利用低聚半乳糖雙歧桿菌的篩選及益生特性研究

孫 慧，肖利紅，何明雪，徐梓赫，譚 澤，張峰瑞，張莉麗*，韓建春

（1 東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 哈爾濱150030 2東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 哈爾濱150030 3 黑龍江省綠色食品科學(xué)研究院 哈爾濱150028）

低聚半乳糖（Galactooligosaccharides，GOS）是人乳中含量較多的低聚糖[1]，由半乳糖殘基和末端葡萄糖通過(guò)β-糖苷鍵連接而成的低聚糖。目前的商業(yè)GOS 是含有大量單糖和雙糖的混合低聚糖；不同供應(yīng)商的GOS 的連接類型和聚合程度差異很大[2]。GOS 具有優(yōu)良的益生功能，抵抗近端胃腸道消化的能力極強(qiáng)，能夠促進(jìn)雙歧桿菌的定殖。人體攝入一定量的GOS 可以提高腸道吸收鎂和鐵元素的能力，在改善兒童缺鐵性貧血方面具有積極作用[3]。此外，GOS 還具有降低齲齒發(fā)生率、促進(jìn)脂質(zhì)代謝、保護(hù)肝臟、預(yù)防結(jié)腸癌等功能[4-5]。

大部分雙歧桿菌（Bifidobacterium）是從嬰兒糞便中分離得到的，它是一種對(duì)人體腸道極其重要的微生物[6]。雙歧桿菌不僅可以促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育，抑制腫瘤和衰老，還可以調(diào)節(jié)腸道動(dòng)態(tài)平衡，促進(jìn)腸道屏障的完整性，減輕結(jié)腸炎癥狀，增強(qiáng)機(jī)體免疫力[7-11]。雙歧桿菌可以分解各種飲食來(lái)源和宿主腸道內(nèi)的碳水化合物，從而顯著促進(jìn)宿主的新陳代謝，這一特征不僅保證其在腸道中的定殖，而且通過(guò)交叉喂養(yǎng)策略為宿主和其它腸道微生物提供營(yíng)養(yǎng)[12-13]。

雙歧桿菌發(fā)酵GOS 的能力依賴于GOS 的聚合度和糖苷鍵類型。有研究證明雙歧桿菌更加傾向于分解利用高聚合度的GOS[14]。Taskwan 等[15]分析雙歧桿菌與乳酸菌利用的GOS 的情況，發(fā)現(xiàn)嬰兒雙歧桿菌M63 和嬰兒雙歧桿菌ATCC 15697 能夠很好地利用短鏈低聚半乳糖（Short chain galacto-oligosaccharides，SC-GOS）。SC-GOS 可以調(diào)節(jié)腸道微生物組成，增加雙歧桿菌的豐度，改善乳糖不耐受癥[16]。Xiao 等[17]給小鼠喂食含2’-巖藻糖基乳糖、SC-GOS 和長(zhǎng)鏈低聚果糖（Long chain fructo-oligosaccharides，LC-FOS）的混合物，發(fā)現(xiàn)小鼠的腸道微生物區(qū)系組成發(fā)生變化，并且代謝功能和免疫系統(tǒng)功能得到改善。有研究證實(shí)給嬰兒食用SC-GOS、LC-FOS 與短雙歧桿菌M-16V的混合物，可使其糞便變軟，糞便中雙歧桿菌的數(shù)量大大增加[18]。嬰兒食用含有SC-GOS 和LC-FOS的嬰配粉可以降低腸絞痛的發(fā)生率[19]，預(yù)防輪狀病毒引起的腹瀉癥狀[20]，促進(jìn)嬰兒的生長(zhǎng)發(fā)育[21]。然而，目前有關(guān)利用SC-GOS 的雙歧桿菌研究較少，菌株資源較為有限。

