1 株新型降解玉米赤霉烯酮的沙福芽孢桿菌及其關(guān)鍵酶分析

趙程程，孫長(zhǎng)坡，孫 晶，王 峻，劉虎軍

（國(guó)家糧食和物資儲(chǔ)備局科學(xué)研究院，北京 100037）

玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）是由禾谷鐮刀菌、三線鐮刀菌、黃色鐮刀菌等多種鐮刀菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，是污染糧食谷物最廣泛的真菌毒素之一，谷實(shí)類原料在田間、收獲過(guò)程、收獲后儲(chǔ)藏期間以及飼料和食品成品儲(chǔ)存、使用等諸多環(huán)節(jié)中，都有可能受到ZEN的污染，ZEN在玉米、高粱、燕麥、小麥、谷子、豆類等農(nóng)作物及其制品中的污染均有報(bào)道[1-2]。ZEN及其代謝產(chǎn)物具有與17β-雌二醇相似的結(jié)構(gòu)，可競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合生殖器官中的雌激素受體，主要破壞動(dòng)物的生殖系統(tǒng)，同時(shí)破壞免疫系統(tǒng)，并具有一定的肝毒性、細(xì)胞毒性和潛在的致癌性，已被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)列為Ⅲ類致癌物[3-5]。我國(guó)制訂了ZEN國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn)，配合飼料、玉米中的ZEN含量不超過(guò)500 μg/kg[6]，谷物及其制品中ZEN含量應(yīng)低于60 μg/kg[7]。雷元培等[8]隨機(jī)抽取2019年和2020年國(guó)內(nèi)各省區(qū)域的玉米、玉米副產(chǎn)物、小麥及麩皮、雜粕和全價(jià)飼料等樣品，ZEN檢出率超過(guò)82%，尤其玉米副產(chǎn)物中ZEN檢出率為100%，超標(biāo)率大于17%。ZEN的毒性和污染普遍性給食品安全和人類健康帶來(lái)嚴(yán)重威脅，因此，脫除或降解ZEN以避免其通過(guò)飼料和食品原料進(jìn)入食物鏈非常有必要。

目前對(duì)ZEN的脫毒主要有物理、化學(xué)和生物方法。常規(guī)的物理和化學(xué)法存在降解效率低、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)流失和使用設(shè)備較為昂貴等問(wèn)題，利用微生物或酶對(duì)ZEN進(jìn)行降解的方法更為綠色、高效和安全[9-11]。微生物在生長(zhǎng)過(guò)程中能夠通過(guò)代謝或分泌的酶對(duì)ZEN進(jìn)行轉(zhuǎn)化，生成低毒或無(wú)毒的產(chǎn)物，因而ZEN降解菌株的篩選和降解酶的挖掘一直是生物方法消減ZEN的研究熱點(diǎn)。Kakeya等[12]篩選得到1 株粉紅螺旋聚孢霉（Clonostachys rosea）IFO 7063能夠?qū)EN轉(zhuǎn)化成無(wú)雌激素活性的降解產(chǎn)物，并確定降解過(guò)程的關(guān)鍵酶為內(nèi)酯水解酶ZHD101[13]。Kosawang等[14]研究也表明由于ZHD101對(duì)ZEN的脫毒，粉紅螺旋聚孢霉對(duì)禾谷鐮刀菌的生長(zhǎng)具有拮抗作用，可用于ZEN的生物防控。Altalhi等[15]篩選得到可降解ZEN的惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）ZEA-1，并從菌株質(zhì)粒中克隆得到降解酶的表達(dá)盒，在大腸桿菌中重組表達(dá)后可高效降解ZEN。Molnar等[16]從白蟻后腸中分離到1 株酵母菌Trichosporon mycotoxinivorans可以同時(shí)降解赭曲霉毒素A和ZEN，Vekiru等[17]進(jìn)一步解析該酵母菌對(duì)ZEN的降解產(chǎn)物為ZOM-1，ZOM-1并未表現(xiàn)出雌激素活性。Z?och等[18]發(fā)現(xiàn)副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）能夠?qū)EN轉(zhuǎn)化成毒性減弱的β-玉米赤霉烯醇。近年來(lái)芽孢桿菌對(duì)ZEN的降解能力被廣泛報(bào)道。Chen等[19]分離幾株能夠降解ZEN的芽孢桿菌，其中枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）B2可用于ZEN污染玉米的發(fā)酵，能夠提高其發(fā)酵特性。段錦等[20]從發(fā)霉飼料、動(dòng)物糞便等樣品分離鑒定出的降解ZEN枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌能夠緩解ZEN中毒引起的小鼠臟器損傷。Zhu Yan等[21]從玉米青貯飼料樣品中篩選ZEN降解菌株時(shí)，分離到的芽孢桿菌S62-W能夠快速脫除ZEN，并解析其機(jī)制是對(duì)ZEN進(jìn)行磷酸化修飾生成新型衍生物ZEN-14-磷酸鹽（ZEN-14-phosphate，ZEN-14P）；Yang Shibin等[22]也在篩選時(shí)發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）Y816能夠?qū)EN、α-玉米赤霉烯醇和β-玉米赤霉烯醇進(jìn)行轉(zhuǎn)化，生成其磷酸化產(chǎn)物，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析獲得ZEN轉(zhuǎn)化過(guò)程的關(guān)鍵作用酶是ZEN磷酸轉(zhuǎn)移酶（ZEN phosphotransferase，ZPH），并通過(guò)基因工程酵母?jìng)鞲衅鞅碚鞔萍に鼗钚缘姆椒ū砻鱖EN-14P的雌激素活性與ZEN相比有明顯下降。但是目前ZEN降解菌株和ZEN降解酶資源仍然較為匱乏。

