濃香型大曲貯存期微生物群落演替及代謝產(chǎn)物的變化機(jī)制

徐千惠，饒家權(quán)，鄒永芳，張 明，羅惠波,3，黃 丹,3,*

（1.四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院，四川 自貢 643000；2.舍得酒業(yè)股份有限公司，四川 射洪 629000；3.釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 自貢 643000）

大曲作為糖化發(fā)酵劑，為白酒釀造提供了重要且豐富的菌系、酶系和物系，即為后續(xù)窖內(nèi)酒醅發(fā)酵提供微生物，將原料降解成小分子物質(zhì)的水解酶或催化酯類物質(zhì)合成的酯化酶，以及白酒風(fēng)味物質(zhì)或其前體物[1]。大曲生產(chǎn)過(guò)程通常包括1 個(gè)月左右的主發(fā)酵期和2～6 個(gè)月左右的貯存期[2]。在主發(fā)酵期，來(lái)自于制曲原料及環(huán)境的微生物生長(zhǎng)代謝，通過(guò)開(kāi)關(guān)門窗、揭蓋草簾進(jìn)行工藝調(diào)控，其間，溫度、濕度等不斷變化，微生物菌群發(fā)生演替，同時(shí)積累了豐富的酶系以及風(fēng)味物質(zhì)[3]。而在貯存期，大曲大多是在自然條件下堆積存放[4]，期間水分、酸度和淀粉的變化相對(duì)穩(wěn)定[5]，初級(jí)、次級(jí)代謝過(guò)程以及各種微生物和代謝物發(fā)生復(fù)雜變化[6]。目前對(duì)大曲質(zhì)量的判斷主要依賴于長(zhǎng)期積累的生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)和部分理化性質(zhì)，這使得大曲的生產(chǎn)質(zhì)量充滿不穩(wěn)定性[2]。近年來(lái)，關(guān)于大曲主發(fā)酵期間微生物群落及功能變化機(jī)制的研究非?；钴S[7-9]，而貯存期大曲微生物群落結(jié)構(gòu)、酶系以及風(fēng)味物質(zhì)變化也越來(lái)越受到關(guān)注。Fan Guangsen等[2]通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)大曲在通風(fēng)良好、干燥的貯存環(huán)境中微生物會(huì)進(jìn)一步相互作用，達(dá)到優(yōu)化微生物群落的效果，同時(shí)發(fā)現(xiàn)清香型大曲經(jīng)貯存后酯化力和發(fā)酵力增加，而液化力和糖化力變化不大。He Muwen等[10]采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（headspace-solid phase microextraction-gas chromatography mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）聯(lián)用技術(shù)測(cè)定貯存期大曲揮發(fā)性代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)風(fēng)味物質(zhì)種類逐漸積累，在貯存3 個(gè)月含量達(dá)到最高，而Zhang Yuandi等[11]發(fā)現(xiàn)貯存使揮發(fā)性化合物的種類和含量有所下降?？傊F(xiàn)有研究顯示貯存過(guò)程對(duì)大曲質(zhì)量具有重要影響，但關(guān)于貯存期大曲微生物群落結(jié)構(gòu)及代謝產(chǎn)物變化機(jī)制的研究鮮有報(bào)道。

對(duì)于微生物群落的演替機(jī)制，人們廣泛認(rèn)可隨機(jī)性過(guò)程和確定性過(guò)程同時(shí)影響菌群的組裝過(guò)程[12]。Tan Yuwei等[13]采用構(gòu)建零模型的方法評(píng)估了白酒發(fā)酵過(guò)程中微生物群落的組裝模式，結(jié)果顯示微生物群落的演替既受確定性因素（溫度、有機(jī)酸和乙醇）的驅(qū)動(dòng)，也受隨機(jī)性過(guò)程的驅(qū)動(dòng)。Xu Min等[14]發(fā)現(xiàn)微生物的生態(tài)位差異也影響著群落的構(gòu)建過(guò)程。大曲代謝物的變化被發(fā)現(xiàn)與微生物群落的演替緊密相關(guān)[6]。Gan Shuheng等[4]通過(guò)宏基因組測(cè)序獲得了糖化力、液化力與桿菌綱、曲霉屬、羅山松屬和散囊菌目間的正相關(guān)關(guān)系。He Muwen等[10]采用相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析揮發(fā)性化合物與微生物之間的關(guān)聯(lián)，結(jié)果顯示，曲霉屬、根毛霉屬、芽孢桿菌屬、橫梗霉屬與酯類的形成呈正相關(guān)。