本課題組從嬰兒糞便中分離得到126 株雙歧桿菌，以SC-GOS 為唯一碳源，從中篩選高效利用SC-GOS 的雙歧桿菌，結(jié)合基因測(cè)序技術(shù)確定其種屬。評(píng)價(jià)胞外多糖含量、菌體表面蛋白含量、表面疏水性和自聚集能力、模擬胃液耐受能力、膽鹽耐受能力以及上清液抑菌能力，以期獲得高效利用SC-GOS 且益生特性優(yōu)良的雙歧桿菌菌株，為開(kāi)發(fā)出含有GOS 和雙歧桿菌的產(chǎn)品提供菌株資源。

1 材料與方法

1.1 微生物菌株

嬰兒雙歧桿菌M63（Bifidobacterium longum subsp.infantis M63，BI_M63）為實(shí)驗(yàn)室保藏菌種，嬰兒雙歧桿菌ATCC 15697（Bifidobacterium longum subsp.infantis ATCC 15697，BI_15697）及大腸桿菌ATCC 25922（Escherichia coli ATCC 25922，EC_25922）購(gòu)自中國(guó)微生物菌種保藏中心。

1.2 主要材料與試劑

低聚半乳糖（GOS）、葡萄糖、乳糖，上海源葉生物科技有限公司；MRS 肉湯培養(yǎng)基，青島海博生物公司；L-半胱氨酸鹽酸鹽（L-Cysteine HCl），德國(guó)BioFroxx 公司；豬膽鹽，上海瑞永生物科技有限公司；胃蛋白酶，天津阿爾法生物科技有限公司；DNA 提取試劑盒Omega D4015-01，Omega Bio-Tek 公司

1.3 主要儀器與設(shè)備

CMax Plus 酶標(biāo)儀，美谷分子儀器（上海）有限公司；SPL-150 生化培養(yǎng)箱，天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；ZWY-A2102C 恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；TGL-23 離心機(jī)，四川蜀科儀器有限公司；BSC-1100-L ⅡA2生物安全柜，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司。

1.4 培養(yǎng)基

還原液配制方法如下：10 g/L 細(xì)菌蛋白胨，5 g/L 氯化鈉，0.5 g/L L-Cysteine HCl，1 mL/L 吐溫80。121 ℃滅菌15 min。RB 瓊脂培養(yǎng)基參照郭春峰[22]的方法配制，118 ℃滅菌15 min。MRSC 培養(yǎng)基配制方法如下：MRS 肉湯培養(yǎng)基添加0.5 g/L LCysteine HCl，加入15 g/L 瓊脂制成MRSC 固體培養(yǎng)基，118 ℃滅菌15 min。無(wú)碳源MRSC 培養(yǎng)基配制方法如下：10 g/L 細(xì)菌蛋白胨、5 g/L 酵母浸粉、0.5 g/L L-Cysteine HCl、2 g/L 磷酸氫二鉀、5 g/L無(wú)水乙酸鈉、2 g/L 檸檬酸銨、0.2 g/L 七水硫酸鎂、0.05 g/L 一水硫酸錳、1 mL/L 吐溫80，118 ℃滅菌15 min。

不同碳源培養(yǎng)基配制方法如下：在上述無(wú)碳源MRSC 培養(yǎng)基中分別添加10 g/L 的P-GOS/GOS/葡萄糖/乳糖，118 ℃滅菌15 min。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 菌株活化 將課題組前期從嬰兒糞便中篩選分離得到的126 株雙歧桿菌菌株活化，即以1%接種量接種至MRSC 液體培養(yǎng)基，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，傳代18 h 備用。

1.5.2 SC-GOS 的制備 根據(jù)Taksawan 等[15]的方法制備SC-GOS。即將0.15 mg/mL GOS 加樣到已裝填好Sephadex G-25 凝膠（Sigma-Aldrich）的XK 16/100 柱（GE Healthcare Life Science）中，洗脫收集。以乳糖為對(duì)照，應(yīng)用苯酚-硫酸法[23]確定GOS 和乳糖的出峰時(shí)間，收集GOS 和乳糖不重合部分，混合凍干得到SC-GOS，用于后續(xù)試驗(yàn)。利用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜分析確定所得到SC-GOS 中不含有單糖和雙糖。