本研究從安徽、山東的小麥樣品中篩選能夠快速降解ZEN的新型菌株，挖掘降解菌株中的關(guān)鍵酶基因，旨在為糧食谷物中真菌毒素的污染控制提供新的菌種和酶資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥樣品取樣自安徽、山東。

甲醇、乙腈（均為色譜級(jí)）美國(guó)Thermo Fisher公司；甲酸、甲酸銨（均為質(zhì)譜級(jí)）美國(guó)Sigma-Aldrich公司；ZEN為國(guó)家有證標(biāo)準(zhǔn)樣品（GSB 11-3429-2017），純度＞98%；PremixTaq（ExTaqVersion 2.0）、PrimeSTAR HS（Premix）、DNA Ligation Kit寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；胰蛋白胨和酵母提取物 英國(guó)Oxoid公司；馬鈴薯浸出粉 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；其他常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基（minimal salt medium，MSM）配方（1 L）：(NH4)2SO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，Na2HPO4·12H2O 6.15 g，KH2PO41.52 g，CaCl20.05 g，pH 7.0～7.2；LB培養(yǎng)基配方（1 L）：NaCl 10 g，胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，固體培養(yǎng)基添加1.5%～2.0%的瓊脂粉；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基配方（1 L）：馬鈴薯浸出粉10 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉15 g；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）配方（1 L）：NaCl 8 g，K C l0.2 g，Na2HPO4·12 H2O 3.63 g，KH2PO40.24 g，pH 7.4。

1.2 儀器與設(shè)備

e2695高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀（配備2475熒光檢測(cè)器、2489二極管陣列檢測(cè)器）美國(guó)Waters公司；UPLC1290-QTOF6545超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)高分辨質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry，UPLC-QTOF-MS/MS）聯(lián)用儀 美國(guó)Agilent公司；生物安全柜 美國(guó)ESCO公司；C1000聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、Gel Doc XR＋凝膠成像儀 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 ZEN降解菌的篩選和分離