對(duì)于固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)而言，熱量、水和氧氣難以傳遞，Zhang Yuandi等[11]發(fā)現(xiàn)同一塊大曲不同部位的微生物群和揮發(fā)性物質(zhì)具有不同的分布特征，因此大曲曲心和曲皮的微生物生長(zhǎng)代謝存在差異。本研究旨在通過(guò)高通量測(cè)序解析濃香型大曲的曲心和曲皮在貯存期間發(fā)生的微生物群落結(jié)構(gòu)變化，并分析糖化酶、液化酶活力的變化，利用HS-SPME-GC-MS研究揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的差異，構(gòu)建零模型解析微生物群落的組裝過(guò)程，運(yùn)用相關(guān)性分析探究糖化力、液化力、風(fēng)味物質(zhì)與大曲微生物之間的聯(lián)系，揭示濃香型大曲貯存期菌系、酶系以及物系的變化機(jī)制，為優(yōu)化大曲貯存工藝、提高大曲質(zhì)量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大曲由遂寧市某濃香型白酒廠提供。

E.Z.N.A.?Soil DNA Kit 美國(guó)Omega BioTek公司；2-辛醇（色譜純）美國(guó)Sigma公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)色譜純或分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf股份公司；Nano Drop 2000紫外分光光度計(jì) 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭 美國(guó)Supelco公司；7890A/5975B GC-MS聯(lián)用儀 美國(guó)Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

每塊大曲約4 kg，被分為兩個(gè)部分：1.5 cm厚的外層命名為曲皮（QP），其余的內(nèi)層命名為曲心（QX）[15]。分別于不同貯存時(shí)期（0、9、43、108、161 d）在曲庫(kù)的對(duì)角線兩端及中點(diǎn)處各選取一塊大曲，將這3 塊大曲的曲皮、曲心迅速粉碎后分別混合，密封在無(wú)菌袋中，于－80 ℃冰箱中保存。

1.3.2 DNA提取和高通量測(cè)序

準(zhǔn)確稱取7 g大曲，用E.Z.N.A.?Soil DNA Kit試劑盒提取大曲微生物DNA，用Nano Drop 2000紫外分光光度計(jì)測(cè)定其純度與濃度。使用引物338F/806R（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAGAG-3’/5’-GGACTACHVGGTWTCTAAT-3’）擴(kuò)增細(xì)菌16 SrRNA 基因的V3～V4 可變區(qū)，用引物ITS1f/2043R（5’-CTTGGTCATTAGGAAGA-3’/5’-GCTGCGTTCTTCATC GATGC-3’）擴(kuò)增真菌rRNA基因的ITS1區(qū)[16]，采用Illumina平臺(tái)進(jìn)行雙端測(cè)序[15]。

1.3.3 酶活力的測(cè)定

糖化力和液化力根據(jù)Zhang Yuting等[17]的方法進(jìn)行測(cè)定。糖化力為1 g大曲在1 h內(nèi)將可溶性淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖的毫克數(shù)；液化力為1 g大曲在1 h內(nèi)液化淀粉的克數(shù)。

1.3.4 揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的測(cè)定

稱取2 g樣品加到20 mL頂空瓶中，再加入2 g NaCl和50 μL質(zhì)量濃度為10 mg/L的2-辛醇。將50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭插入頂空瓶于50 ℃條件下萃取吸附30 vmin。取出萃取頭插入GC儀進(jìn)樣口，在250 ℃條件下解吸5 min，采用陳瑩琪等[16]的方法進(jìn)行GC-MS檢測(cè)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

測(cè)序原始序列通過(guò)DADA2進(jìn)行質(zhì)控操作，基于100%的序列相似性聚類得到特征序列。采用RStudio 4.1.3進(jìn)行主坐標(biāo)分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）、α多樣性分析、Venn圖繪制、群落的平均最近分類單元指數(shù)（beta-nearest taxon index，βNTI）計(jì)算、修正Raup-Crick指數(shù)（RCbray）計(jì)算、生態(tài)位寬度計(jì)算、冗余分析（redundancy analysis，RDA）、Spearman相關(guān)性熱圖繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 濃香型大曲貯存過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)變化

