醬香白酒第5輪次窖池發(fā)酵不同分層酒醅微生物群落與感官、理化性質差異分析

王玉榮，侯強川，田龍新，劉菊珍，周加平，郭 壯,*

（1.湖北文理學院 湖北省食品配料工程技術研究中心，湖北 襄陽 441053；2.襄陽市醬香型白酒固態(tài)發(fā)酵企校聯(lián)合創(chuàng)新中心，湖北 襄陽 441053；3.醬香型白酒固態(tài)發(fā)酵襄陽市重點實驗室，湖北 襄陽 441614）

白酒（又稱高粱酒）是我國一種傳統(tǒng)的蒸餾酒，深受廣大消費者的喜愛[1]。其主要以谷物等為原料，經(jīng)純糧固態(tài)或半固態(tài)發(fā)酵而成，這也是與其他蒸餾酒的主要差異之一[2]。白酒按香型劃分為醬香型、濃香型和清香型等十二種香型[3]，其中醬香型的釀造工藝最為復雜和獨特，其糧曲原料在長達一年的生產周期中，需經(jīng)過多次發(fā)酵和多輪取酒[4-5]。相關研究已經(jīng)證實，不同輪次所獲得的白酒品質存在較大的差異，且基酒品質以第3、4、5輪次較好，亦被人稱為“大輪回”[6]?；平?jīng)過陳釀和精心勾調后方可獲得醬香型成品白酒，具有醬香、醇厚、細膩和回味悠長等特點[7]。

醬香型白酒作為傳統(tǒng)的發(fā)酵酒，其品質與發(fā)酵微生物的組成和多樣性具有密切的聯(lián)系[8]，Hou Qiangchuan等[9]已經(jīng)證實3 種低溫大曲中微生物的結構和功能存在較大差異，且大曲的品質直接或間接影響成品酒的香氣和質量。醬香型白酒的發(fā)酵屬于開放式發(fā)酵，使得酒醅作為一個天然的培養(yǎng)基，不僅包含大曲中的微生物，還可以富集生產環(huán)境中的微生物進行發(fā)酵[10]，而不同產地的白酒即使工藝相同，其品質也存在細微的差異[11]。因此，研究人員針對酒醅中的微生物展開了大量卓有成效的研究。崔守瑜等[10]基于純培養(yǎng)技術對貴州醬香型白酒發(fā)酵過程中的不同輪次發(fā)酵過程酒醅中微生物構成進行解析，發(fā)現(xiàn)不同輪次酒醅中微生物構成存在較大差異；張春林等[12]對第2輪次酒醅中微生物多樣性及其理化特性進行關聯(lián)分析，結果顯示許多微生物對酒醅的理化性質具有較大的影響。在白酒基酒取酒過程中采用“分層起槽”的方式[13]，王玉榮等[14]對第4輪次不同分層酒醅的理化性質和微生物多樣性進行了研究，并證實不同分層中酒醅的理化指標和微生物構成存在明顯差異，且差異主要是由溫度導致。

湖北作為醬香型白酒生產的重要省份，目前少有科研人員針對該地區(qū)醬香型白酒酒醅展開系統(tǒng)的研究，特別是不同輪次酒醅中微生物在白酒發(fā)酵過程中的影響尚不明確。本研究采用高通量測序技術對第5輪次不同分層酒醅中微生物構成和多樣性進行解析，并通過多組學手段對酒醅的理化和感官指標進行分析，探究微生物在第5輪次白酒發(fā)酵過程中的作用，為后續(xù)發(fā)酵工藝的改良提供必要的數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

平板計數(shù)培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術有限責任公司；氫氧化鈉、氯化鈉、酒石酸鉀鈉、葡萄糖 國藥集團化學試劑有限公司；DNeasy mericon Food Kit DNA基因組提取試劑盒 德國QIAGEN公司。

