‘粉色記憶’玉簪組培快繁技術(shù)初探

陳錦錦，馬慶華，凌皖北，周振華，鄧瑞來

（安徽開源園林綠化工程有限公司，中煤第三建設(shè)集團有限責(zé)任公司，安徽合肥 230000）

玉簪（Hosta plantaginea）是百合科玉簪屬的多年生宿根植物，具有花葉共賞、類型豐富、耐陰性強等特點，是世界著名的耐陰地被，常作為耐陰植物在景觀設(shè)計中應(yīng)用，多植于建筑物北邊、公園溪邊湖畔巖石旁、疏林下或其他植株蔭蔽處等[1]。

現(xiàn)在國際上登錄的玉簪園藝栽培品種6 000 余種。玉簪‘粉色記憶’由‘One Man’s Treasure’בSquash Casserole’雜交選育而成，為小型—中型品種，紅桿子，葉緣波浪狀，葉尖明顯，葉片會從黃色—淡黃偏綠轉(zhuǎn)變。近年來，多品種玉簪的離體培養(yǎng)體系已建立，外植體的選擇有花序、花蕾、幼芽、子房和花葶等[2-3]，該文采用較易獲得且不破壞植株成活的外植體葉片進行‘粉色記憶’玉簪離體培養(yǎng)體系的建立。研究‘粉色記憶’玉簪植物的離體快繁技術(shù)，不僅可以豐富皖北地區(qū)的玉簪資源，滿足市場需求，還可以提供玉簪組培實踐依據(jù)和理論指導(dǎo)，為篩選優(yōu)良無性系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料取自安徽開源園林綠化工程有限公司宿州苗圃科研基地玉簪‘粉色記憶’，剪取幼嫩葉片作為外植體。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體的采集與處理。外植體采集于玉簪‘粉色記憶’春季葉片生長期，剪取幼嫩葉片，在自來水下沖洗30 min后，在超凈工作臺上先用75%酒精浸泡15 s，再用0.5%二氯異氰尿酸鈉溶液外加2～3 滴吐溫-20 浸泡，消毒時間分別為10、15、20 min，期間輕輕振蕩。消毒處理后的葉片用無菌水沖洗3 次，再用無菌濾紙吸干葉片表面的水分，然后在高溫高壓滅菌后的培養(yǎng)皿中用手術(shù)刀片先將消毒劑接觸的葉片邊緣切去2～3 mm，再將剩下的葉片切成約1 cm2的小塊。平鋪接種到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每瓶接種5個葉片切塊，每個處理重復(fù)3 組，每組3 瓶。7 d 后統(tǒng)計外植體成活數(shù)量。

1.2.2 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基。以MS (Murashige and Skoog)為基本培養(yǎng)基，在前人的研究基礎(chǔ)上[3-5]共設(shè)計了4 種愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，分別為A1：MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA；A2：MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA；A3：MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2，4-D；A4：MS+1.0 mg/L TDZ+1.0 mg/L 2，4-D。添加蔗糖30 g/L，瓊脂7 g/L，pH 調(diào)整為5.8。培養(yǎng)基高溫高壓滅菌后每瓶接種4～6 個葉片切塊，每個處理重復(fù)3組，每組3 瓶。接種后放入培養(yǎng)箱中進行暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度（25±2）℃。培養(yǎng)出現(xiàn)愈傷后移至光照培養(yǎng)室，光照強度為2 000 lx，光周期14 h/10 h，溫度（25±2）℃。60 d 后統(tǒng)計愈傷組織誘導(dǎo)率。

愈傷組織誘導(dǎo)率（%）=誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體數(shù)量/接種外植體數(shù)量×100（1）

1.2.3 愈傷組織增殖培養(yǎng)基。將愈傷組織切成小塊接種到增殖培養(yǎng)基中，以MS 為基本培養(yǎng)基，共設(shè)計了4 種增殖培養(yǎng)基，分別為B1：MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA；B2：MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA；B3：MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA；B4：MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA。添加蔗糖30 g/L，瓊脂7 g/L，pH 調(diào)整為5.8。培養(yǎng)基高溫高壓滅菌后每瓶接種3～5 個愈傷組織塊，每個處理重復(fù)3組，每組3 瓶。接種后進行光照培養(yǎng)，光照強度為2 000 lx，光周期14 h/10 h，溫度（25±2）℃。30 d 后統(tǒng)計愈傷組織增殖率。