取5 g小麥樣品置于50 mL離心管，加入5 mL生理鹽水，30 ℃、200 r/min搖床振蕩2 h后靜置10 min，取上層液體50 μL到450 μL MSM培養(yǎng)基中（其中ZEN初始質(zhì)量濃度為10 μg/mL），以不加菌液、含有相同質(zhì)量濃度ZEN的MSM培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)7 d，然后取50 μL到新的MSM培養(yǎng)基中（其中ZEN質(zhì)量濃度為10 μg/mL）富集3 次，培養(yǎng)7 d后HPLC檢測(cè)ZEN殘留量。驗(yàn)證具有降解效果的樣品稀釋后分別涂布于PDA和LB平板上，然后挑取純化后單菌落接種到500 μL含10 μg/mL ZEN的MSM培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)培養(yǎng)7 d后檢測(cè)ZEN殘留量。選取降解效果較好的菌株，接種至LB液體培養(yǎng)基，在30 ℃、200 r/min培養(yǎng)20 h，吸取一定量發(fā)酵液接種至含10 μg/mL ZEN的MSM培養(yǎng)基（起始OD600nm=1.0）中，定時(shí)取樣檢測(cè)ZEN殘留量。

樣品中ZEN含量采用HPLC測(cè)定，色譜柱為Waters XBridge?C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）。流動(dòng)相為乙腈∶水=1∶1，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣10 μL，熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)274 nm，發(fā)射波長(zhǎng)440 nm。ZEN降解率計(jì)算如式（1）所示：

1.3.2 菌株鑒定

形態(tài)鑒定：分離得到的菌株在LB平板劃線，30 ℃培養(yǎng)24 h觀察菌落形狀、大小、邊緣、表面、隆起形狀、透明度、菌落顏色等。對(duì)菌株進(jìn)行革蘭氏染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)特征。

16S rDNA序列比對(duì)與進(jìn)化分析：對(duì)篩選獲得的菌株，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒操作說(shuō)明提取基因組DNA作為模板，進(jìn)行16S rDNA序列擴(kuò)增，引物為27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-TACCTTGTTACGACTT-3’），PCR擴(kuò)增體系：27F 1 μL，1492R 1 μL，模板1 μL，ExTaq酶25 μL，ddH2O 22 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，循環(huán)30 次。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)并切膠回收純化后測(cè)序分析，將測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，并使用MEGA7.0構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。

促旋酶B亞單位（gyrase B，gyrB）基因序列比對(duì)與進(jìn)化分析：以提取的細(xì)菌基因組DNA為模板，進(jìn)行g(shù)yrB序列擴(kuò)增，引物為UP-1（5′-GAAGTCATCATGAC CGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3′）和UP-2r（5′-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCN GCRTCNGTCAT-3′）[23-25]，PCR擴(kuò)增體系：UP-11 μL，UP-2r 1 μL，模板1 μL，ExTaq酶25 μL，ddH2O 22 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，63 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，循環(huán)35 次。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)并切膠回收純化后測(cè)序分析，將測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，并使用MEGA7.0構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。

1.3.3 菌株吸附與降解ZEN活性

將菌株M7L4培養(yǎng)至穩(wěn)定期的LB液體培養(yǎng)物進(jìn)行等分，一部分作為發(fā)酵液，另一部分經(jīng)5 000 r/min離心5 min，收集的培養(yǎng)基上清液，經(jīng)0.22 μm無(wú)菌PES濾膜后，一部分作為發(fā)酵上清液暫存于4 ℃，一部分經(jīng)121 ℃、20 min的高壓蒸汽處理，作為滅活發(fā)酵上清液。收集的菌體分為3 部分，一部分用MSM洗滌菌體3 次后用等體積的MSM重懸，作為細(xì)胞重懸液；一部分用MSM洗滌3 次后用等體積的MSM重懸，經(jīng)121 ℃、20 min的高壓蒸汽處理，作為滅活細(xì)胞重懸液；另一部分用PBS洗滌后用等體積的PBS重懸，然后在冰浴中超聲破碎，12 000 r/min、4 ℃離心20 min，離心上清液經(jīng)0.22 μm無(wú)菌PES濾膜后，作為胞內(nèi)液。