1.2 儀器與設備

SA 402B電子舌 日本Insent公司；PEN3電子鼻德國Airsense公司；CN-KT001電子天平 深圳千確電子有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華（常州）儀器制造有限公司；LRH-150數(shù)顯生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；K1100凱氏定氮儀 海能未來技術集團股份有限公司；DG250型厭氧工作站 英國Don Whitley公司；R930機架式服務器 美國Dell公司；MiSeq高通量測序平臺 美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集與前處理

本研究所有醬香型酒醅樣本均采集自湖北省襄陽市某酒廠，采用時間為2021年7月。本研究所涉及的窖池長寬高分別為4.8、2.3 m和1.8 m，并按照由低到高分為下層（距池底60 cm，溫度32 ℃）、中層（距池底120 cm，溫度33～35 ℃）和上層（距池底180 cm，溫度37 ℃）。分別對窖池第5輪次不同分層酒醅樣本進行采集（所有酒醅樣本在池中的發(fā)酵時間為28 d），每層采集5 份樣本（對角線交點和4 個角落）。上層酒醅編號分別為F5S1～F5S5；中層酒醅編號分別為F5Z1～F5Z5；下層酒醅編號分別為F5X1～F5X5。每份酒醅樣本分別采集600 g，并一式兩份至于無菌無酶的自封袋中低溫運回鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，一份立即用于活菌計數(shù)，一份于－80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 理化特征分析

參照GB 5009.5—2016《食品中蛋白質的測定》中凱氏定氮法對酒醅中蛋白質含量進行測定[15]；參照DB 34/T 2264—2014《固態(tài)發(fā)酵酒醅分析方法》中滴定法對酒醅酸度進行測定，并采用葡萄糖標準溶液反滴定法對酒醅中還原糖和淀粉含量進行測定[16]；準確稱取4 g酒醅樣本于專用樣品盤中，并使用鹵素水分測定儀對其水分含量進行測定[14]。

1.3.3 活菌計數(shù)

參照GB 4789.35—2016《乳酸菌檢驗》方法對酒醅中細菌和乳酸菌總數(shù)進行計數(shù)[17]；參照GB 789.15—2016《霉菌和酵母計數(shù)》方法對酒醅中霉菌和酵母菌總數(shù)進行計數(shù)[18]。

1.3.4 酒醅滋味品質分析

準確稱取20 g酒醅樣本于100 g蒸餾水中攪拌均勻后12 000 r/min離心10 min，取上清液抽濾后置于4 ℃冰箱中24 h，取下清液備用。使用電子舌對濾液的酸味、苦味、澀味、咸味和咸味等基本味，以及后味A（澀的回味）、后味B（苦的回味）和豐度（鮮的回味）等基本味的回味進行數(shù)字化測定，并均以F5S1為對照，每份樣品重復測定4 次，取后3 次數(shù)據(jù)為本實驗的測試數(shù)據(jù)用于后續(xù)分析[19]。

1.3.5 酒醅風味品質分析

準確稱取15 g酒醅樣本于電子鼻樣品瓶中封口，置于60 ℃水浴鍋中保溫20 min，并于室溫平衡20 min。樣品采用頂空進樣，平行測定3 次。使用電子鼻對酒醅樣本的風味特征進行采集，電極響應曲線在50 s后達到平臺期，選用59、60 s和61 s所對應的響應值進行后續(xù)分析[20]。

1.3.6 微生物多樣性分析

使用微生物基因組提取試劑盒對酒醅樣本中微生物的宏基因組DNA進行提取，并使用微量紫外分光光度計對提取物的純度和濃度進行檢測，將檢測合格的DNA提取物置于－80 ℃?zhèn)溆?。分別使用帶有核苷酸標簽（Barcode）的338F/806R和ITS1F/ITS2R引物對酒醅中細菌的16S rRNA和真菌的ITS序列進行擴增[21-22]。使用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳對擴增產物進行檢測，并將檢驗合格的擴增產物使用Illumina MiSeq平臺進行雙端測序。