1.5.3 可利用SC-GOS 的雙歧桿菌篩選 取1 mL 上述1.5.1 節(jié)菌液離心（10 000×g，5 min，4℃），水洗沉淀并重懸制備菌懸液。分別取200 μL SC-GOS-培養(yǎng)基、GOS-培養(yǎng)基、葡萄糖-培養(yǎng)基、乳糖-培養(yǎng)基至96 孔板中，以1%接種量接種菌懸液，設(shè)置對(duì)照組（無(wú)碳源MRSC 培養(yǎng)基、SCGOS-培養(yǎng)基、GOS-培養(yǎng)基、葡萄糖-培養(yǎng)基、乳糖-培養(yǎng)基以及加菌的無(wú)碳源MRSC 培養(yǎng)基）。37℃厭氧培養(yǎng)，測(cè)定0，24，48 h 的OD595nm值以確定能利用SC-GOS 的雙歧桿菌。

1.5.4 利用SC-GOS 雙歧桿菌的生物學(xué)鑒定 利用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒Omega D4015-01提取細(xì)菌基因組DNA。根據(jù)鄭慧娟等[24]的研究用雙歧桿菌特異引物（Bif164-F：5’-GGGTGGTAATGCCGGATG-3’；Pbi R2：5’-GACCATGCACCACCTGTGAA-3’）對(duì)菌株DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳，送至上海生工生物科技有限公司測(cè)序。序列進(jìn)行BLAST 比對(duì)分析，確定菌株種屬。

1.5.5 利用SC-GOS 雙歧桿菌形態(tài)觀察取1 mL 上述1.5.1 節(jié)菌液離心（10 000×g，5 min，4℃），PBS 洗滌，應(yīng)用孫明明等[25]方法處理。即用2.5%戊二醛處理12 h，乙醇系列脫水并冷凍干燥，應(yīng)用鎢燈絲掃描電子顯微鏡S-3400N 觀察菌體形態(tài)。

1.5.6 益生特性分析

1.5.6.1 胞外多糖產(chǎn)量測(cè)定 取10 mL 上述1.5.1節(jié)菌液離心（6 000×g，10 min，4 ℃），將上清液與3倍體積乙醇混合，4 ℃沉淀16 h，用3.5 ku 透析袋透析，每8 h 換1 次水，透析48 h。用Alcian Blue法[26]測(cè)定胞外多糖產(chǎn)量。

1.5.6.2 菌體表面蛋白含量測(cè)定 取10 mL 上述1.5.1節(jié)菌液離心（6 000×g，10 min，4 ℃），PBS 洗2次，加入2 mL 5 mol/L LiCl，恒溫振蕩反應(yīng)（200 r/min，1 h，37 ℃），離心（6 000×g，10 min，4 ℃），將上清液與2 倍體積冰丙酮混合，-20 ℃放置過(guò)夜。應(yīng)用Bradford 法[27]測(cè)定菌體表面蛋白含量。

1.5.6.3 表面疏水性的測(cè)定 取3 mL 上述1.5.1節(jié)菌液，加入等體積二甲苯，恒溫振蕩反應(yīng)（250 r/min，10 min，37 ℃），靜置1 h。吸取水相測(cè)定波長(zhǎng)595 nm 處的吸光度。重復(fù)進(jìn)行3 次，取平均值。疏水性（H）計(jì)算公式：

式中，A0——0 h 吸光度；A1——不同時(shí)間吸光度。

1.5.6.4 自聚集能力的測(cè)定 取5 mL 上述1.5.1節(jié)菌液離心（4 500×g，15 min，4 ℃），PBS 緩沖液洗滌并重懸制備菌懸液，測(cè)定0，2，4，6 h 上述菌懸液在595 nm 下的吸光度。自聚集率（A）計(jì)算公式：

