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    基于UPLC-MS技術(shù)分析沙棘果肉成熟過程中生物活性成分差異

    2023-12-14 12:45:40阮成江吳立仁
    食品科學 2023年22期
    關(guān)鍵詞:黃酮差異

    丁 健,阮成江,*,楊 紅,關(guān) 瑩,李 賀,陳 葉,唐 克,吳立仁

    (1.大連民族大學資源植物研究所,遼寧 大連 116600;2.西藏農(nóng)牧學院資源與環(huán)境學院,西藏 林芝 860000;3.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院,黑龍江 哈爾濱 150059)

    沙棘(HippophaeL.)屬胡頹子科沙棘屬植物,是水土保持和生態(tài)建設(shè)的重要經(jīng)濟樹種[1]。沙棘果實、葉和莖中富含多種對人體有益、具較高營養(yǎng)和藥用價值的生物活性成分,在食品、日化和醫(yī)藥等行業(yè)被廣泛應(yīng)用,其中,沙棘果汁酸甜可口,是市場認可度較高的產(chǎn)品之一[2-3]。發(fā)育期間的沙棘果肉從綠色經(jīng)黃綠色,逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色、橙黃色或橘紅色,黃酮類化合物、VC、類胡蘿卜素、5-羥色胺、γ-氨基丁酸、脂肪酸、多糖和有機酸等代謝物含量發(fā)生顯著變化[4-5]。近年來,關(guān)于沙棘果汁、果油具有抗癌功能的報道越來越多,這與沙棘果肉中生物活性成分的高積累密切相關(guān)[6-7]。

    沙棘是雌雄異株,有6 個種13 個亞種,蒙古沙棘(H.mongolia)和中國沙棘(H.sinensis)是中國北方分布最廣泛的2 個亞種[8],不同沙棘種質(zhì)果實之間的生物活性成分及含量均存在明顯差異[1]。甘油三酯(triacylglycerol,TAG)是沙棘油脂的主要成分,其含量直接決定果肉含油率(約5.5%~24.3%)[9],而其結(jié)構(gòu)則決定于脂肪酸組分[10]。沙棘是罕有的在非種子組織(果肉)中高積累棕櫚油酸(C16:1)的植物[11],它具有抗?jié)儭⒖寡趸?、抗癌、降壓和抑菌作用[12-13]。研究發(fā)現(xiàn),C16:1含量與delta-9去飽和酶(delta-9 desaturase,Δ9D)基因的高表達及其與TAGsn-2位的親和性密切相關(guān)[10,12]。除此之外,黃酮類化合物是沙棘果實中重要的次生代謝產(chǎn)物[14]。沙棘黃酮主要包括蘆丁、槲皮素、異鼠李素、兒茶素、山柰酚和柚皮素等,果肉總黃酮含量約為102 μg/g[15]。沙棘黃酮具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤和降血壓等作用[16-17]。近年來,已有較多研究對沙棘油脂、脂肪酸、黃酮、5-羥色胺、維生素等生物活性成分和提取純化工藝進行探究,但有關(guān)沙棘果肉(非種子組織)成熟期間主要生物活性成分的合成代謝機理仍不清楚。

    為解析沙棘油脂、黃酮等生物活性成分的合成代謝規(guī)律,以2 個沙棘品系發(fā)育期間(綠色和橙色時期)的果肉為研究對象,采用超高效液相色譜-質(zhì)譜(ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometry,UPLC-MS)技術(shù)對沙棘果肉生物活性成分進行全面解析,從非靶向代謝組學角度闡明沙棘果肉發(fā)育期間的差異代謝輪廓,篩選與沙棘果肉生物活性成分合成相關(guān)的關(guān)鍵代謝物,為揭示木本沙棘果肉中抗癌生物活性成分合成積累機理提供科學依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    以沙棘品系‘Za56’和‘TF2-36’的果實為實驗材料,各品系選擇6 株6 年齡植株為生物學重復,種植環(huán)境和田間管理方式相同?!甖a56’為中國沙棘亞種(♂)和蒙古沙棘亞種(♀)的雜交種,‘TF2-36’為蒙古沙棘亞種的實生子代。分別在2017年7月7日和8月10日,采摘兩個品系的綠色(G)和橙色(O)果實,并命名為56G、56O、36G和36O,立即置于凍存管內(nèi)用液氮速凍,運抵實驗室后在-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    乙醇、乙腈(均為色譜純)美國Merck公司;乙酸銨(純度≥98%)美國Sigma-Aldrich公司;所有分離用化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    1290 Infinity LC超高壓液相色譜儀 美國Agilent公司;Triple TOF 5600質(zhì)譜儀(配電噴霧離子源(electron spray ionization,ESI))美國AB SCIEX公司。