參照Yang Chengcong等[23]的方法對下機序列進行質控，基于QIIME（v1.7.1）平臺對酒醅樣本中微生物的構成和多樣性進行分析[24]。首先，本研究參照崔夢君等[25]對莽椒中細菌中微生物的多樣性分析的主要步驟對酒醅中微生物構成和多樣性進行解析。同時，參照Wang Yurong等[20]對豆豉中真菌多樣性的主要分析步驟對酒醅中真菌微生物的構成和多樣性進行解析。進一步將獲得的代表性序列與標準數(shù)據(jù)庫進行同源性比對，通過4 種α多樣性指數(shù)（Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Chao1指數(shù)和發(fā)現(xiàn)物種數(shù)）對酒醅中微生物多樣性和豐富度進行分析，并通過加權/非加權的Uni-Frac距離進行主坐標分析。本研究下載了醬香白酒第4輪次窖池不同分層酒醅微生物序列數(shù)據(jù)與本研究數(shù)據(jù)進行了合并分析[14]。

1.3.7 下載數(shù)據(jù)的核酸登錄號

本研究下載醬香白酒第4輪次窖池不同分層酒醅微生物序列數(shù)據(jù)納入分析，該數(shù)據(jù)在MG-RAST數(shù)據(jù)庫的登錄號為mgp102959。

1.4 數(shù)據(jù)分析及可視化

本研究使用Wilcoxon test對不同分層和輪次酒醅中微生物相對豐度、α多樣性指數(shù)和酒醅的理化指標進行顯著性分析；使用R軟件對酒醅中的潛在關鍵物種進行識別；使用Spearman秩相關性分析對酒醅中部分菌屬和其理化指標及感官品質進行分析，并使用Gephi軟件進行網(wǎng)絡圖繪制。其他數(shù)據(jù)的可視化均使用R（V 4.2.2）軟件和Origin 2021完成。

2 結果與分析

2.1 不同分層酒醅理化指標和活菌計數(shù)分析

酒醅作為重要的發(fā)酵基質，其理化特性不僅直接影響著白酒的品質，還通過影響微生物生長間接影響白酒的品質。本研究首先對酒醅的酸度、水分含量和淀粉含量等理化指標進行了比較分析，結果如表1所示。

表1 不同分層酒醅理化特性和活菌計數(shù)Table 1 Physicochemical properties and viable microbial counts of different layers of alcoholic fermentative material

由表1可知，在檢測的6 個指標中，僅蛋白質含量在不同分層中差異不顯著（P＞0.05）；中層酒醅的酸度、乙醇體積分數(shù)、淀粉含量和還原糖含量均顯著高于下層（P＜0.05），其中淀粉含量和還原糖含量亦顯著高于上層（P＜0.05）；而上層的水分含量和還原糖顯著高于下層（P＜0.05）。由此可見，不同分層酒醅中的理化指標存在較大差異。為此，本研究使用純培養(yǎng)技術對酒醅中的乳酸菌、菌落總數(shù)、酵母菌和霉菌進行計數(shù)以初步估計酒醅中的微生物數(shù)量。結果顯示，乳酸菌在上中下層中的乳酸菌數(shù)分別為4.07、4.00（lg（CFU/g））和4.08（lg（CFU/g））；菌落總數(shù)分別為5.34、5.67（lg（CFU/g））和5.63（lg（CFU/g））；而酵母菌和霉菌數(shù)分別為5.50、5.61（lg（CFU/g））和5.20（lg（CFU/g））。而經(jīng)檢驗發(fā)現(xiàn)，不同分層酒醅中菌落總數(shù)、乳酸菌數(shù)、酵母菌和霉菌數(shù)差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 不同分層酒醅感官品質差異分析

通過酒醅風味在一定程度上可以反映成品酒的品質，在前期通過對酒醅滋味和風味品質進行分析，對于控制成品酒的質量十分重要。因此，本研究通過仿生設備對不同分層酒醅的感官品質進行了數(shù)字化分析，結果如圖1所示。

