傳統(tǒng)清香型白酒發(fā)酵過程中細(xì)菌群落演替及自組裝機(jī)理

喬美靈，任宇婷，張桂蓮，楊玉珍，劉夢宇，孫子羽，陳忠軍，滿都拉,*

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古馳原酒業(yè)有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 011500；3.內(nèi)蒙古河套酒業(yè)集團(tuán)股份有限公司，內(nèi)蒙古 巴彥淖爾 015400）

白酒是我國釀造歷史悠久的傳統(tǒng)酒類，開放的生產(chǎn)方式使其在發(fā)酵過程中涉及多種微生物共同參與。研究顯示，白酒中含有上千種風(fēng)味物質(zhì)[1]，這與其由多種微生物參與發(fā)酵密不可分[2]。近年來，基于純培養(yǎng)[3]、磷脂脂肪酸分析[4]、變性梯度凝膠電泳[5]和高通量測序[6-9]等技術(shù)對白酒釀造微生物物種組成、群落結(jié)構(gòu)及群落演替開展大量研究，為后續(xù)探究微生物與白酒釀造之間的關(guān)系提供理論參考。由于參與白酒釀造的微生物受地理、氣候及工藝影響較大，一些特定地區(qū)白酒發(fā)酵過程中微生物群落自組裝，及其朝著有序、有規(guī)律方向演替的推動因素還需進(jìn)一步了解。

鑒別微生物種類、準(zhǔn)確了解白酒發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)及其隨時(shí)間變化的規(guī)律是研究白酒發(fā)酵微生物的主要內(nèi)容。高分辨的菌種注釋為揭示白酒微生物群落結(jié)構(gòu)、演變及自組裝提供了基礎(chǔ)。與二代短片段測序相比，以PacBio SMRT為代表的三代測序技術(shù)具有長讀長、高通量的優(yōu)點(diǎn)，通過其特有的CCS（circular consensus sequencing）模式，可將同一條序列多次重復(fù)測序后的結(jié)果相互校正，從而獲得測序質(zhì)量非常高的一致性序列[10]。借助該技術(shù)，研究人員可以進(jìn)一步獲得種水平的物種組成，得到更好的物種注釋分辨率，進(jìn)一步深入解析群體樣本的物種組成情況[11]。

環(huán)境因素的變化可以驅(qū)動微生物群落組成變化[12]。以往有關(guān)白酒釀造微生物自組裝機(jī)制的研究通?；凇罢麄€(gè)群落”進(jìn)行評估[13]。而有學(xué)者認(rèn)為微生物群落自組裝過程的真實(shí)情況更可能是在基因型和種群水平上發(fā)生，而不是整個(gè)群落，Ning Daliang等[14]提出基于系統(tǒng)發(fā)育的零模型分析方法——iCAMP，這為量化生態(tài)過程在控制微生物群落多樣性和演替中的相對重要性提供了可靠的工具。研究揭示白酒發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)組成、演變及自組裝規(guī)律是深入了解控制群落結(jié)構(gòu)潛在因素以及白酒風(fēng)味物質(zhì)形成機(jī)理的關(guān)鍵，也是優(yōu)化多種微生物混合發(fā)酵過程，提高產(chǎn)品品質(zhì)的重要理論基礎(chǔ)。因此，本研究以中國傳統(tǒng)清香型白酒為研究對象，利用PacBio SMRT測序技術(shù)結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)方法深入解析清香型白酒發(fā)酵過程中細(xì)菌物種組成及群落結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步利用iCAMP模型開展清香型白酒發(fā)酵過程中群落自組裝機(jī)理的研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酒醅樣品采集自內(nèi)蒙古一清香型白酒廠（地缸發(fā)酵），采集時(shí)間為2020年11、12月。分別采集發(fā)酵第0、3、5、7、10、12、15、18、21、24、28天的酒醅，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集3 個(gè)地缸。分別采集地缸的上、中以及底層酒醅（共500 g），混合為一個(gè)樣品后立即用無菌密封袋包裝保存于－80 ℃冰箱。