    1.3 方法

    1.3.1 樣品預處理

    用液氮研磨去除種子后的沙棘果肉樣品,果肉粉末經(jīng)冷凍干燥后[18],稱取20 mg,加入200 μL超純水勻漿,再加入800 μL甲醇-乙腈(1∶1,V/V),旋渦混勻后于低溫下超聲破碎30 min,-20 ℃孵育1 h后再離心15 min(13 000 r/min,4 ℃),取上清液過0.22 μm微孔濾膜后,用于UPLC-MS分析。

    1.3.2 色譜條件

    色譜柱:Waters ACQUIT Y UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm);柱溫:25 ℃;流動相:A為含25 mmol/L乙酸銨和25 mmol/L氨水的溶液,B為乙腈;梯度洗脫程序:0~1 min,5% A、95% B;1~14 min,5%~35% A、95%~65% B;14~16 min,35%~60% A、65%~40% B;16~18 min,60% A、40% B;18~18.1 min,60%~5% A、40%~95% B;18.1~23 min,5% A、95% B;流速:0.3 mL/min;進樣量:2 μL。分析時樣品一直置于4 ℃自動進樣器中。

    1.3.3 質(zhì)譜條件

    分別采用ESI正離子和負離子模式進行檢測。離子源溫度600 ℃;氣簾氣壓力30 psi;質(zhì)譜電壓5 500 V(正負兩種模式);質(zhì)譜掃描范圍60~1 000 Da;子離子掃描范圍25~1 000 Da;去簇電壓60 V(正負兩種模式);碰撞能量(35±15)eV。

    1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

    采用XCMS程序進行峰對齊、保留時間校正和提取峰面積。代謝物鑒定采用精確質(zhì)量數(shù)匹配和二級譜圖匹配的方式,檢索自建數(shù)據(jù)庫。對XCMS提取得到的數(shù)據(jù),刪除組內(nèi)缺失值>50%的離子峰。應(yīng)用軟件SIMCA-P 14.1(Umetrics,瑞典)進行模式識別,數(shù)據(jù)經(jīng)Pareto-scaling預處理后,進行多維統(tǒng)計分析,包括無監(jiān)督主成分分析(principal component analysis,PCA)和正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least squaresdiscriminant analysis,OPLS-DA)。依據(jù)不同品系發(fā)育期樣品組間變量投影重要度(variable importance in the projection,VIP)>1、t檢驗的P<0.05篩選組間的顯著差異代謝物[19-20],利用京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)(http://www.genome.jp/kegg/pathway.html)數(shù)據(jù)庫對顯著差異代謝物的代謝通路進行分析。聚類熱圖和箱線圖使用生信云平臺分析(http://cloud.aptbiotech.com/#/ main-page)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同沙棘果肉樣品的PCA

    基于XCMS,在沙棘品系‘Za56’和‘TF2-36’發(fā)育期間的果肉樣品(56G、56O、36G和36O)中共檢測到3 385 個(ESI正離子模式)和2 837 個(ESI負離子模式)代謝特征離子信號。利用SIMCA軟件構(gòu)建無監(jiān)督PCA模型,4 組樣品的數(shù)據(jù)點在PCA得分圖上區(qū)分明顯(圖1),在兩兩比較PCA得分圖中也顯著區(qū)分(圖2),所有樣本均落在95%置信區(qū)間內(nèi),說明代謝組組間的分析數(shù)據(jù)可信度較高[21]。