2.1.1 濃香型大曲貯存過(guò)程中優(yōu)勢(shì)微生物群落演替特征大曲微生物在持續(xù)進(jìn)行的貯存過(guò)程中此消彼長(zhǎng)，采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)其演替情況進(jìn)行解析。在大曲貯存期間共注釋到16 個(gè)細(xì)菌門和4 個(gè)真菌門，212 個(gè)細(xì)菌屬和30 個(gè)真菌屬，其中將平均相對(duì)豐度前10的優(yōu)勢(shì)微生物屬變化情況繪制成柱形圖展示。由圖1a可知，曲皮在入庫(kù)貯存第0天的主要優(yōu)勢(shì)細(xì)菌是芽孢桿菌屬（Bacillus）（23.69%）、假單胞菌屬（Pseudomonas）（26.58%）、魏斯氏菌屬（Weissella）（20.94%）等，這種優(yōu)勢(shì)地位到了貯存第43天被鏈球菌屬（Streptococcus）（33.31%）、放線菌屬（Actinomyces）（18.83%）取代。貯存第43～108天，魏斯氏菌屬迅速生長(zhǎng)成為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌（1.41%～63.08%）。貯存第108天和第161天的曲皮細(xì)菌組成較為相似，這與唐賢華等[18]得出的貯存期導(dǎo)致大曲微生物種類趨于平穩(wěn)的研究結(jié)論一致。并且有研究結(jié)果可以解釋這一現(xiàn)象：貯存過(guò)程中溫度、水分、酸度等環(huán)境條件的變化會(huì)導(dǎo)致大曲微生物之間進(jìn)一步相互作用，使群落結(jié)構(gòu)趨于相似，最終形成一種穩(wěn)定體系[19]。而在曲心，貯存前43 d的細(xì)菌組成較為一致，由芽孢桿菌屬、克羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia）、高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）、假單胞菌屬、葡萄球菌屬（Staphylococcus）等組成。假單胞菌屬的相對(duì)豐度最高，呈明顯的上升趨勢(shì)（15.84%～76.70%），而芽孢桿菌屬在持續(xù)下降（43.24%～9.23%）。葡萄球菌屬在貯存前9 d的含量較為豐富（12.73%～10.74%），隨后立即讓位給其他細(xì)菌，在貯存第108～161天的相對(duì)豐度保持在0.42%～1.67%。隨著貯存時(shí)間的延長(zhǎng)，除了芽孢桿菌屬的相對(duì)豐度在10%左右波動(dòng)外，其余在貯存開(kāi)始時(shí)呈明顯優(yōu)勢(shì)的細(xì)菌都在衰減，而乳桿菌屬（Lactobacillus）、放線菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬（Enterococcus）等相對(duì)豐度增加，這種變化與Jin Yao等[20]的發(fā)現(xiàn)一致。由圖1b可知，曲皮和曲心在貯存過(guò)程中的真菌皆以嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）為主，其相對(duì)豐度在曲皮和曲心中的變化規(guī)律大體一致，均從一個(gè)極高的相對(duì)豐度（96.89%、93.29%）波動(dòng)下降。其次是曲霉屬（Aspergillus），在貯存第0天幾乎沒(méi)有，而后大量生長(zhǎng)，但不同的是從貯存第9天開(kāi)始，曲霉在曲心中總體呈波動(dòng)上升趨勢(shì)（22.17%～30.35%），而在曲皮中呈快速下降趨勢(shì)（60.82%～2.41%）。畢赤酵母屬（Pichia）在曲心中的相對(duì)豐度很低（0%～0.96%），但在曲皮中卻大量生長(zhǎng)，是曲皮在貯存第108天的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)真菌（68.89%）。

圖1 大曲貯存過(guò)程中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌（a）和真菌（b）在屬水平的相對(duì)豐度Fig.1 Relative abundance of dominant bacteria (a) and fungi (b) at genus level during Daqu storage

總體看來(lái)，大曲貯存過(guò)程使曲皮中的魏斯氏菌屬、乳桿菌屬、畢赤酵母屬和曲心中的高溫放線菌屬、魏斯氏菌屬、乳桿菌屬、鏈球菌屬、曲霉屬的相對(duì)豐度得到了極大提高，同時(shí)使曲皮和曲心中的芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、嗜熱子囊菌屬等的相對(duì)豐度下降。此外，曲皮中others的變化情況顯示了大曲中一些原本的極低豐度微生物可能由于適應(yīng)曲庫(kù)的環(huán)境條件以及微生物之間友好的相互關(guān)系而大量生長(zhǎng)，同時(shí)一些微生物因?yàn)檫m應(yīng)性差而走向衰竭[10,19]。這些結(jié)果都表明貯存使大曲微生物間相互作用重新平衡[6]，改變了微生物群落組成。

