檢測提供高效的檢測手段。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

氯霉素，德國Dr.Ehrenstorfer 公司；氯霉素抗體，天津泰進科技有限公司；卵清白蛋白（OVA）、牛血清白蛋白（BSA）、過氧化氫脲、3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB），Sigma 公司；氯霉素包被原（CAP-OVA）實驗室制備；其它試劑均為分析純級。

Genics 酶標儀，TECAN 公司；96 孔酶標板，丹麥Nunc 公司；Millipore/Rios8 超純水系統(tǒng)，法國Millipore 公司；CP80WX 超速離心機，日本日立公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 包被原添加量和抗體稀釋倍數(shù)的優(yōu)化 96微孔板每孔包被原的添加量依次為0.01，0.05，0.10 μg，抗體稀釋倍數(shù)為1∶2 000，1∶4 000，1∶6 000，1∶8 000，1∶12 000，1∶16 000，1∶24 000，1∶32 000，二抗稀釋倍數(shù)為1∶1 000，進行組合試驗，加入底物溶液顯色后，利用酶標儀測定不同條件下在波長450 nm 處的OD 值，并按照式（1）計算抑制率[21]。

1.2.2 包被原包被條件與封閉液的優(yōu)化 在1.2.1節(jié)試驗結果上，分別選4 ℃-12 h，4 ℃-14 h，4℃-16 h，37 ℃-2 h，37 ℃-3 h，37 ℃-4 h 6 種方式進行包被原包被，測定不同條件下OD 值，并計算IC50值；然后分別選0.5%脫脂乳粉，1.0%脫脂乳粉，0.5% BSA，1.0% BSA，0.5%明膠和1.0%明膠進行封閉液優(yōu)化試驗。

1.2.3 氯霉素間接競爭酶聯(lián)免疫分析方法（ic-ELISA）的構建 競爭反應時間及溫度，酶標二抗反應時間等參考前期工作[22]。ic-ELISA 方法的構建步驟如下[22]：在最佳包被條件下，包被原包被96微孔（100 μL/孔）；磷酸鹽緩沖液（PBST）洗板3次，200 μL/孔封閉液37 ℃封閉1 h；PBST 洗板3次，加入梯度標準或5 倍稀釋樣品提取液（50 μL/孔）和抗體（50 μL/孔），37 ℃孵育1 h；PBST 洗板4 次，加入酶標二抗（100 μL/孔），37 ℃孵育0.5 h；PBST 洗板5 次，加入底物37 ℃顯色15 min，1.25 mol/L 硫酸（50 μL 孔）終止反應，測定波長450 nm 處OD 值，計算不同標準品的抑制率，以氯霉素質(zhì)量濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標擬合S 型標準曲線，根據(jù)標準曲線獲得本方法的靈敏度（IC50）和檢測限（IC15）。

1.2.4 氯霉素ic-ELISA 特異性評價 選取氯霉素結構類似物（氟苯尼考、甲砜霉素）和孔雀石綠、隱色孔雀石綠、恩諾沙星、諾氟沙星、磺胺甲惡唑、磺胺二甲嘧啶、四環(huán)素、沙丁胺醇、慶大霉素、甲硝唑、結晶紫等11 種同類抗生素進行方法特異性評價，評價的指標為交叉反應率，計算方法見式（2）[22]。

1.2.5 氯霉素ELISA 的穩(wěn)定性和應用性評價 日內(nèi)和日間變異系數(shù)（CV）評價方法的穩(wěn)定性[23]，選取大黃魚、縊蟶、牛蛙等水產(chǎn)品進行方法應用性評價。樣品處理如下[3]：首先準確稱取2.0 g 肌肉樣品，加入到含6.0 mL 乙酸乙酯中，充分振蕩5 min，5 000 r/min 離心5 min 后，取3.0 mL 上清液，50 ℃下氮氣吹干，依次加入2.0 mL PBS 溶液和2.0 mL 正己烷均渦旋60 s，5 000 r/min 離心5 min 后，取下層水相用于分析。樣品加標水平為5.0，10.0，20.0 μg/kg。LC-MS/MS 檢測氯霉素的樣品處理和分析條件參考GB/T 20756-2006 《可食動物肌肉、肝臟和水產(chǎn)品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》[24]。

2 結果與討論

2.1 包被原添加量和抗體稀釋倍數(shù)的優(yōu)化

包被原添加量和抗體的稀釋倍數(shù)是影響酶聯(lián)免疫吸附分析法靈敏度和檢測限的重要因素之一[25]。試驗結果如圖1 所示，每孔的包被量相同，隨著抗體稀釋倍數(shù)增加，OD 值和IC50值整體呈現(xiàn)下降趨勢；當每孔包被原包被量為0.05 μg，抗體稀釋倍數(shù)為1∶16 000 時，IC50值最小，OD 值為0.84，因而選擇每孔包被量為0.05 μg，抗體稀釋倍數(shù)為1∶16 000 進行后續(xù)研究。

圖1 包被量與抗體稀釋條件的優(yōu)化Fig.1 Optimization of coating antigen amount and antibody dilution conditions