愈傷組織增殖率（%）=（增殖后質(zhì)量-增殖前質(zhì)量）/增殖前質(zhì)量×100（2）

1.2.4 芽增殖培養(yǎng)基。將帶有不定芽的愈傷組織切成單個的芽苗接種到芽增殖培養(yǎng)基中，以MS 為基本培養(yǎng)基，共設(shè)計了2 種增殖培養(yǎng)基，分別為C1：MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA；C2：MS+1.0 mg/L TDZ+1.0 mg/L 2，4-D。添加蔗糖30 g/L，瓊脂7 g/L，pH 調(diào)整為5.8。在玻璃瓶中培養(yǎng)，每個瓶中倒入50 mL 培養(yǎng)基。培養(yǎng)基高溫高壓滅菌后每瓶接種4～6 個芽苗，每個處理10 瓶。接種后進行光照培養(yǎng)，光照強度為2 000 lx，光周期14 h/10 h，溫度（25±2）℃。30 d 后統(tǒng)計芽增殖系數(shù)。

芽增殖系數(shù)=增殖的叢生芽數(shù)/接種芽數(shù)（3）

1.2.5 生根培養(yǎng)基。將增殖后的叢生芽分開成單個的小苗接種于生根培養(yǎng)基中，依據(jù)前人的研究經(jīng)驗[1，6]以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，共設(shè)計了2 種生根培養(yǎng)基，分別為D1：1/2 MS+0.1 mg/L NAA 和D2：1/2 MS+0.5 mg/L NAA，添加蔗糖30 g/L，瓊脂7 g/L，pH 調(diào)整為5.8。培養(yǎng)基高溫高壓滅菌后每瓶接種4～6 個芽苗，每個處理10 瓶。接種后進行光照培養(yǎng)，光照強度為2 000 1x，光周期14 h/10 h，溫度（25±2）℃。7 d 開始觀察生根情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體滅菌時間

表1 數(shù)據(jù)顯示，10 min 的滅菌時間外植體成活率最低僅15.5%，污染率高達84.5%。20 min 的滅菌時間導(dǎo)致部分組織被殺死，葉片慢慢褐化無法誘導(dǎo)愈傷組織，成活率在31.1%。滅菌15 min 大部分葉片可以保持活性且污染率低，成活率在88%以上，所以玉簪‘粉色記憶’葉片最佳的滅菌方法為0.5%二氯異氰尿酸鈉溶液浸泡15 min。

表1 外植體消毒時間選擇

2.2 誘導(dǎo)培養(yǎng)基

觀察4 種培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織情況（圖1），A1 培養(yǎng)基中葉片培養(yǎng)30 d 邊緣出現(xiàn)白色松散物質(zhì)，但是后期無其他明顯變化，未進一步分化。A2 培養(yǎng)基中葉片大部分褐化喪失活力，培養(yǎng)40 d 左右有極少葉片可以誘導(dǎo)出淡黃色愈傷組織，培養(yǎng)60 d 愈傷組織進一步增殖擴大。A3 培養(yǎng)基中葉片微微向上拱起，但是未誘導(dǎo)出愈傷組織。A4 培養(yǎng)基中葉片培養(yǎng)30 d 切口附近開始出現(xiàn)淡黃色的顆粒狀愈傷組織，培養(yǎng)45 d 左右愈傷組織開始分化胚狀體，甚至有根的再生，愈傷組織體積繼續(xù)增大。培養(yǎng)60 d 部分愈傷組織開始有芽的再生。

圖1 ‘粉色記憶’玉簪葉片愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)

從表2 可以更直觀地看出A1 和A3 培養(yǎng)基無法誘導(dǎo)出愈傷組織，A2 培養(yǎng)基誘導(dǎo)率較低，為10.9%，A4 培養(yǎng)基誘導(dǎo)率為68.3%，更適合‘粉色記憶’玉簪愈傷組織的誘導(dǎo)。

表2 不同激素組合對‘粉色記憶’玉簪葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.3 愈傷組織增殖培養(yǎng)基