2.1.2 濃香型大曲貯存過(guò)程中菌群結(jié)構(gòu)特征的變化

不同貯存時(shí)間的大曲微生物α多樣性指數(shù)如圖2所示。Chao1指數(shù)反映物種的豐富度，大曲貯存前43 d的微生物豐富度相差不大，隨著貯存時(shí)間的延長(zhǎng)，曲心中細(xì)菌的Chao1指數(shù)在貯存第108天增長(zhǎng)至最大，而真菌的Chao1指數(shù)在第43天達(dá)到最高值后減小。總體看來(lái)，貯存過(guò)程使大曲微生物的豐富度略有降低。Pielou’s evenness指數(shù)表征均勻度，在大曲貯存期間，微生物群落的均勻度呈現(xiàn)先增加再減少的趨勢(shì)。貯存第161天的細(xì)菌群落均表現(xiàn)出稍稍低于貯存第0天的均勻度，而真菌群落的均勻度總體增加，表明貯存過(guò)程塑造了更為均勻的真菌群落[21]。Shannon指數(shù)反映物種多樣性，大曲的物種多樣性與均勻度的變化趨勢(shì)較為相似，總體上貯存過(guò)程增加了大曲的微生物多樣性。

圖2 大曲貯存過(guò)程中微生物的α多樣性指數(shù)Fig.2 Microbial α-diversity indexes during Daqu storage

為探究大曲貯存過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化，對(duì)大曲樣品進(jìn)行PCoA。由圖3a可知，PC1和PC2對(duì)細(xì)菌群落組成差異的解釋度分別為29.63%和22.15%，共計(jì)51.78%。貯存前43 d的曲心細(xì)菌結(jié)構(gòu)相近，但曲皮細(xì)菌樣本相互分離較遠(yuǎn)，說(shuō)明貯存前43 d內(nèi)曲皮細(xì)菌結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化。貯存第108、161天曲心和曲皮的細(xì)菌樣本各自聚在一起，表明大曲貯存3 個(gè)月后，細(xì)菌結(jié)構(gòu)已經(jīng)趨于穩(wěn)定，這與以往的研究一致[4,19]。如圖3b所示，PC1和PC2對(duì)真菌群落組成差異的解釋度分別為53.02%和41.79%，總解釋度高達(dá)94.81%。曲心的真菌結(jié)構(gòu)總體距離相近，說(shuō)明曲心真菌結(jié)構(gòu)在貯存過(guò)程中變化不大，并且與貯存第0、43、161天的曲皮真菌結(jié)構(gòu)相似性較高，但分別與曲皮在第9、108天的真菌結(jié)構(gòu)相差甚遠(yuǎn)。為進(jìn)一步了解大曲貯存期間微生物群落結(jié)構(gòu)，Venn圖展示了不同貯存時(shí)期間的共有微生物及特有微生物數(shù)量。如圖4所示，在屬水平上，曲皮、曲心在5 個(gè)貯存時(shí)期分別有13、14 個(gè)共有物種，其中絕大部分如曲霉屬、芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、畢赤酵母屬、魏斯氏菌屬等都屬于圖1中的優(yōu)勢(shì)菌屬，但它們?cè)谫A存不同時(shí)期的相對(duì)豐度各不相同。曲皮和曲心在每個(gè)貯存時(shí)期的特有物種數(shù)量總和分別占53%和50%，表明大曲貯存過(guò)程中的微生物差異由一半的共有物種的豐度差異和一半的特有物種的物種差異組成[4]。這些結(jié)果同樣表明一些原本的極低豐度微生物可能會(huì)隨著貯存的進(jìn)行大量生長(zhǎng)，同時(shí)一些微生物豐度降至極低，也有研究顯示部分特有低豐度微生物來(lái)自貯存環(huán)境[4]。

圖3 大曲貯存過(guò)程中細(xì)菌（a）和真菌（b）樣本的PCoAFig.3 PCoA plots of bacterial (a) and fungal (b) samples during storage of Daqu

圖4 大曲貯存過(guò)程中曲皮（a）和曲心（b）的物種個(gè)數(shù)Venn圖Fig.4 Venn diagram for the number of microbial species on (a) and in (b)Daqu during storage