式中，A0——0 h 吸光度；At——不同時(shí)間吸光度。

1.5.6.5 模擬胃液耐受能力分析 取上述1.5.1節(jié)菌液按體積比1∶5 接種至pH 值為2.0 的人工胃液（胃蛋白酶10 g/L，加入鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH 值）中，37 ℃靜置培養(yǎng)，分別在0 h、30 min、3 h 時(shí)菌落計(jì)數(shù)。1.5.6.6 膽鹽耐受能力分析 取1 mL 上述1.5.1節(jié)菌液離心（10 000×g，5 min，4 ℃），洗滌菌體2次，重懸于含0.2%豬膽鹽的MRSC 培養(yǎng)液中，37℃厭氧培養(yǎng)，分別在0 h 和30 min 時(shí)菌落計(jì)數(shù)。1.5.6.7 無(wú)細(xì)胞上清液抑菌能力測(cè)定 取5 mL上述1.5.1 節(jié)菌液離心（10 000×g，5 min，4 ℃），將上清液通過(guò)0.22 μm 的微孔濾膜。以EC_25922 為指示菌，應(yīng)用牛津杯法[28]評(píng)估各菌株抑菌能力。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 利用SC-GOS 的雙歧桿菌篩選及16S rDNA 鑒定結(jié)果

Thomson 等[29]發(fā)現(xiàn)BI_15697 在0.5% GOS 上生長(zhǎng)48 h 的OD595nm在0.3 左右，本研究發(fā)現(xiàn)BI_15697 在1% SC-GOS 和GOS 培養(yǎng)基中生長(zhǎng)48 h 的OD595nm分別為0.25 和0.63，故以BI_15697和BI_M63 作為對(duì)照菌株，SC-GOS、GOS 作為篩選的標(biāo)志物，共54 株利用SC-GOS 效果優(yōu)于BI_15697。根據(jù)菌落形態(tài)、來(lái)源、鏡檢結(jié)果等，最終選擇7 株利用SC-GOS 能力（OD595nm﹥0.80）遠(yuǎn)強(qiáng)于BI_15697（P<0.05）的雙歧桿菌進(jìn)行16S rDNA鑒定。鑒定結(jié)果顯示，1 株長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種BI_Y46，2 株兩歧雙歧桿菌（BB_Y22、BB_S7），2株假小鏈雙歧桿菌（BP_Y43、BP_YA）以及2 株長(zhǎng)雙歧桿菌（BL_S34、BL_H26）。雙歧桿菌利用SCGOS 情況及發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖1，序列比對(duì)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 NCBI BLAST 比對(duì)結(jié)果Table 1 NCBI BLAST comparison results

表2 各試驗(yàn)菌株自聚集能力（，n=3）Table 2 The self-aggregation ability of each experimental strain（，n=3）

表2 各試驗(yàn)菌株自聚集能力（，n=3）Table 2 The self-aggregation ability of each experimental strain（，n=3）

注：不同大寫(xiě)字母為同一菌株不同時(shí)間差異顯著（P<0.05），不同小寫(xiě)字母為不同菌株同一時(shí)間差異顯著（P<0.05）。

圖1 碳源利用情況及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Utilization of carbon sources and phylogenetic tree

2.2 掃描電鏡觀察雙歧桿菌形態(tài)

掃描電鏡觀察菌株形態(tài)如圖2 所示，BL_S34（f）和BL_H26（g）呈勺狀；BP_YA（d）中含分叉結(jié)構(gòu)；BB_Y22（a）為彎桿狀、BP_Y43（b）和BB_S7（e）為長(zhǎng)桿狀，表面均較為光滑。值得注意的是，BI_Y46（c）具有獨(dú)特的菌毛結(jié)構(gòu)，F(xiàn)rancesca 等[30]發(fā)現(xiàn)兩歧雙歧桿菌PRL2010 具有的菌毛結(jié)構(gòu)有助于其黏附，并且具有免疫調(diào)節(jié)活性。短雙歧桿菌UCC2003 中也存在菌毛結(jié)構(gòu)，雖然短雙歧桿菌UCC2003 不能單獨(dú)利用3’-唾液酸乳糖或部分巖藻糖，但可以與兩歧雙歧桿菌PRL2010 共培養(yǎng)形成交叉喂養(yǎng)，發(fā)揮益生作用[31-32]。因此推斷菌體表面存在菌毛的BI_Y46 可能具有較強(qiáng)黏附能力，同時(shí)具有抑制病原菌等功能，未來(lái)將通過(guò)更多試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