取5 μL 1 mg/mL ZEN溶液作為底物，加入495 μL上述各反應(yīng)組分，置于搖床，37 ℃、200 r/min孵育24 h后取樣進(jìn)行HPLC檢測(cè)ZEN殘留量并計(jì)算降解率。

1.3.4 菌株M7L4對(duì)ZEN的降解產(chǎn)物解析

將菌株M7L4培養(yǎng)至穩(wěn)定期的發(fā)酵液收集菌體，用MSM洗滌菌體3 次后，用等體積MSM重懸菌體并接種到含有ZEN的MSM反應(yīng)體系中（M7L4菌體的起始濃度OD600nm=0.1，ZEN質(zhì)量濃度為10 μg/mL），定時(shí)取樣，UPLC-QTOF-MS/MS檢測(cè)菌株M7L4對(duì)ZEN的降解及產(chǎn)物生成情況，通過(guò)降解產(chǎn)物的質(zhì)荷比（m/z）和二級(jí)質(zhì)譜結(jié)果解析產(chǎn)物結(jié)構(gòu)。

UPLC-QTOF-MS/MS測(cè)定條件：色譜柱為Agilent Poroshell 120 EC-C18（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）；流動(dòng)相：A 相為水（含0.1%甲酸和5 mmol/L 甲酸銨），B相為甲醇（含0.1%甲酸）。梯度洗脫程序：0～1 min，90% A、10% B；1～1.5 min，90%～55% A、10%～45% B；1.5～8.5 min，55%～0% A、45%～100% B，保持1 min后回到初始流動(dòng)相保持0.5 min，準(zhǔn)備下一次進(jìn)樣。流速為0.3 mL/min，柱溫度為30 ℃，進(jìn)樣2 μL。采用電噴霧電離源，負(fù)離子模式掃描，掃描范圍為m/z100～1 700；二級(jí)質(zhì)譜中的誘導(dǎo)碰撞解離能量為20 eV。

1.3.5 菌株M7L4中降解酶的基因克隆與蛋白表達(dá)

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道ZPH 能夠?qū)EN 轉(zhuǎn)化成ZEN-磷酸鹽（ZEN-phosphate，ZEN-P）[22]，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)搜索到沙福芽孢桿菌中磷酸烯醇丙酮酸利用酶（Bacillus safensisphosphoenolpyruvate-utilizing enzyme，BsaPUE）基因與zph基因（GenBank Accession No.MZ 170042.1）具有一定相似度。設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物BsaPUE-F（5’-CGGGATCCATGTATTCAGTTTTATTTCAT GC-3’）和BsaPUE-R（5’-CCGCTCGAGKRCACGYG MATGCTGYTTTAAWATC-3’）從沙福芽孢桿菌M7L4中擴(kuò)增BsaPUE，PCR擴(kuò)增體系為：BsaPUE-F1 μL，BsaPUE-R1 μL，模板1 μL，PrimeSTAR HS（Premix）酶25 μL，ddH2O 22 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?8 ℃預(yù)變性5 min，98 ℃變性10 s，55 ℃退火5 s，72 ℃延伸2 min 40 s，循環(huán)30 次。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)并切膠回收純化后采用限制性內(nèi)切酶XhoI和BamH I分別對(duì)載體pET-28a（＋）和BsaPUE的PCR純化產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，純化回收的載體與BsaPUE基因經(jīng)Solution I連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞后提取pET-28a（＋）-BsaPUE質(zhì)粒，測(cè)序正確的pET-28a（＋）-BsaPUE質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，獲得BsaPUE表達(dá)菌株大腸桿菌BL21（DE3）（pET-28a（＋）-BsaPUE）。挑取平板上單克隆接種到5 mL LB液體培養(yǎng)基（含50 mg/L卡那霉素），37 ℃、220 r/min條件下過(guò)夜培養(yǎng)，次日以1%接種于50 mL LB液體培養(yǎng)基（含50 mg/L卡那霉素），37 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng)至OD600nm=0.6～0.8，加入終濃度為0.8 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，18 ℃、180 r/min條件下過(guò)夜培養(yǎng)后8 000 r/min離心收集菌體，超聲破碎后離心上清液為粗酶液，再經(jīng)Ni-NTA純化得到純化酶液。