2.2 濃香型大曲貯存過(guò)程中糖化力和液化力的變化

糖化酶是微生物代謝產(chǎn)生的重要酶類，能將釀酒原料中的淀粉、纖維素等多糖降解為還原糖，再由酵母等微生物進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為乙醇[10,22]，因此糖化力是大曲重要的生化指標(biāo)。由圖5a可知，曲皮糖化力在貯存前108 d先上升后下降（272、398、107 mg/（g·h）），在貯存第108～161天內(nèi)大幅回升（107～256 mg/（g·h））。而曲心糖化力在48～187 mg/（g·h）之間呈現(xiàn)比較規(guī)律的波動(dòng)。液化酶能斷裂淀粉分子的α-1,4-糖苷鍵生成糊精等中間產(chǎn)物[23]。圖5b所示的曲皮液化力在貯存第0～43天內(nèi)略有降低（0.37～0.12 g/（g·h）），從貯存第43天開(kāi)始持續(xù)增加至貯存結(jié)束（0.12～0.30 g/（g·h））。曲心液化力在貯存前43 d內(nèi)維持在0.08 g/（g·h），之后快速上升并穩(wěn)定在0.27～0.21 g/（g·h）?？傮w看來(lái)，與以往的研究一致[10,23]，糖化力和液化力在貯存約43 d內(nèi)呈下降趨勢(shì)，隨后整體回升。曲皮的糖化力和液化力均在貯存后略微降低，而曲心中的二者在貯存后升高。有研究表明，大曲在貯存初期具有較高的液化和糖化活性，且二者往往呈正相關(guān)，后來(lái)酶活性降低，轉(zhuǎn)變?yōu)檩^高的酯化活性[2]，這與貯存后期酯類物質(zhì)含量快速增加有關(guān)。

圖5 大曲貯存過(guò)程中糖化力（a）和液化力（b）的變化Fig.5 Changes in saccharification power (a) and liquefaction power (b) of Daqu during storage

2.3 濃香型大曲貯存過(guò)程中揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的變化

大曲中的風(fēng)味物質(zhì)可以作為酒體中香氣物質(zhì)的直接來(lái)源，也可作為酒中香氣物質(zhì)的重要前驅(qū)物來(lái)源[20]。采用HS-SPME-GC-MS分別在貯存過(guò)程的曲心和曲皮位置檢測(cè)到67、70 種揮發(fā)性化合物，可分為醇類、酯類、酚類、酸類、醛酮類、烷烯類、吡嗪類和其他物質(zhì)。由圖6可知，曲皮中風(fēng)味物質(zhì)的總含量隨著貯存時(shí)間呈現(xiàn)先下降后上升再下降的變化趨勢(shì)，其中在貯存約3 個(gè)月時(shí)總含量達(dá)到最高，這在其他報(bào)道中也有同樣的發(fā)現(xiàn)[10]，相比之下，曲心中的風(fēng)味物質(zhì)含量總體較為穩(wěn)定，僅在貯存結(jié)束時(shí)發(fā)生了較大的下降。酯類物質(zhì)是中國(guó)白酒中令人愉悅的水果、花香、蜂蜜香氣的主要貢獻(xiàn)者[6]，是貯存期間占比最大的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，令人注意的是其在曲皮貯存第108天時(shí)發(fā)生了激增，與前述微生物群落演替結(jié)果相結(jié)合，推測(cè)這種變化可能與魏斯氏菌和畢赤酵母的劇烈增加有關(guān)。據(jù)報(bào)道，魏斯氏菌發(fā)酵產(chǎn)生乳酸，為乳酸乙酯的合成提供前體物質(zhì)，畢赤酵母能利用蔗糖和葡萄糖制造乙酸乙酯等芳香化合物，二者均在酯化過(guò)程中發(fā)揮重要作用[24]。醇作為酸和酯的重要前體物質(zhì)，其含量?jī)H次于酯類，在貯存期間變化幅度不大。酸類、烷烯類、醛酮類物質(zhì)的變化比較一致，表現(xiàn)為貯存初期有較高的含量，之后迅速下降，并在之后的貯存期間保持非常低的含量?？傮w上，貯存過(guò)程使風(fēng)味物質(zhì)總含量減少，這與Zhang Yuandi等[11]的研究結(jié)果一致。其中醇類物質(zhì)、酯類物質(zhì)略微降低，酸類物質(zhì)、烷烯類物質(zhì)、醛酮類物質(zhì)大量減少。結(jié)果表明隨著貯存時(shí)間的推移，一些重要的風(fēng)味化合物被豐富，一些異雜味被減少或去除[23]，同時(shí)伴隨著部分風(fēng)味物質(zhì)的揮發(fā)[6,11]，說(shuō)明貯存過(guò)程有助于“凈化”風(fēng)味[25]、形成獨(dú)特濃郁的“大曲味”[2]。

圖6 大曲貯存過(guò)程中各類揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的變化Fig.6 Changes of volatile metabolites in Daqu during storage