1.2 儀器與設(shè)備

YXQ-LS-100SII立式壓力蒸汽滅菌 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DHG-9053A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SIGMA3-18KS高速冷凍離心機(jī) 德國Sigma公司；Veriti梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；SE602F電子天平 奧豪斯儀器（上海）有限公司；DYY-6D電泳儀 北京六一生物科技有限公司；XW-80A旋渦儀 上海馳唐電子有限公司。

1.3 方法

1.3.1 理化指標(biāo)測定

溫度測定：采用測溫計(jì)直接測量取樣點(diǎn)附近的溫度，30 s不變溫，記錄數(shù)值；水分含量、pH值和酸度的測定參考賈麗艷等[15]的方法；淀粉含量的測定參考李大和等[16]的方法；蛋白質(zhì)含量測定參考GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》，采用凱氏定氮法；游離氨基酸態(tài)氮含量測定參考GB 5009.239—2016《食品酸度的測定》，采用比色法；乙醇含量的測定參考劉曉等[17]的方法。

1.3.2 酒醅微生物基因組的提取及測序

酒醅微生物基因組采用試劑盒直接提取。稱取0.5 g酒醅樣品，按照TIANamp Soil DNA Kit說明書進(jìn)行。利用含有Barcode 引物27 F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA V1～V7區(qū)域[18]。產(chǎn)物經(jīng)純化、定量和均一化形成測序文庫（SMRT Bell），質(zhì)檢合格的文庫用PacBio Sequel進(jìn)行測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

1.4.1 下機(jī)數(shù)據(jù)處理

利用Smrtlink version8.0軟件從下機(jī)數(shù)據(jù)中導(dǎo)出CCS文件，根據(jù)Barcode序列識別不同樣品的數(shù)據(jù)并轉(zhuǎn)化為fastq格式數(shù)據(jù)。利用UCLUST軟件劃分序列（相似度100%）為無重復(fù)的單一16S rRNA基因全長序列集。使用USEARCH（version10.0）以相似性97%對序列進(jìn)行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）劃分，用Chimera Slayer去掉含嵌合體的OTU序列，并抽取代表性序列與SILVA（Release132，http://www.arb-silva.de）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對注釋，確定各OTU的分類學(xué)信息，進(jìn)而計(jì)算各樣品在屬和種水平的相對含量。使用eggNOG數(shù)據(jù)庫（http://eggnog.Embl.de/）對細(xì)菌群進(jìn)行功能預(yù)測。

1.4.2 生物信息學(xué)分析

通過Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)[19]、Chao1指數(shù)、覆蓋率以及Shannon-Wiener曲線[20]評估各樣本α多樣性和測序質(zhì)量?；贠TU水平采用加權(quán)UniFrac算法和Bray-Curtis算法計(jì)算樣本間距離矩陣，通過構(gòu)建UPGMA聚類樹[21]和主坐標(biāo)分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）研究不同發(fā)酵時(shí)間樣本間差異。進(jìn)一步通過LEfSe分析評估各發(fā)酵階段的差異物種[22]。通過計(jì)算Spearman相關(guān)系數(shù)（r），選擇|r|＞0.60、P＜0.05作為網(wǎng)絡(luò)強(qiáng)相關(guān)節(jié)點(diǎn)的條件，構(gòu)建相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖并繪制功能及理化因子與物種間的相關(guān)性熱圖。基于典范對應(yīng)分析（canonical correspondence analysis，CCA）將微生物群落與理化因子進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。微生物群落變化使用β多樣性分解進(jìn)行評估[23]。計(jì)算歸一化隨機(jī)比（normalized stochasticity ratio，NST）和iCAMP分析細(xì)菌群落自組裝機(jī)制[24]。使用R語言（v4.1.2）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和繪圖，采用方差分析進(jìn)行組間差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程中細(xì)菌群落α多樣性