    圖1 沙棘品系‘Za56’和‘TF2-36’綠色(G)和橙色(O)果肉樣品的PCA得分圖Fig.1 PCA score plots of green (G) and orange (O) pulp samples from sea buckthorn strains ‘Za56’ and ‘TF2-36’

    圖2 4 組樣品在正離子模式(A~D)和負離子模式(E~H)下的PCA得分圖Fig.2 PCA score plots of the four pulp groups in positive(A,B,C and D) and negative ion modes (E,F,G and H)

    2.2 不同沙棘果肉樣品的OPLS-DA

    為獲得4 組樣品間的差異信息,建立有監(jiān)督OPLSDA模型。沙棘品系‘Za56’和‘TF2-36’的綠色和橙色果實樣品點分布在不同區(qū)域并且明顯分為不同簇(圖3),表明4 組樣品在代謝物種類、含量上存在差異。經(jīng)7 次循環(huán)交互驗證發(fā)現(xiàn)R2Y、Q2>0.9(越接近1表明模型越穩(wěn)定可靠)(表1);然后,經(jīng)200 次循環(huán)迭代置換驗證發(fā)現(xiàn)(負值表明未發(fā)生過擬合),因此,建立的OPLS-DA模型穩(wěn)定可靠,具有較高的預測能力[22]。

    表1 OPLS-DA模型的評價參數(shù)Table 1 Evaluation parameters of OPLS-DA models

    圖3 4 組樣品的正離子模式(A~D)和負離子模式(E~H)OPLS-DA得分圖Fig.3 OPLS-DA score plots of the four groups in positive(A,B,C and D) and negative ion (E,F,G and H) modes

    2.3 差異代謝物的篩選與識別

    根據(jù)OPLS-DA獲得的VIP>1和t檢驗的P<0.05篩選組間的顯著差異代謝物。在56G vs.56O、36G vs.36O、56G vs.36G和56O vs.36O比較組中,分別有72、70、83 個和64 個顯著差異代謝物(包括正、負離子模式),在各比較組中,呈下調(diào)趨勢的差異代謝物較多(圖4)。由于同一代謝物可在不同組間均表現(xiàn)差異顯著性,因此,共篩選到124 個顯著差異代謝物,其中正離子模式下有73 個,負離子模式下有51 個?;趯嶒炇易越〝?shù)據(jù)庫和HMDB數(shù)據(jù)庫,識別到上述差異代謝物主要包括有機酸、碳水化合物、脂類、黃酮類、次生代謝物等(圖5),其中,脂類和黃酮是被稱為“軟黃金”沙棘油中最有價值的生物活性成分,在代謝組層面解析了沙棘果肉生物活性成分的代謝特征,為進一步開展轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組關(guān)聯(lián)分析沙棘關(guān)鍵成分的合成機制提供科學依據(jù)[2,4,23]。

    圖5 沙棘品系‘Za56’和‘TF2-36’綠色和橙色果實樣品的顯著差異代謝物熱圖Fig.5 Heatmap of significantly differential metabolites in green and orange berry pulps from ‘Za56’ and ‘TF2-36’ sea buckthorn

    2.4 與脂類合成代謝相關(guān)的顯著差異代謝物分析

    基于4 組果實樣品(56G、56O、36G和36O)間的124 個顯著差異代謝物數(shù)據(jù),進一步利用HMDB數(shù)據(jù)庫和KEGG代謝通路功能分析,共識別到15 個顯著差異代謝物參與脂類、脂肪酸合成積累(表2),它們在4 組樣品中呈現(xiàn)出不同的含量差異(離子峰的相對豐度),根據(jù)箱形圖可直觀反映各差異代謝物在4 組樣品中的豐度變化(圖6)。在‘Za56’和‘TF2-36’果肉發(fā)育過程中,分別識別到8 個和7 個顯著差異代謝物,棕櫚油酸、PC(16:0/16:0)、甘油磷酰膽堿、二羥基丙酮、植物鞘氨醇、二氫鞘氨醇和油酸呈上調(diào)趨勢,尤其,PC(16:0/16:0)、二羥基丙酮和植物鞘氨醇在兩個品系中均顯著上調(diào)(表2);另外,在兩個品系的綠果和橙果時期分別發(fā)現(xiàn)9 個和10 個顯著差異代謝物,PC(16:0/16:0)、甘油磷酰膽堿和二氫鞘氨醇呈上調(diào)趨勢(圖6),但只有甘油磷酰膽堿在兩個比較組中均上調(diào)(表2)。