2.4 濃香型大曲貯存過(guò)程中微生物群落的演替機(jī)制

為探究大曲貯存過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化原因，采用系統(tǒng)發(fā)育零模型計(jì)算大曲微生物群落的βNTI來(lái)判斷群落的構(gòu)建過(guò)程[14]。如圖7a所示，曲皮細(xì)菌群落的βNTI值在－1.12～5.05之間變化，曲心細(xì)菌在－1.28～5.55之間變化，二者的|βNTI|＞2的占比均為40%，說(shuō)明細(xì)菌群落的組裝過(guò)程主要受60%的隨機(jī)性過(guò)程影響，同時(shí)受40%的確定性過(guò)程影響。曲皮真菌群落的βNTI值在－0.64～3.61之間波動(dòng)，其|βNTI|＞2的比例為20%，說(shuō)明曲皮真菌群落受隨機(jī)性過(guò)程主導(dǎo)（80%）。而曲心真菌僅在－1.52～1.76之間波動(dòng)，說(shuō)明其完全受隨機(jī)性過(guò)程影響（100%）?？傮w上，大曲貯存期間微生物群落的組裝主要由隨機(jī)性過(guò)程主導(dǎo)。相較于真菌來(lái)說(shuō)，細(xì)菌受確定性過(guò)程的影響更大；相較于曲心微生物來(lái)說(shuō)，曲皮微生物受確定性過(guò)程的影響更大。

圖7 大曲貯存過(guò)程中微生物群落的構(gòu)建過(guò)程（a）和各個(gè)生態(tài)過(guò)程對(duì)群落構(gòu)建的貢獻(xiàn)程度（b）Fig.7 Development of microbial community during Daqu storage (a),and contribution of each ecological process to microbial community development (b)

為了進(jìn)一步量化隨機(jī)性和確定性過(guò)程在貯存期大曲微生物群落構(gòu)建中的貢獻(xiàn)程度，圖7b顯示了群落的修正RCbray[14]。結(jié)果表明無(wú)論是曲皮還是曲心，對(duì)細(xì)菌群落構(gòu)建的影響因素包括40%的變量選擇（環(huán)境因子、微生物相互作用等）、40%的擴(kuò)散限制以及20%的未定義過(guò)程（生態(tài)漂變等）。而真菌群落則大部分受未定義過(guò)程的影響（曲皮70%、曲心90%），說(shuō)明主要由生態(tài)漂變等導(dǎo)致真菌結(jié)構(gòu)發(fā)生隨機(jī)變化。變量選擇對(duì)曲皮真菌群落構(gòu)建的貢獻(xiàn)為30%，但對(duì)曲心真菌的貢獻(xiàn)為0。勻質(zhì)擴(kuò)散只在曲心真菌群落構(gòu)建過(guò)程中發(fā)揮了一定作用（10%），這種生態(tài)過(guò)程會(huì)導(dǎo)致群落結(jié)構(gòu)的相似性[26]。而對(duì)于細(xì)菌群落來(lái)說(shuō)，相對(duì)穩(wěn)定的貯存環(huán)境可能導(dǎo)致擴(kuò)散限制較大地影響了細(xì)菌在曲庫(kù)中的擴(kuò)散。有研究表明，真菌群落在曲心中傾向于隨機(jī)分散，而細(xì)菌群落則偏好聚集狀態(tài)[20]。結(jié)果表明，變量選擇對(duì)微生物菌群（尤其是曲皮中）發(fā)揮較大的作用，說(shuō)明貯存條件的改變及微生物間的相互作用對(duì)群落演替十分重要[26]。而目前的生產(chǎn)中，貯存期間幾乎都未采取人工調(diào)控溫濕度等措施，使氣候條件成了重要因素[4]，可見(jiàn)在大曲貯存期實(shí)施工藝調(diào)控對(duì)穩(wěn)定大曲質(zhì)量具有重要意義。

大曲貯存過(guò)程中微生物的生態(tài)位寬度如圖8所示。曲心細(xì)菌和曲皮真菌在貯存第108天和曲皮細(xì)菌在貯存第43天時(shí)的生態(tài)位寬度發(fā)生激增，說(shuō)明這時(shí)候微生物對(duì)環(huán)境資源的利用程度大大增加，這一時(shí)期的變化與圖1中優(yōu)勢(shì)菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生劇烈演替相符合。對(duì)比貯存前后的生態(tài)位寬度，結(jié)果顯示除了曲皮細(xì)菌外，其余菌群的生態(tài)位寬度經(jīng)貯存后都增加，說(shuō)明貯存使大曲微生物對(duì)環(huán)境資源的利用增加，對(duì)微生物間相互作用的適應(yīng)狀況更好[27]。貯存過(guò)程中不同時(shí)期的大曲微生物占據(jù)著不同的生態(tài)位，顯示了對(duì)環(huán)境擾動(dòng)的不同響應(yīng)[28]，這種響應(yīng)是由其生理耐受性、擴(kuò)散能力、分類多樣性和功能多樣性等共同介導(dǎo)[29-30]，因此貯存期大曲微生物群落不同的組裝過(guò)程可能是受到微生物群對(duì)環(huán)境干擾的不同響應(yīng)和生態(tài)位寬度的差異所影響[14]。此結(jié)果與零模型的分析結(jié)果一致反映了貯存環(huán)境對(duì)大曲微生物生長(zhǎng)代謝的重要性。