包被原包被條件和封閉液的種類及濃度是影響酶聯(lián)免疫分析方法靈敏度（IC50）的重要因素[25]。如圖2 所示，不同包被條件的OD 值差異顯著（P<0.05），其中包被條件為4 ℃-14 h，4 ℃-16 h，37 ℃-3 h，37 ℃-4 h 時，IC50值較低，且IC50值差異不顯著（P>0.05），變異系數(shù)小于4.53%，說明上述的包被條件下方法的穩(wěn)定性好，結合檢測時間和實際情況考慮，本研究選擇包被條件為4 ℃-14 h 進行后續(xù)試驗。如圖3 所示，選取BSA和明膠封閉時，IC50值高于同質(zhì)量分數(shù)的脫脂乳粉，差異極顯著（P<0.01）；0.5%脫脂乳粉為封閉液，IC50值最低。因此封閉液選擇0.5%脫脂乳粉。

圖2 包被條件的優(yōu)化Fig.2 Optimization of temperature and time of coating condition

圖3 封閉液種類的優(yōu)化Fig.3 Optimization of the type of blocking solution

2.2 氯霉素ic-ELISA 標準曲線的構建

經(jīng)過上述試驗條件的優(yōu)化，構建氯霉素ic-ELISA 最佳工作條件：包被量為0.05 μg/孔，包被條件為4 ℃-14 h，0.5%脫脂乳粉為封閉液，抗體稀釋倍數(shù)為1∶16000。如圖4 所示，本研究構建的氯霉素的“S”型標準曲線的方程為y=98.6856+（11.3477-98.6856）/[1+（x/6.1134）1.0235]（R2=0.9994），計算得靈敏度IC50=（4.88±0.33）μg/L，檢測限IC15=（0.29±0.13）μg/L。

圖4 氯霉素ic-ELISA 方法標準曲線Fig.4 Standard curve of CAP by ic-ELISA

2.3 氯霉素ic-ELISA 方法特異性評價

為進一步驗證氯霉素ic-ELISA 方法的有效性，本研究通過交叉反應率進行氯霉素ic-ELISA 特異性評價[26]。如表1 所示，氯霉素ic-ELISA 方法結果分析表明，氟苯尼考、甲砜霉素、孔雀石綠、隱色孔雀石綠、恩諾沙星、諾氟沙星、磺胺甲惡唑、磺胺二甲嘧啶、四環(huán)素、沙丁胺醇、慶大霉素、甲硝唑和結晶紫的交叉率低于0.1%，說明氯霉素抗體不能識別氯霉素的結構類似物和11 種同類抗生素，構建的氯霉素ic-ELISA 方法特異性良好。

表1 交叉反應率檢測結果Table 1 The detection results of cross-reaction rate

2.4 氯霉素ic-ELISA 方法穩(wěn)定性和應用性評價

本研究采用日內(nèi)和日間變異系數(shù)評價氯霉素ic-ELISA 方法的穩(wěn)定性，實際樣品檢測和加標回收評價氯霉素ic-ELISA 方法的應用性。如表2 所示，氯霉素ic-ELISA 方法的日內(nèi)變異系數(shù)（CV）在2.28%～4.63%之間，日間CV 值在3.56%～6.96%之間，LC-MS/MS 方法CV 值在0.69%～1.94%之間，構建的氯霉素ic-ELISA 方法穩(wěn)定性良好。對大黃魚、縊蟶、牛蛙樣品中氯霉素進行檢測，儀器分析與本方法均未檢測到本底濃度，樣品中添加5.0，10.0，20.0 μg/kg 3 個水平，加標回收試驗結果表明，ic-ELISA 方法對氯霉素回收率在83.90%～100.73%之間。對ic-ELISA 和LC-MS/MS 進行氯霉素檢測結果進行線性回歸分析（圖5），日內(nèi)（日間）檢測數(shù)據(jù)與LC-MS/MS 檢測數(shù)據(jù)相關系數(shù)R2=0.9924（R2=0.9793），說明ic-ELISA 檢測結果與LC-MS/MS 檢測結果具有很好的一致性。本文構建的氯霉素ic-ELISA 方法，穩(wěn)定性良好，可應用于水產(chǎn)品中氯霉素含量的檢測。

圖5 ic-ELISA 與LC-MS/MS 檢測結果相關性分析Fig.5 Correlation analysis of detection results between ic-ELISA and LC-MS/MS

3 結論

本文以食品動物禁用獸藥氯霉素為研究對象，系統(tǒng)優(yōu)化間接競爭酶聯(lián)免疫分析（ic-ELISA）方法的包被原添加量、抗體稀釋倍數(shù)、包被條件、封閉液種類等工作參數(shù)，建立ic-ELISA 方法。所構建氯霉素ic-ELISA方法，靈敏度為（IC50）4.88 μg/L，檢測限（IC15）為0.29 μg/L，本方法只特異性識別氯霉素，不能識別結構類似物和同類抗生素，交叉反應率均低于0.1%。 本文構建的氯霉素ic-ELISA對大黃魚、縊蟶、牛蛙添加回收率范圍為83.90%~100.73%，變異系數(shù)（CV）范圍為2.28%~6.96%， 檢測結果與LC-MS/MS檢測結果具有較好的一致性。 綜上所述，本文構建的氯霉素ic-ELISA 方法，可應用于水產(chǎn)品中氯霉素殘留進行準確檢測，為食品安全提供一份保障。同時，本方法為禁止使用的農(nóng)獸藥殘留、生物毒素、非法添加劑以及其它食品危害因子間接競爭酶聯(lián)免疫分析方法開發(fā)與應用提供技術參考。