‘粉色記憶’玉簪葉片誘導(dǎo)培養(yǎng)基雖然能形成愈傷組織，但誘導(dǎo)率相對較低。為快速獲得足夠數(shù)量的愈傷組織，需進行增殖培養(yǎng)。培養(yǎng)1 個月后，愈傷組織在這些培養(yǎng)基上均實現(xiàn)了不同程度的增殖。表3 數(shù)據(jù)顯示，B1、B2培養(yǎng)基愈傷組織增殖率低于B3 和B4 培養(yǎng)基，說明6-BA是愈傷增殖的重要激素。B2 和B4 培養(yǎng)基中愈傷組織雖然能夠快速增殖達到較高的增殖率，其中B4 培養(yǎng)基增殖率達到200%，但在增殖過程中再生出很多根，很少有芽再生，而B1 和B3 培養(yǎng)基能較快誘導(dǎo)出多數(shù)不定芽（圖2），說明在愈傷組織增殖培養(yǎng)基中NAA 濃度不易過高，否則不利于進一步分化。因此B3 培養(yǎng)基更適合‘粉色記憶’玉簪愈傷組織增殖和不定芽誘導(dǎo)。

圖2 ‘粉色記憶’玉簪葉片愈傷組織增殖培養(yǎng)

圖3 ‘粉色記憶’玉簪芽增殖培養(yǎng)

表3 不同激素組合對‘粉色記憶’玉簪葉片愈傷組織增殖的影響

2.4 芽增殖培養(yǎng)基

從表4 可以看出，不同激素組合的培養(yǎng)基‘粉色記憶’玉簪芽都會產(chǎn)生增殖。C1 培養(yǎng)基中芽增殖系數(shù)為2.34，相對較低，幼苗生長緩慢，長勢較弱。C2 培養(yǎng)基中芽增殖系數(shù)為3.3，顯著高于C1 培養(yǎng)基，其接種10 d 左右，基部腋芽開始萌動產(chǎn)生突起，幼苗生長較快，長勢良好，然而根系較少。這表明‘粉色記憶’玉簪芽增殖對激素的適應(yīng)范圍比較廣，從芽增殖培養(yǎng)來看，1.0 mg/L TDZ 和1.0 mg/L 2，4-D 是更為理想的激素組合，這和愈傷組織誘導(dǎo)的激素相同。

表4 不同激素組合對‘粉色記憶’玉簪芽增殖的影響

2.5 生根培養(yǎng)基

該研究中2 種不同激素組合的培養(yǎng)基‘粉色記憶’玉簪芽苗都會生根，但根系狀態(tài)有所不同。接種7 d 后觀察添加0.1 mg/L NAA 生根數(shù)量更多，生長速度更快（圖4），添加0.5 mg/L NAA 生根數(shù)量少且生長較慢，說明NAA 濃度較高不利于快速生根。因此0.1 mg/L NAA 激素含量更適合‘粉色記憶’玉簪芽苗進行生根培養(yǎng)。

圖4 ‘粉色記憶’玉簪芽生根培養(yǎng)

3 結(jié)論

該研究選擇葉片作為建立‘粉色記憶’玉簪組培快繁體系的外植體，與其他外植體相比取材時間相對不受限，且材料充足。外植體最佳效果的滅菌方法是采用0.5%二氯異氰尿酸鈉溶液外加2～3 滴吐溫-20 消毒15 min，對外植體的傷害較小且不易生菌。6-BA、NAA、2，4-D、TDZ 等是外植體誘導(dǎo)愈傷組織所常采用的激素，前人研究中常見激素組合為6-BA 和NAA[7]，該研究發(fā)現(xiàn)，‘粉色記憶’玉簪葉片愈傷組織的誘導(dǎo)在2，4-D 和TDZ 激素配比的培養(yǎng)基中愈傷誘導(dǎo)速度更快且誘導(dǎo)率相對較高。愈傷組織增殖培養(yǎng)基中激素組合6-BA 1.0 mg/L 和NAA 1.0 mg/L 增殖率高且誘導(dǎo)不定芽較多。然而值得關(guān)注的是在芽增殖的激素組合中2，4-D 和TDZ 又是最佳配比的培養(yǎng)基，增殖系數(shù)最高且芽苗長勢更好。生根培養(yǎng)基中1/2 MS 培養(yǎng)基添加0.1 mg/L NAA 更適合‘粉色記憶’玉簪芽苗的生根培養(yǎng)。