圖1 不同分層酒醅滋味（A）和風味（B）比較分析Fig.1 Comparative analysis of taste (A) and flavor (B) of different layers of alcoholic fermentative material

由圖1A可知，在5 個基本味中，上中下層的澀味和咸味均不存在顯著差異（P＞0.05），而酸味強度在上層酒醅中顯著高于中層和下層（P＜0.05），苦味強度在上層酒醅中顯著低于中層（P＜0.05），而鮮味在上層酒醅中顯著低于中層和下層（P＜0.05）；在3 個基本味的回味中，上中下層的后味-A差異不顯著（P＞0.05），而上層酒醅的后味-B和豐度顯著低于中層和下層（P＜0.05）。由圖2B可知，第5輪次不同分層酒醅在W1C、W3C、W5C、W2S、W2W和W3S上均差異不顯著（P＞0.05），但下層酒醅在W5S、W6S、W1S和W1W均顯著高于中層（P＜0.05），而與上層無顯著差異（P＞0.05）。

圖2 不同分層酒醅中微生物屬水平構成Fig.2 Genus-level composition of microbial communities in different layers of alcoholic fermentative material

2.3 不同分層和輪次微生物群落差異分析

微生物在白酒發(fā)酵過程中十分重要，而酒醅作為微生物發(fā)酵的主要載體，對酒醅中微生物多樣性進行解析十分必要。本研究采用高通量測序技術對酒醅中微生物的構成進行解析，結果如圖2所示。

由圖2a可知，不同分層酒醅中優(yōu)勢細菌屬（平均相對含量大于1.00%）共有8 個，分別為Acetilactobacillus、Lactobacillus和Thermoactinomyces等，其平均相對含量分別為50.23%、9.65%和8.46%。由圖2b可知，不同分層酒醅中的優(yōu)勢真菌屬（平均相對含量大于1.00%）共有7 個，分別為Sarocladium、Thermoascus和Rasamsonia，其平均相對含量分別為74.18%、10.43%和3.55%。值得注意的是，不同分層酒醅中微生物的優(yōu)勢細菌構成存在較大的差異，而優(yōu)勢真菌構成的差異較小。因此，本研究對不同分層和輪次酒醅中優(yōu)勢菌屬的差異進行了分析，結果表2所示。

表2 不同輪次和分層酒醅屬水平的比較分析Table 2 Comparative analysis of bacterial and fungal communities at genus level in different rounds and layers of alcoholic fermentative material

由表2可知，酒醅的15 個優(yōu)勢菌屬中有10 個菌屬在不同輪次或分層中存在顯著差異（P＜0.05），其中8 個為細菌屬，2 個為真菌屬。進一步分析發(fā)現(xiàn)，優(yōu)勢菌屬在第4輪次的不同分層中存在較大差異，在第5輪次的不同分層中差異較小。同時，本研究亦發(fā)現(xiàn)，優(yōu)勢細菌屬的相對豐度在酒醅的上層均差異不顯著（P＞0.05），差異主要集中在酒醅中層和下層，而優(yōu)勢真菌屬的差異則主要集中在酒醅上層和中層。

2.4 不同分層和輪次微生物多樣性差異分析

在解析第5輪次酒醅中微生物構成的基礎上，本研究進一步對微生物的多樣性進行比較分析，以進一步解析不同輪次和分層中微生物菌群結構的差異，其比較結果如圖3所示。

圖3 不同輪次和分層酒醅微生物α多樣性指數(shù)比較分析Fig.3 Comparative analysis of bacterial and fungal α-diversity indexes in different rounds and layers of alcoholic fermentative material