1.3.6 重組酶BsaPUE對(duì)ZEN的轉(zhuǎn)化效果驗(yàn)證

重組酶BsaPUE對(duì)ZEN轉(zhuǎn)化體系體積為500 μL，取5 μL 1 mg/mL ZEN溶液作為底物，反應(yīng)組1加入10 μL純化的BsaPUE酶液，PBS補(bǔ)齊反應(yīng)體系；反應(yīng)組2加入10 μL純化的BsaPUE酶液、10 μL ATP（終濃度10 mmol/L）和50 μL Mg2＋（終濃度20 mmol/L），PBS補(bǔ)齊反應(yīng)體系；反應(yīng)組3加入495 μL菌株大腸桿菌BL21（DE3）（pET28a-BsaPUE）的細(xì)胞重懸液（菌體收集后用PBS洗滌3 次后用等體積的PBS重懸）；以不加酶/菌液、含有相同質(zhì)量濃度ZEN的PBS作為空白對(duì)照。反應(yīng)體系置于搖床，37 ℃、200 r/min反應(yīng)30 min后加入500 μL甲醇制備樣品，進(jìn)行檢測(cè)。

ZEN轉(zhuǎn)化產(chǎn)物采用HPLC測(cè)定，色譜柱為Waters XBridge?C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A相為水（含0.5%甲酸），B相為甲醇。梯度洗脫程序：0～10 min，50%～0% A、50%～100% B；10～11 min，0%～50% A、100%～50% B，保持5 min，準(zhǔn)備下一次進(jìn)樣。流速為1.0 mL/min，柱溫度為30 ℃，進(jìn)樣10 μL。ZEN轉(zhuǎn)化率計(jì)算如式（2）所示：

1.4 數(shù)據(jù)處理

相關(guān)數(shù)據(jù)使用Microsoft Excel 2013軟件處理，圖表使用GraphPad Prism 6軟件繪制，質(zhì)譜數(shù)據(jù)采用Mass Hunter軟件分析與處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZEN降解菌株的篩選

采集的100 份樣品進(jìn)行3 次富集后，具有ZEN降解能力的樣品有11 份（M1～M11），在LB平板和PDA平板上稀釋涂布，挑取平板上形態(tài)不同的菌落再次劃線純化，然后挑取純化后23 個(gè)單菌落分別接種到含有ZEN的MSM反應(yīng)體系（ZEN質(zhì)量濃度為10 μg/mL）中，培養(yǎng)7 d，其中6 個(gè)菌株M3P2、M5L2、M7L1、M7L4、M11L2、M11P2具有明顯ZEN降解效果，降解率分別為 96.14%、53.22%、75.16%、100%、63.34%和66.49%，對(duì)菌株M3P2和M7L4降解ZEN的效果進(jìn)行復(fù)證，如圖1所示，來(lái)源于安徽宿州的小麥樣品中分離到的菌株M7L4較其他菌株降解能力更高效，該菌株經(jīng)LB培養(yǎng)基培養(yǎng)的發(fā)酵液24 h內(nèi)對(duì)10 μg/mL ZEN的降解率高于95%，因此選擇此菌株作為后續(xù)研究對(duì)象。

圖1 M3P2和M7L4菌株對(duì)ZEN降解效果復(fù)證Fig.1 ZEN degradation capacity of strains M7L4 and M3P2

2.2 菌株M7L4的鑒定

菌株M7L4在LB培養(yǎng)基上可較好生長(zhǎng)（圖2A），菌落符合細(xì)菌特征。30 ℃培養(yǎng)24 h后如圖2B所示，菌落為白色不透明，邊緣較為規(guī)則，表面光滑且扁平。顯微鏡下形態(tài)如圖2C所示，菌體細(xì)胞呈短桿狀，革蘭氏染色為陽(yáng)性。