圖2 SEM 觀察利用SC-GOS 的雙歧桿菌形態(tài)圖Fig.2 Observation of Bifidobacterium morphology using SC-GOS by SEM

2.3 利用SC-GOS 的雙歧桿菌胞外多糖產(chǎn)量

利用SC-GOS 的雙歧桿菌胞外多糖產(chǎn)量見(jiàn)圖3。其中，BB_Y22 胞外多糖產(chǎn)量最高，為（0.49±0.04）mg/mL，BI_Y46 以及BL_H26 胞外多糖產(chǎn)量在0.4～0.45 mg/mL 之間。目前針對(duì)高產(chǎn)胞外多糖的雙歧桿菌研究較少，一般胞外多糖產(chǎn)量在幾十到幾百毫克每升不等，蔡靜靜等[33]分離得到雙歧桿菌胞外多糖產(chǎn)量在0.4 mg/mL 左右，故BB_Y22、BP_Y43 屬于產(chǎn)胞外多糖能力較強(qiáng)的菌株，為未來(lái)應(yīng)用提供一定參考。

圖3 利用SC-GOS 雙歧桿菌的胞外多糖產(chǎn)量（，n=3）Fig.3 The exopolysaccharide yield of Bifidobacteria able to utilize SC-GOS（，n=3）

2.4 利用SC-GOS 的雙歧桿菌菌體表面蛋白含量分析

表面蛋白可以延長(zhǎng)益生菌在腸道發(fā)揮作用的時(shí)間[34]，本試驗(yàn)測(cè)定菌體表面蛋白，為后續(xù)分析其具體成分或探討其黏附功能及機(jī)制奠定基礎(chǔ)。各試驗(yàn)菌株菌體表面蛋白含量見(jiàn)圖4。結(jié)果表明，BL_H26 菌體表面蛋白含量較高，為（0.74±0.07）mg/mL（P<0.05），而B(niǎo)B_Y22、BB_S7、BL_S34 含量接近，均在0.35～0.45 mg/mL 范圍；所有菌株表面蛋白含量均超過(guò)BI_15697。目前有關(guān)雙歧桿菌菌體表面蛋白的報(bào)道不多，后續(xù)將對(duì)雙歧桿菌的表面蛋白進(jìn)一步分離，以探討其的功能特性。

圖4 利用SC-GOS 雙歧桿菌菌體表面蛋白含量（，n=3）Fig.4 Surface protein content of Bifidobacteria able to utilize SC-GOS（，n=3）

2.5 表面疏水性和自聚集能力

表面疏水性和自聚集能力與黏附能力密切相關(guān)，具有良好黏附能力的益生菌株可以抑制致病菌的侵襲[35]。以BI_M63 和BI_15697 作為對(duì)照，各試驗(yàn)菌株表面疏水性如圖5 所示。結(jié)果表明，BP_Y43、BP_YA 表面疏水性為24.96%，24.90%，與BI_15697、BI_M63 的表面疏水性差異較小，而顯著高于BI_Y46 和BL_H26（P<0.05）；其余菌株如BB_Y22、BB_S7、BB_S34 表面疏水能力處于中等水平，均在15%左右，低于陳美瑄[36]篩選得到的雙歧桿菌Probio-M9（50%），可能是由于處理?xiàng)l件不同導(dǎo)致的。

圖5 各試驗(yàn)菌株表面疏水性（，n=3）Fig.5 Surface hydrophobicity of each experimental strain（，n=3）