由圖3A、B可知，第5輪次上層酒醅細菌群落的Shannon指數(shù)顯著低于中層和下層（P＜0.05）；而Chao1指數(shù)顯著高于下層（P＜0.05），但與中層無顯著差異（P＞0.05）。由圖3C、D亦可知，第5輪次不同分層酒醅中真菌群落的Shannon指數(shù)無顯著差異（P＞0.05），而上層真菌微生物的Chao1指數(shù)顯著高于中層和下層（P＜0.05）。值得注意的是，本研究在第4輪次上并沒有發(fā)現(xiàn)類似的規(guī)律，且第4輪次不同分層酒醅細菌群落的Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)均無顯著差異（P＞0.05）。對比第4、5輪次中微生物的多樣性發(fā)現(xiàn)，不同分層的微生物群落的Shannon和Chao1指數(shù)亦存在較大差異。本研究進一步基于加權Uni-Frac距離對不同輪次和分層的酒醅微生物群落結構進行主坐標分析，結果如圖4所示。

圖4 基于Uni-Frac距離的不同輪次和分層酒醅微生物主坐標分析Fig.4 PCoA plots of microorganisms in different rounds and layers of alcoholic fermentative material based on Uni-Frac distance

由圖4A可知，第4輪次酒醅樣本幾乎全部位于X軸負半軸，而第5輪次酒醅樣本則幾乎全部位于X軸正方向，兩者在二維空間上呈現(xiàn)明顯的分離趨勢。對比不同分層酒醅發(fā)現(xiàn)，第4輪次不同分層酒醅中微生物的群落結構較為相似，而第5輪次則呈現(xiàn)相反的趨勢。由圖4B可知，第4、5輪次酒醅樣本分別位于X軸的負方向和正方向，兩者呈完全分離趨勢。但與圖4A所不同，第4輪不同分層酒醅樣本較為分散，而第5輪不同分層酒醅樣本較為集中。由此可見，不同輪次酒醅中微生物結構存在較大的差異。

2.5 微生物群落與理化指標間關聯(lián)分析

為探究酒醅微生物對其品質的影響，本研究采用Spearman秩相關性分析對酒醅中優(yōu)勢菌屬與理化特性及感官品質進行了解析，相關性分析結果如圖5所示。

圖5 不同分層酒醅中理化指標、感官品質與優(yōu)勢菌屬的相關性分析Fig.5 Correlation analysis of physicochemical and sensory quality and dominant microbial genera in different layers of alcoholic fermentative material

由圖5可知，第5輪次酒醅中的優(yōu)勢菌屬與其各品質指標間存在這較為復雜的相關關系。水分含量與Bacillus顯著負相關（P＜0.05），而與Zygosaccharomyces顯著正相關（P＜0.05）；酸度、乙醇體積分數(shù)和淀粉含量均與Lactobacillus及Levilactobacillus顯著正相關（P＜0.05）；酒醅中還原糖含量與微生物的相關關系較為復雜，其與Lactobacillus及Levilactobacillus顯著正相關（P＜0.05），而與Lentibacillus、Kroppenstedtia和Thermoactinomyces、Candida和Zygosaccharomyces顯著負相關（P＜0.05）。進一步分析發(fā)現(xiàn)，Lactobacillus與W1S、W5S、W1W、W6S和W2W顯著負相關（P＜0.05），而與W5C顯著正相關（P＜0.05）；Acetilactobacillus、Thermoascus和Rasamsonia與苦味顯著負相關（P＜0.05），而Lentibacillus、Bacillus、Kroppenstedtia和Thermoactinomyces與后味-B顯著正相關（P＜0.05）。

3 討論

酒醅作為醬香型白酒發(fā)酵的重要基質，對其品質的好壞具有決定作用[26]。相關研究已經(jīng)證實第4、5輪次酒醅所發(fā)酵的基酒品質最佳[6]。本研究團隊在前期針對同一窖池第4輪次不同分層酒醅中的微生物和感官理化性質進行了分析，發(fā)現(xiàn)同一窖池不同空間分布酒中下層酒醅微生物及風味組成更為獨特[14]。在此基礎上，本研究針對醬香白酒第5輪次窖池不同分層酒醅展開了進一步研究。