經(jīng)測序共獲得413 198 條細(xì)菌CCS序列（均長度為1 500 bp），以97%相似性劃分共得到1 761 個(gè)OTU。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)表征樣品中群落的多樣性信息，Shannon指數(shù)越大、Simpson指數(shù)越小，表示群落多樣性越高[25]。如圖1A、B所示，細(xì)菌群落的Shannon指數(shù)0 d最高隨后逐漸降低，Simpson指數(shù)0 d最低隨后逐漸升高，說明隨發(fā)酵進(jìn)行細(xì)菌群落多樣性逐漸降低，發(fā)酵起始（0 d）時(shí)上述兩個(gè)指數(shù)均與發(fā)酵結(jié)束（28 d）時(shí)存在顯著差異（P＜0.05）?？傮w來看，發(fā)酵12 d后是發(fā)酵過程中細(xì)菌多樣性變化的關(guān)鍵時(shí)間段。Chao1指數(shù)表征樣品中群落的豐度信息，其值越大代表物種總數(shù)越多。本研究中，隨發(fā)酵的進(jìn)行，細(xì)菌菌群的Chao1指數(shù)總體呈下降趨勢，這表明隨著發(fā)酵進(jìn)行物種數(shù)逐漸降低，除0 d與10 d的Chao1指數(shù)差異顯著（P＜0.05）外，其余無顯著差異（圖1C）。如圖1D所示，覆蓋率均大于0.99，說明樣本文庫的覆蓋率較高。Shannon-Wiener曲線隨著測序量的擴(kuò)大，最終均達(dá)到飽和狀態(tài)（圖1E），測序深度滿足要求。從α多樣性（Simpson、Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)）變化可以看出，由于入缸時(shí)帶入不同來源的微生物[26]，細(xì)菌群落的微生物多樣性在0 d達(dá)到最大，之后由于發(fā)酵過程的進(jìn)行，微生物需要適應(yīng)環(huán)境的變化以及菌群之間的相互作用導(dǎo)致細(xì)菌多樣性發(fā)生動態(tài)變化。

圖1 發(fā)酵過程中細(xì)菌菌群Shannon指數(shù)（A）、Simpson指數(shù)（B）、Chao1指數(shù)（C）、覆蓋率（D）和Shannon-Wiener曲線（E）Fig.1 Shannon index (A),Simpson index (B),Chao1 index (C),coverages (D) and Shannon-Wiener curve (E) of bacterial flora during fermentation process

2.2 發(fā)酵過程中細(xì)菌群落組成分析

如圖2A所示，利用所測得的OTU經(jīng)物種注釋共得到87 個(gè)菌屬，其中乳桿菌屬（Lactobacillus）、醋酸菌屬（Acetobacter）、片球菌屬（Pediococcus）和魏斯氏菌屬（Weissella）為優(yōu)勢屬（相對豐度大于1%）。發(fā)酵0～3 d，Acetobacter的相對豐度從35%下降至0.9%，Weissella從15%下降至0.5%，Pediococcus從10%下降至8%，而Lactobacillus的相對豐度從10%迅速上升至90%。發(fā)酵3～10 d，Acetobacter和Weissella的相對豐度一直維持在較低水平（相對豐度小于0.1%），Pediococcus的相對豐度從8%下降至1%。發(fā)酵10 d后，Lactobacillus成為絕對優(yōu)勢屬（相對豐度大于98%）。發(fā)酵12 d時(shí)，Acetobacter和其他屬的相對豐度呈現(xiàn)小幅度增加。明串珠菌屬（Leuconostoc）、葡糖桿菌屬（Gluconobacter）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、駒形桿菌屬（Komagataelibacter）和擬桿菌屬（Bacteroides）在發(fā)酵0 d時(shí)相對豐度均較?。ㄐ∮?.5%）。

圖2 發(fā)酵過程中細(xì)菌群落屬水平（A）和種水平（B）組成Fig.2 Composition of bacterial communities at the genus level (A) and species level (B) during the fermentation process