圖2 菌株M7L4的鑒定Fig.2 Identification of strain M7L4

采用細(xì)菌的16S rDNA通用引物27F/1492R擴(kuò)增菌株M7L4基因組上的保守序列，擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示與南海芽孢桿菌（B.australimaris）、沙福芽孢桿菌（B.safensis）和短小芽孢桿菌（B.pumilus）的16S rDNA序列相似度均高于99.8%。使用MEGA7.0構(gòu)建菌株的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，如圖2D所示，菌株M7L4與南海芽孢桿菌、沙福芽孢桿菌處于同一分支上。

由于16S rDNA的高度保守性，對(duì)相似率極高的近緣種無(wú)法做進(jìn)一步區(qū)分，因此擴(kuò)增gyrB基因進(jìn)一步鑒別M7L4菌株在芽孢桿菌近緣種所屬分支[26-27]，采用Yamamoto等[23]報(bào)道的通用引物UP-1/UP-2r擴(kuò)增菌株M7L4基因組上的gyrB基因，擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示與沙福芽孢桿菌的gyrB基因序列相似度最高。使用MEGA7.0構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)如圖2E所示，菌株M7L4與沙福芽孢桿菌處于同一分支上。

綜合菌株的形態(tài)特征、16S rDNA和gyrB序列一致性及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析，初步鑒定菌株M7L4為沙福芽孢桿菌。沙福芽孢桿菌在生物防控等方面的研究和應(yīng)用已經(jīng)有較多報(bào)道[28-30]，這是首次發(fā)現(xiàn)沙福芽孢桿菌對(duì)ZEN具有降解能力。

2.3 菌株M7L4吸附與降解ZEN活性

根據(jù)1.3.3節(jié)方法獲得菌株M7L4發(fā)酵液、發(fā)酵上清液、胞內(nèi)液、細(xì)胞重懸液、滅活細(xì)胞重懸液、滅活發(fā)酵上清液，分別測(cè)定各組分對(duì)ZEN的降解效率。如圖3所示，滅活細(xì)胞重懸液和滅活發(fā)酵上清液對(duì)ZEN降解率小于10%，表明該菌株對(duì)ZEN吸附作用較弱；發(fā)酵上清液對(duì)ZEN的降解率小于5%，表明M7L4的胞外分泌物質(zhì)不能夠降解ZEN；發(fā)酵液和細(xì)胞重懸液在24 h內(nèi)對(duì)ZEN的降解率可達(dá)100%，但胞內(nèi)液幾乎不降解ZEN，表明菌株M7L4對(duì)ZEN起降解作用的是活細(xì)胞，其對(duì)ZEN的降解可能需要細(xì)胞提供能量或者輔酶和輔因子。

圖3 菌株M7L4各組分對(duì)ZEN的降解效率Fig.3 Degradation efficiency of ZEN by intracellular and extracellular components of strain M7L4

2.4 菌株M7L4對(duì)ZEN的降解產(chǎn)物解析

監(jiān)測(cè)菌株M7L4對(duì)ZEN的降解過(guò)程并對(duì)降解產(chǎn)物進(jìn)行解析。如圖4所示，隨著底物ZEN（C18H22O5，m/z317.139 4[－H]）的減少，有極性更強(qiáng)的產(chǎn)物（Compound X）積累（圖4A），其m/z為397.109 5[－H]（圖4 B），與目前已知的ZEN 代謝產(chǎn)物中ZEN-P（C18H23O8P，m/z=397.105 8[－H]）相符。分析該產(chǎn)物的二級(jí)質(zhì)譜碎片，20 eV碰撞能量下該產(chǎn)物裂解后特征碎片離子的m/z為78.959 7（圖4C），與Zhu Yan[21]和Yang Shibin[22]等報(bào)道的ZEN-P特征譜圖一致，因此推斷沙福芽孢桿菌M7L4對(duì)ZEN的降解產(chǎn)物為ZEN-P，菌株M7L4對(duì)ZEN的“降解”作用是將其轉(zhuǎn)化為ZEN的磷酸化衍生物。