自聚集試驗(yàn)表明，BB_Y22 和BP_Y43 整體自聚集能力較強(qiáng)，BL_H26 較弱。在2 h 時(shí)，BB_Y22和BP_Y43 的自聚集百分比分別為（51.08±4.02）%和（55.27±5.94）%，明顯高于其它菌株（P<0.05），其余菌株與趙笑笑等[37]的研究基本一致，在10%～30%范圍。在4 h 時(shí)，BB_Y22 高達(dá)（73.16±4.06）%，提高了20%左右，同時(shí)BP_Y43、BI_Y46、BP_YA、BB_S7 以及BL_S34 都有顯著提升，而B(niǎo)I_M63 和BI_15697 變化較小，在4 h 時(shí)分別為（27.37±1.89）%和（32.80±3.82）%；在6 h 時(shí)，BB_Y22 和BP_Y43 達(dá)到了80%以上，遠(yuǎn)高于其它菌株（P<0.05），同時(shí)超過(guò)陳美瑄[36]篩選得到的雙歧桿菌Probio-M8（58%）和Probio-M9（78%）。

2.6 利用SC-GOS 的雙歧桿菌模擬胃液耐受情況分析

雙歧桿菌為到達(dá)并穩(wěn)定地定居在大腸，必須應(yīng)對(duì)胃腸道上發(fā)生的大量氧化、滲透、膽鹽或胃液應(yīng)激挑戰(zhàn)[38]。以BI_M63 和BI_15697 作為對(duì)照，各試驗(yàn)菌株在模擬胃液pH 2.0 時(shí)的耐受情況如表3 所示。處理30 min 與0 h 相比，BI_M63、BP_YA、BB_S7 菌落數(shù)量略微增長(zhǎng)或持平，而其余菌株菌落數(shù)量減少，BI_15697 相對(duì)減少菌落數(shù)量最多（P<0.05）；處理3 h 與0 h 相比，BI_15697 的存活率最低（P<0.05），BI_M63 菌落數(shù)量增加，這可能與應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生的物質(zhì)相關(guān)，即受到刺激后產(chǎn)生促進(jìn)自身生長(zhǎng)的物質(zhì)。其余菌株存活率接近100%，說(shuō)明菌株具有較強(qiáng)的胃液耐受性，所有篩選得到菌株在pH 2.0 模擬胃液刺激下的存活率高于胡鵬鈺等[39]分離得到的兩株雙歧桿菌在pH 2.5 模擬胃液刺激下的存活率（73%，75%），較強(qiáng)胃液耐受菌株在今后產(chǎn)品中的應(yīng)用具有廣闊前景。

表3 菌株在模擬胃液（pH 2.0）耐受情況（，n=3）Table 3 Simulated gastric juice tolerance of srtains at pH 2.0（，n=3）

表3 菌株在模擬胃液（pH 2.0）耐受情況（，n=3）Table 3 Simulated gastric juice tolerance of srtains at pH 2.0（，n=3）

注：大寫(xiě)字母不同為同一菌株不同時(shí)間生長(zhǎng)情況差異顯著（P<0.05），小寫(xiě)字母不同為不同菌株同一時(shí)間以及3 h 存活率的差異顯著（P<0.05）。

2.7 利用SC-GOS 的雙歧桿菌膽鹽耐受情況分析

潛在的益生菌要有較強(qiáng)的膽鹽耐受能力，各試驗(yàn)菌株在0.2%豬膽鹽處理30 min 時(shí)相較0 h的細(xì)菌數(shù)量減少情況如圖6 所示。結(jié)果表明，在膽鹽存在的條件下，所有菌株存活能力受到不同程度的影響，BP_Y43 的菌落數(shù)量減少5.5×108CFU/mL，其余菌株菌落數(shù)量減少1.0×107CFU/mL 左右（P<0.05）。這個(gè)結(jié)果表明除BP_Y43 外，其余試驗(yàn)菌株膽鹽耐受性強(qiáng)（P<0.05）。黃巧芬[40]分離的長(zhǎng)雙歧桿菌NCU712 在0.3%豬膽鹽刺激下，菌數(shù)減少了3.9×107CFU/mL，可能是由于菌株不同和所用的膽鹽不同，未來(lái)將進(jìn)一步探討0.3%膽鹽下的耐受情況。