    表2 沙棘果肉脂類、黃酮和5-羥色胺等合成代謝相關(guān)的顯著差異代謝物Table 2 Significantly differential metabolites associated with the synthesis and metabolism of lipids,flavonoids and serotonin in sea buckthorn berry pulp

    圖6 56G、56O、36G和36O果肉的顯著差異代謝物比較Fig.6 Comparison of significantly differential metabolites between the four groups

    Omega-7脂肪酸通常在深海魚類(如鳳尾魚、鯊魚等)和少數(shù)植物種子(如澳洲堅果、貓爪草等)中積累,沙棘是自然界中罕有的在果肉(非種子組織)中高積累棕櫚油酸(omega-7脂肪酸)的植物[12]。沙棘果肉棕櫚油酸在‘Za56’發(fā)育期間顯著上調(diào),且在56O中顯著高于36O(表2),這與‘Za56’果肉發(fā)育期間的C16:1含量顯著上升,且‘Za56’發(fā)育期間的果肉含量(13.3%~41.30%)顯著高于‘TF2-36’(12.57%~39.03%)的規(guī)律一致[24]。有研究認為沙棘果油中的生物活性成分多于沙棘籽油,尤其,特有的C16:1可降低人體膽固醇、防止心律失常和抑制腫瘤[25]。Yang Baoru等[26]發(fā)現(xiàn)沙棘C16:1等脂肪酸和脂類含量高低與其(亞)種、海拔、采摘時期等有關(guān),而且C16:1含量及以其為主的單不飽和脂肪酸含量占總脂肪酸的比例是評價沙棘果油真?zhèn)渭捌焚|(zhì)的關(guān)鍵指標[27]。

    脂肪酸通常以酯的形式參與各種脂質(zhì)的組成,TAG是植物油的主要成分,其含量與含油率高低密切相關(guān)[28]。脂肪酸的高積累則與其在TAG合成過程中被二酰甘油轉(zhuǎn)移酶(diacylglycerol acyltransferasea,DGAT)和磷脂∶二酰甘油?;D(zhuǎn)移酶(phospholipid∶diacylglycerol acyltransferase,PDAT)催化結(jié)合至TAG有關(guān)[29]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的3-磷酸甘油連續(xù)組裝來自于細胞質(zhì)的acyl-CoA脂肪酸形成DAG后,在DGAT催化下合成TAG,這被稱為依賴acyl-CoA的Kennedy途徑[30];此外,近年來在酵母、蓖麻和擬南芥TAG合成過程中發(fā)現(xiàn)的acyl-CoA獨立途徑也逐漸被重視[31],即利用磷脂(而非acyl-CoA)作為酰基供體,DAG為受體,在PDAT催化下,將磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine,PC)sn-2位的?;D(zhuǎn)移到DAG上,合成TAG[29,31]。研究發(fā)現(xiàn),PC的合成代謝途徑更復雜,在溶血磷脂?;D(zhuǎn)移酶(lysophospholipid acyltransferase,LPCAT)的作用下,溶血磷脂酰膽堿(lysophosphatidylcholine,lysoPC)和游離acyl-CoA反應(yīng)生成PC[32];而且有膽堿存在時,DAG又會被二?;视湍憠A磷酸轉(zhuǎn)移酶催化形成PC[33]。在‘Za56’和‘TF2-36’果實成熟過程中,橙色果實樣品(56O和36O)的PC(16:0/16:0)顯著高于綠色果實(56G和36G),而且在36G中顯著高于56G(表2),表明成熟沙棘果肉的PC(16:0/16:0)相對含量較高,這與‘Za56’和‘TF2-36’果肉發(fā)育期間C16:0含量(分別升高1.5 倍和1.4 倍)和含油率(分別升高1.7 和3.7 倍)逐漸增加的規(guī)律相符[24],因此,PC(16:0/16:0)可能是影響沙棘果肉C16:0含量和含油率的代謝標志物。另外,LysoPC(16:0)和LysoPC(18:1(9Z))的相對含量下調(diào)(表2),這可能與LPCAT優(yōu)先以LysoPC(16:0)和LysoPC(18:1(9Z))為底物而反應(yīng)生成PC有關(guān)[33],而且,膽堿在各比較組中也呈顯著下調(diào)趨勢,即為DAG向PC轉(zhuǎn)化提供了大量供體[29]??梢奓ysoPC(16:0)、LysoPC(18:1(9Z))和膽堿的下調(diào)都與PC合成積累相關(guān)。除此之外,LysoPC還可被溶血磷脂酶I催化生成甘油磷酰膽堿,然后進一步被甘油磷酸二酯酶催化生成膽堿和甘油三磷酸(glycerol 3-phosphate,G3P)[34]。高油品系‘TF2-36’果肉中的甘油磷酰膽堿顯著高于低油品系‘Za56’(表2),而且在果肉發(fā)育期間呈顯著上調(diào)趨勢(圖6),這與PC(16:0/16:0)的變化模式相似,這可能與甘油磷酰膽堿被催化為膽堿和G3P后,分別為PC和TAG合成提供更多前體物質(zhì)有關(guān)。因此,甘油磷酰膽堿也可能是影響沙棘果肉含油率高低的代謝標志物。