圖4 菌株M7L4對(duì)ZEN降解產(chǎn)物的質(zhì)譜分析Fig.4 Identification of the transformation products of ZEN by UPLC-QTOF-MS/MS

2.5 菌株M7L4中降解酶基因的克隆、表達(dá)與驗(yàn)證

根據(jù)NCBI中與zph基因相似度最高（53.20%）的沙福芽孢桿菌來(lái)源BsaPUE基因設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，從菌株M7L4中擴(kuò)增得到其BsaPUE，如圖5A所示，基因長(zhǎng)度約2.5 kb，測(cè)序結(jié)果顯示BsaPUE與zph的基因序列一致性為56.01%，BsaPUE蛋白與ZPH蛋白的氨基酸序列一致性為51.13%。

圖5 BsaPUE基因的擴(kuò)增與表達(dá)Fig.5 Amplification and expression of BsaPUE

根據(jù)1.3.5節(jié)方法對(duì)大腸桿菌重組菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)和蛋白純化（圖5B），并驗(yàn)證重組酶BsaPUE對(duì)ZEN的轉(zhuǎn)化效果（圖6）。由圖6A可以看到，反應(yīng)組1僅加入重組酶BsaPUE，幾乎不能轉(zhuǎn)化ZEN；Yang Shibin等[22]報(bào)道的ZPH磷酸轉(zhuǎn)移活性需要ATP和Mg2＋參與，因此反應(yīng)組2中加入重組酶BsaPUE和ATP及Mg2＋，結(jié)果表明在ATP及Mg2＋存在的情況下，30 min內(nèi)重組酶BsaPUE可將10 μg/mL ZEN全部轉(zhuǎn)化成ZEN-P（圖6B）；反應(yīng)組3加入重組菌株大腸桿菌BL21（DE3）（pET28a-BsaPUE）的細(xì)胞重懸液，細(xì)胞內(nèi)存在ATP及Mg2＋的情況下重組菌株也可將ZEN轉(zhuǎn)化成ZEN-P。重組酶BsaPUE對(duì)ZEN的轉(zhuǎn)化需要ATP與Mg2＋的參與，這與菌株M7L4對(duì)ZEN的降解可能需要細(xì)胞提供能量或者輔酶和輔因子的推測(cè)一致。已有報(bào)道表明ZEN-P與ZEN相比雌激素活性有明顯下降[22]，本研究驗(yàn)證了菌株M7L4來(lái)源的BsaPUE具有ZEN轉(zhuǎn)化能力并明確其反應(yīng)體系，這是首次發(fā)現(xiàn)沙福芽孢桿菌來(lái)源的ZPH能夠催化ZEN到ZEN-P的生物轉(zhuǎn)化。

圖6 重組酶BsaPUE對(duì)ZEN的轉(zhuǎn)化效果Fig.6 Transformation efficiency of ZEN to ZEN-P by BsaPUE

3 結(jié)論

本研究采用富集培養(yǎng)法，從不同來(lái)源的小麥樣品中分離獲得1 株快速降解ZEN的微生物菌株，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定為沙福芽孢桿菌，并命名為M7L4。質(zhì)譜分析表明，沙福芽孢桿菌M7L4的活細(xì)胞可將ZEN轉(zhuǎn)化為m/z397.1的ZEN新型磷酸化衍生物ZEN-P。以菌株M7L4的基因組為模板，從中擴(kuò)增出該沙福芽孢桿菌的BsaPUE基因，經(jīng)大腸桿菌表達(dá)的重組酶BsaPUE，在有ATP和Mg2＋存在的情況下可將ZEN轉(zhuǎn)化成ZEN-P。本研究報(bào)道沙福芽孢桿菌可降解ZEN、發(fā)現(xiàn)沙福芽孢桿菌來(lái)源的ZPH（BsaPUE）可催化ZEN生成ZEN-P，發(fā)掘的相關(guān)菌株和基因資源，可為糧食谷物中真菌毒素的污染控制提供一定的技術(shù)支撐。