圖6 膽鹽耐受情況（，n=3）Fig.6 Bile salt tolerance（，n=3）

2.8 利用SC-GOS 的雙歧桿菌上清液抑菌能力評(píng)價(jià)

Delcaru 等[41]證實(shí)了雙歧桿菌對(duì)大腸桿菌產(chǎn)生拮抗作用，目前已經(jīng)提出了部分益生菌對(duì)致病菌產(chǎn)生拮抗作用的機(jī)制，如競(jìng)爭(zhēng)排斥、宿主免疫調(diào)節(jié)等[42]。以無(wú)菌的MRSC 培養(yǎng)基作為對(duì)照，各試驗(yàn)菌株的上清液抑制EC_25922 能力見(jiàn)表4。結(jié)果表明，BI_15697 上清液沒(méi)有抑菌效果；BP_Y43、BP_YA 抑菌效果較強(qiáng)，抑菌環(huán)直徑分別為10.33 mm 和10.17 mm；BB_Y22、BL_S34、BL_H26 菌 株上清液抑菌能力強(qiáng)，抑菌環(huán)直徑在11～12.5 mm 之間，而B(niǎo)I_M63、BI_Y46 以及BB_S7 上清液對(duì)大腸桿菌抑制作用更加明顯，抑菌環(huán)直徑可以達(dá)到12.5 mm 以上。

表4 菌株上清液對(duì)EC_25922 抑制作用（，n=3）Table 4 Inhibitory effect of strain supernatant on EC_25922（，n=3）

表4 菌株上清液對(duì)EC_25922 抑制作用（，n=3）Table 4 Inhibitory effect of strain supernatant on EC_25922（，n=3）

注：牛津杯外徑8 mm。-.沒(méi)有抑菌作用；+.抑菌環(huán)直徑8～9.5 mm；++.抑菌環(huán)直徑9.5～11 mm；+++.抑菌環(huán)直徑11～12.5 mm；++++.抑菌環(huán)直徑>12.5 mm。

3 結(jié)論

從糞便樣品中分離得到7 株高效利用SCGOS 的雙歧桿菌，分別為兩歧雙歧桿菌BB_Y22和BB_S7、假小鏈雙歧桿菌BP_Y43 和BP_YA、長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種BI_Y46 以及長(zhǎng)雙歧桿菌BL_S34、BL_H26。

觀察形態(tài)并分析益生特性，發(fā)現(xiàn)BI_Y46 具有菌毛結(jié)構(gòu)，蛋白含量較高，為（0.31±0.02）mg/mL，同時(shí)BI_Y46 上清液對(duì)EC_25922 的抑菌效果較強(qiáng)（P<0.05）；BB_Y22 的胞外多糖產(chǎn)量最高，為（0.49±0.04）mg/mL，菌體表面蛋白含量為（0.37±0.06）mg/mL，具有較強(qiáng)表面疏水性和自聚集能力，還具有較強(qiáng)的胃液耐受性（P<0.05）；BP_Y43 也同樣具有較高胞外多糖產(chǎn)量和高菌體蛋白含量，表面疏水性與自聚集能力也較強(qiáng)，同時(shí)具有較強(qiáng)膽鹽耐受能力，有利于其在腸道中的定殖（P<0.05）。

綜上，本試驗(yàn)分離高效利用短鏈低聚半乳糖的雙歧桿菌中，長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種BI_Y46、兩歧雙歧桿菌BB_Y22 以及假小鏈雙歧桿菌BP_Y43 具有較好的益生潛力，為開(kāi)發(fā)益生菌產(chǎn)品、嬰兒配方乳粉提供一定的參考，也為后續(xù)研究提供菌株資源。