    2.5 與黃酮合成代謝相關(guān)的顯著差異代謝物分析

    沙棘油之所以被譽為“軟黃金”,還在于其富含多種黃酮類物質(zhì)。根據(jù)HMDB數(shù)據(jù)庫和KEGG代謝通路分析,在4 組果實樣品(56G、56O、36G和36O)的代謝組比較中,共識別到7 個與黃酮合成相關(guān)的顯著差異代謝物(表2),分別為異鼠李素、水仙堿/異鼠李素-3-O-蕓香糖苷、山柰酚-3-O蕓香糖苷、兒茶素、柚皮素、蘆丁和原花青素B2,其中,只有異鼠李素在發(fā)育期間呈上調(diào)趨勢,它們具有抗氧化、抗病毒等生物活性,在防治炎癥、癌癥和心腦血管疾病等方面作用明顯[35-36]。沙棘不同品種、組織器官(果肉、種子、葉片等)和發(fā)育時期的黃酮類成分含量差異明顯[37-39]。在沙棘果汁中異鼠李素含量最高(25.1~31.1 mg/100 g),其次為槲皮素(7.7~8.1 mg/100 g)和山柰酚(1.2~1.6 mg/100 g)[37];在沙棘全果實(含果肉和種子)中槲皮素(6.7~17.5 mg/100 g)和異鼠李素(4.5~10.6 mg/100 g)含量也較高[38]。在‘Za56’和‘TF2-36’果肉發(fā)育期間分別識別到4 個和5 個顯著差異代謝物,其中顯著上調(diào)的僅有異鼠李素(表2),差異倍數(shù)(fold change,F(xiàn)C)分別達3.76和2.50,其他顯著差異代謝物均不同程度的下調(diào)(圖6),這與沙棘果汁中異鼠李素含量較高的規(guī)律相符[37]。在56G vs.36G和56O vs.36O比較組中分別發(fā)現(xiàn)7 個和5 個顯著差異代謝物,均顯著上調(diào)(表2),即它們在‘TF2-36’果肉中的合成量一直高于‘Za56’(圖6)。有研究發(fā)現(xiàn)沙棘總黃酮含量在果肉發(fā)育期間先下降后上升,而異鼠李素含量在沙棘果實發(fā)育期間呈顯著上升趨勢,這可能與兒茶素、山柰酚和蘆丁含量顯著下降有關(guān)[37,40],溫秀鳳等[41]發(fā)現(xiàn)沙棘葉游離總黃酮在7月中下旬急劇下降,其中,槲皮素、山柰酚和蘆丁含量也均呈下降趨勢。這與‘Za56’和‘TF2-36’果肉中異鼠李素上調(diào)和兒茶素下調(diào)的變化規(guī)律相似。因此,異鼠李素可能是影響沙棘果肉黃酮含量高低的代謝標志物。