圖8 大曲貯存過(guò)程中細(xì)菌（a）和真菌（b）的生態(tài)位寬度變化Fig.8 Variations in niche width of bacteria (a) and fungi (b) during Daqu storage

2.5 濃香型大曲貯存過(guò)程中重要酶活力與微生物群落演替的相關(guān)性

貯存期間大曲微生物群落不斷變化，并通過(guò)代謝活動(dòng)引起酶活力的變化[6]。通過(guò)RDA探究?jī)煞N重要酶活力與大曲微生物間的關(guān)聯(lián)，其中RDA1和RDA2（加權(quán)）標(biāo)準(zhǔn)正交物種得分大于0.09的菌屬見(jiàn)圖9[4]。如圖9a所示，曲皮中，糖化力與嗜熱子囊菌屬呈負(fù)相關(guān)，與畢赤酵母屬、魏斯氏菌屬、乳桿菌屬、芽孢桿菌屬和曲霉屬呈正相關(guān)。貯存第108天和第161天的曲皮樣本與液化力極為相關(guān)，其中屬畢赤酵母屬、魏斯氏菌屬、乳桿菌屬貢獻(xiàn)最大。由圖9b可知，曲心中的糖化力和液化力均與科薩克氏菌屬（Kosakonia）呈負(fù)相關(guān)，與嗜熱子囊菌屬、曲霉屬呈強(qiáng)正相關(guān)，相比之下，與嗜熱真菌屬（Thermomyces）、高溫放線菌屬的正相關(guān)性較弱。結(jié)果顯示，畢赤酵母屬、魏斯氏菌屬、乳桿菌屬、嗜熱子囊菌屬、曲霉屬等微生物通過(guò)代謝作用有助于提高糖化酶、液化酶活力。一些研究報(bào)道了嗜熱子囊菌屬、曲霉、根毛霉屬及芽孢桿菌屬等大曲核心微生物具有強(qiáng)大的水解能力，有助于淀粉的液化和糖化，為后續(xù)風(fēng)味化合物的形成打下基礎(chǔ)[31-32]。

圖9 大曲貯存過(guò)程中糖化力、液化力與曲皮（a）和曲心（b）微生物的RDAFig.9 RDA of saccharification power,liquefaction power and microorganisms on (a) and in (b) Daqu during storage

2.6 濃香型大曲貯存過(guò)程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)與微生物群落演替的相關(guān)性

為探究大曲貯存期間揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化機(jī)制，利用Spearman相關(guān)性分析評(píng)估揮發(fā)性化合物與微生物的關(guān)聯(lián)[6]。如圖10a所示，曲皮中一些酯類物質(zhì)如9-十六碳烯酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、十六酸乙酯、十八烯酸乙酯與根霉屬（Rhizopus）、威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）等呈顯著負(fù)相關(guān)。乙酸乙酯與黃桿菌屬（Flavobacterium）、假單胞菌屬呈顯著正相關(guān)，與放線菌屬、鏈格孢屬（Alternaria）、棒狀桿菌屬（Corynebacterium）、梭桿菌屬（Fusobacterium）等呈顯著負(fù)相關(guān)。并且苯乙醇也和這些菌屬呈顯著負(fù)相關(guān)，而與假單胞菌屬、克羅彭斯特菌屬呈顯著正相關(guān)。乙醇、正戊醇、2,3-丁二醇聚為一類，與醋桿菌屬（Acetobacter）、鏈霉菌屬（Streptomyces）呈極顯著正相關(guān)。有研究顯示，大曲中的苯乙醇、戊醇等高級(jí)醇可能是通過(guò)Ehrlich代謝途徑的氨基酸分解代謝形成，也可能是由一些微生物菌株的脂質(zhì)氧化形成[33-34]。在曲皮中僅檢測(cè)到2,5-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪兩種吡嗪物質(zhì)，均與假單胞菌屬、克羅彭斯特菌屬呈顯著正相關(guān)。如圖10b所示，在曲心中檢測(cè)到了更多吡嗪種類，其中2,5-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪與魏斯氏菌屬、乳桿菌屬、腸球菌屬呈顯著負(fù)相關(guān)，與芽孢桿菌屬、嗜熱子囊菌屬呈顯著正相關(guān)；而2,6-二甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪則與微小桿菌屬（Exiguobacterium）、短狀桿菌屬（Brachybacterium）、熱桿菌屬（Thermobacillus）呈極顯著正相關(guān)，這與以往的研究一致[20]，因此通過(guò)調(diào)節(jié)這些微生物的豐度和活性有助于白酒中作為健康因子的吡嗪含量的提升。據(jù)報(bào)道，芽孢桿菌通過(guò)分泌淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶等將淀粉和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為葡萄糖和氨基酸，從而產(chǎn)生揮發(fā)性化合物及其前體物質(zhì)，如吡嗪、芳香族化合物、酚類化合物和有機(jī)酸[15]，可見(jiàn)芽孢桿菌對(duì)大曲的風(fēng)味和質(zhì)量有著重要貢獻(xiàn)。曲心中辛酸乙酯、癸酸乙酯、十七酸乙酯等與根霉屬、克雷伯菌屬（Klebsiella）呈顯著正相關(guān)，與威克漢姆酵母屬呈顯著負(fù)相關(guān)。正己酸乙酯與魏斯氏菌屬、腸球菌屬、乳桿菌屬以及一些非優(yōu)勢(shì)菌如棲熱菌屬（Thermus）、克洛氏菌屬（Crossiella）等呈顯著正相關(guān)?？傊?，大曲貯存過(guò)程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)在很大程度上受到微生物結(jié)構(gòu)及其代謝活性復(fù)雜變化的影響，是風(fēng)味物質(zhì)揮發(fā)[11]和微生物轉(zhuǎn)化共同作用的結(jié)果[6]，此結(jié)果為后續(xù)考慮通過(guò)物種強(qiáng)化提高大曲風(fēng)味質(zhì)量提供一定的理論基礎(chǔ)。