盡管同一窖池不同分層酒醅中的溫度和水分等環(huán)境因素存在較大差異[10]，但菌落總數(shù)、乳酸菌數(shù)、酵母菌和霉菌數(shù)均無明顯差異，這與第4輪次檢測結果存在較大的差異[14]，這可能與窖池深度和發(fā)酵輪次有關[27]。在理化指標上，第5輪次中層和下層的差異較大，中層酒醅的酸度、乙醇體積分數(shù)、淀粉含量和還原糖等指標均高于下層，而上述指標均與微生物的生長存在密切的關系，且微生物亦可通過自身代謝影響其含量。因此，許多經(jīng)驗豐富的釀酒師可以通過上層指標判斷發(fā)酵進程和基酒的品質[28]。隨著窖池深度的增加，酒醅的水分含量呈現(xiàn)明顯下降趨勢，這與酒醅的發(fā)酵溫度密切相關。酒醅下層的溫度較高，上層溫度較低，這使得水分向上遷移，而水分含量和溫度的差異可能直接導致酒醅菌群結構存在較大的差異。進一步分析發(fā)現(xiàn)中層和下層酒醅的滋味品質較為相似，而上層酒醅較為獨特，而值得注意的是，上層酒醅的苦味和苦的回味較淡。在風味方面，上層和中層酒醅整體較為接近，與下層差異較大，但不同分層在芳香味上均無明顯關系，而有研究表明白酒的芳香味的陳釀有關[29]。由此可見，第5輪次不同分層酒醅中理化和感官品質之間均存在較大差異。

測序結果顯示第5 輪次酒醅中的優(yōu)勢菌屬分別為Acetilactobacillus、Lactobacillus、Sarocladium和Thermoascus等，與前人的研究一致[30]。相關研究證實Acetilactobacillus、Lactobacillus和Thermoascus可積極參與白酒的發(fā)酵進程，且Acetilactobacillus和Lactobacillus對于白酒的香味形成具有積極作用[30]。通過對不同輪次和分層酒醅中的差異菌屬進行甄別發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢菌屬在第4輪次的不同分層酒醅中存在較大差異，但在第5輪次酒醅中差異較小。值得注意的是，大部分優(yōu)勢菌屬在第5輪次的酒醅中富集，其相對豐度明顯高于第4輪次。在α多樣性方面，不同輪次之間亦存在較大差異，但第4輪次不同分層之間差異較小，而第5輪次不同分層之間差異較大。同時，在β多樣性亦發(fā)現(xiàn)相同的規(guī)律。由此可見，不同輪次中微生物構成和分布規(guī)律存在較大的差異，而上述差異可能導致基酒的品質的不穩(wěn)定。因此，為保證基酒品質的穩(wěn)定，針對不同輪次對工藝進行調整十分必要。

相關性分析進一步證實了微生物在生態(tài)中存在的積極作用，由于不同發(fā)酵條件的差異使得微生物的構成存在明顯的差異。相關研究證實，復雜生態(tài)環(huán)境中大部分微生物功能會存在“冗余”現(xiàn)象[31]，這也導致盡管不同酒醅中微生物結構存在一定差異，但酒醅的已知可測諸多屬性基本相同。本研究中第5輪次不同分層酒醅理化感官品質之間存在較大差異，這可能是由部分微生物的特殊功能相關[9]。

4 結論

本研究發(fā)現(xiàn)，第5輪次酒醅發(fā)酵的白酒品質較佳，不同分層酒醅的理化指標、微生物生長等存在差異。在后續(xù)研究中應進一步擴大酒醅的采樣范圍和數(shù)量，并結合純培養(yǎng)、宏基因組學和全基因組學技術進一步解析微生物在醬香型白酒多輪次發(fā)酵過程中的積極作用，以持續(xù)揭示傳統(tǒng)工藝、功能微生物群落演替、原酒品質之間的內在規(guī)律，為工藝創(chuàng)新和原酒品質提升奠定必要基礎。