    2.6 5-羥色胺等生物活性成分分析

    5-羥色胺是一種單胺類神經(jīng)遞質(zhì),具有廣泛的生物學活性,參與調(diào)節(jié)神經(jīng)活動、胃腸道功能、止凝血過程與機體免疫等多種生理過程[42]。有研究發(fā)現(xiàn),沙棘莖和葉中富含5-羥色胺(分別為840~4 410 μg/g和12.5~213.8 μg/g),且其提取物具有抗癌、抗菌和清除自由基活性[43-44]。利用UPLC-MS技術(shù)在沙棘果肉中發(fā)現(xiàn)了5-羥色胺及其上下游代謝物,其中5-羥色胺及其前體色胺在各比較組中均呈下調(diào)趨勢,而其代謝產(chǎn)物N-乙酰羥色氨在各比較組中均顯著上調(diào)(表2),可見,二者之間的關(guān)鍵酶芳香基胺N-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性對5-羥色胺的合成積累具有重要影響[45],這可為解析沙棘5-羥色胺合成代謝機理提供科學依據(jù),也為利用基因工程技術(shù)提高5-羥色胺含量提供了關(guān)鍵靶點。

    許多研究表明,沙棘果實、葉片和莖提取物具有抗氧化、抗癌和抗腫瘤活性[46-48]。本實驗組在沙棘果肉中首次發(fā)現(xiàn)卡培他濱,有研究表明,它通過抑制細胞分裂、干擾RNA和蛋白質(zhì)合成抑制腫瘤生長,是一種對癌細胞具有高選擇性的口服抗癌藥物[49]。在‘Za56’和‘TF2-36’果肉變色成熟期間,卡培他濱均顯著上調(diào)(FC分別為1.32和2.63)(表2)。此外,在沙棘果肉中還發(fā)現(xiàn)了γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)、白藜蘆醇、甜菜堿、焦兒茶酚、VC和VB6等顯著差異代謝物。尤其,‘TF2-36’成熟果肉(36O)中的GABA含量顯著高于56O(FC=2.13)(表2),這與沙棘果肉的非靶向1H核磁共振代謝組研究結(jié)果相似[5]。GABA是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì),具有鎮(zhèn)定、抗癌、降脂、降壓等功能[50]。發(fā)現(xiàn)并解析沙棘果肉的生物活性成分合成規(guī)律,為利用其為原料研發(fā)抗癌、抗抑郁,治療心血管和精神類疾病等藥物提供科學依據(jù)。

    3 結(jié)論

    采用UPLC-MS技術(shù)對2 個沙棘品系發(fā)育期間(綠色和橙色)的果肉進行了非靶向代謝組學研究。分析發(fā)現(xiàn)4 組樣品間存在較大的代謝差異,并識別到124 個顯著差異代謝物,包括有機酸、碳水化合物、脂類、黃酮類和次生代謝物等;根據(jù)KEGG代謝通路分析,分別識別到15、7 個和4 個顯著差異代謝物與脂類、黃酮和5-羥色胺合成代謝相關(guān),以及其他8 個與抗癌功能相關(guān)的顯著差異代謝物。PC(16:0/16:0)和甘油磷酰膽堿在各比較組中均顯著上調(diào),它們是影響沙棘果肉含油率高低的代謝標志物。異鼠李素在各比較組中均顯著上調(diào),與沙棘果肉中富含黃酮密切相關(guān)。此外,N-乙酰羥色氨、卡培他濱和GABA等抗癌相關(guān)生物活性成分在‘Za56’和‘TF2-36’果肉發(fā)育期間也呈現(xiàn)出相對較高的含量。本研究采用非靶向代謝組學方法較為系統(tǒng)地闡明了不同沙棘品系果肉發(fā)育期間的代謝組差異,將為解析沙棘生物活性成分合成代謝機制以及相關(guān)功能產(chǎn)品開發(fā)提供科學依據(jù)。

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