圖10 大曲貯存過(guò)程中揮發(fā)性代謝產(chǎn)物與曲皮（a）、曲心（b）中微生物的相關(guān)性聚類熱圖Fig.10 Cluster heatmaps for the correlation between volatile metabolites and microorganisms on (a) and in (b) Daqu during storage

3 結(jié)論

本研究利用高通量測(cè)序探究濃香型大曲貯存過(guò)程中的微生物群落組成及結(jié)構(gòu)特征。結(jié)果顯示大曲的貯存過(guò)程是微生物進(jìn)一步相互作用并重新平衡群落結(jié)構(gòu)的過(guò)程，長(zhǎng)時(shí)間的貯存改變了功能微生物比例[2]，最終導(dǎo)致微生物多樣性增加、群落結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定、均勻。貯存結(jié)束后，成熟大曲的曲心微生物群落主要由芽孢桿菌屬、魏斯氏菌屬、高溫放線菌屬、克羅彭斯特菌屬、乳桿菌屬、嗜熱子囊菌屬、曲霉屬等組成；曲皮微生物主要包括魏斯氏菌屬、乳桿菌、高溫放線菌屬、嗜熱子囊菌屬、畢赤酵母屬等優(yōu)勢(shì)微生物。此外研究了糖化力、液化力以及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)貯存過(guò)程使曲皮中糖化力、液化力有所下降，但在曲心中有所增加，同時(shí)有助于風(fēng)味物質(zhì)的豐富和轉(zhuǎn)化，這些變化使曲香更加濃郁[10]。通過(guò)構(gòu)建零模型探索微生物群落的組裝機(jī)制，發(fā)現(xiàn)隨機(jī)性過(guò)程主導(dǎo)了群落結(jié)構(gòu)的變化，同時(shí)確定性過(guò)程也有重要影響，其中變量選擇發(fā)揮了較大的作用，生態(tài)位差異也有一定影響，這一結(jié)論還需更多的研究驗(yàn)證。多元統(tǒng)計(jì)分析顯示微生物區(qū)系與大曲糖化力、液化力及揮發(fā)性代謝產(chǎn)物之間有顯著相關(guān)性，說(shuō)明貯存有助于通過(guò)改變微生物群落生產(chǎn)出高質(zhì)量大曲。

總之，貯存過(guò)程對(duì)大曲微生物群落結(jié)構(gòu)的重新平衡、酶活力及揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的積累與轉(zhuǎn)化具有重要意義，這與Fan Guangsen等[6]的研究結(jié)果一致。引起這些變化的確定性過(guò)程是變量選擇，說(shuō)明大曲貯存期實(shí)施工藝調(diào)控對(duì)穩(wěn)定大曲質(zhì)量非常重要。此外，還應(yīng)對(duì)微生物的代謝通路進(jìn)行分析，進(jìn)一步完善貯存期間大曲品質(zhì)的變化機(jī)制。本研究對(duì)優(yōu)化大曲的貯存工藝、提高大曲品質(zhì)具有重要意義。