在種水平上共得到124 個(gè)菌種，其中橋乳桿菌（L.pontis）、類消化乳桿菌（L.paralimentarius）、短乳桿菌（L.brevis）、耐酸乳桿菌（L.acetotolerans）、啤酒乳桿菌（L.cerevisiae）、蘋果醋桿菌（A.malorum）、戊糖片球菌（P.pentosaceus）、植物乳桿菌（L.plantarum）、希氏乳桿菌（L.hilgardii）和食竇魏斯氏菌（W.cibaria）為優(yōu)勢菌種（相對豐度大于1%）。在發(fā)酵0～3 d時(shí)，L.pontis、L.paralimentarius、L.brevis、L.cerevisiae和L.plantarum的相對豐度逐漸升高，而A.malorum、P.pentosaceus和W.cibaria的相對豐度逐漸下降至1%。發(fā)酵3～10 d時(shí)，L.cerevisiae和P.pentosaceus的相對豐度逐漸下降至1%，而L.pontis的相對豐度逐漸升高。發(fā)酵12～28 d時(shí)，L.acetotolerans相對豐度從1%上升至40%。發(fā)酵28 d時(shí)，L.acetotolerans和L.pontis成為優(yōu)勢菌。其余細(xì)菌在發(fā)酵0 d相對豐度較高，但隨著發(fā)酵過程的進(jìn)行，相對豐度逐漸降低并維持在較低水平（相對豐度小于1%）（圖2B）。

2.3 發(fā)酵過程中細(xì)菌群落β多樣性

如圖3A所示，發(fā)酵0 d樣品與其他時(shí)間樣品存在顯著差異，成為單獨(dú)一個(gè)分支。其他時(shí)間樣品又分為3～10 d和12～28 d兩個(gè)分支，說明整個(gè)發(fā)酵可分為3 個(gè)階段：0（I）、3～10 d（II）和12～28 d（III）。PCoA結(jié)果（圖3B）顯示，PCo1的貢獻(xiàn)率為55.3%，權(quán)重最大，說明細(xì)菌群落隨發(fā)酵過程的推進(jìn)主要沿PCo1軸方向發(fā)生變化，并且沿PCo1軸正方向相鄰時(shí)間點(diǎn)樣本的間距越來越小，說明群落結(jié)構(gòu)逐漸趨于一致，這與聚類分析結(jié)果一致。綜上，發(fā)酵第0、3、12天可能是反映整個(gè)發(fā)酵過程微生物群落動態(tài)變化的主要時(shí)間節(jié)點(diǎn)。進(jìn)一步利用方差分析（圖3C）研究3 個(gè)發(fā)酵階段的差異性發(fā)現(xiàn)，3 組組間差異大于組內(nèi)差異，且差異顯著（P＜0.001），表明將發(fā)酵過程分為3 個(gè)發(fā)酵階段是合理的。

圖3 發(fā)酵過程中細(xì)菌群落的β多樣性Fig.3 β-Diversity of bacterial flora during fermentation

為進(jìn)一步明確不同發(fā)酵階段中具有顯著差異物種信息，通過LEfSe分析研究各階段差異菌種。如圖3D所示，各發(fā)酵階段細(xì)菌群落的差異物種主要來自8 個(gè)屬，大部分為優(yōu)勢屬，但階段II中沒有差異菌屬。其中階段I有11 個(gè)顯著性差異物種，分別為A.malorum、W.cibaria、P.pentosaceus、巴氏醋桿菌（A.pasteurianus）、腸膜明串珠菌（L.mesenteroides）、氧化葡萄糖桿菌（G.oxydans）、白面粉乳桿菌（L.siliginis）、清酒乳酸桿菌（L.sakei）、中間駒形氏桿菌（K.intermedius）、地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）和羅氏菌屬中未分類的種（uncultured_g_Roseburia）。階段II有4 個(gè)顯著性差異菌種，為L.paralimentarius、L.brevis、L.cerevisiae和L.plantarum。階段III有3 個(gè)顯著性差異菌種，分別為L.pontis、L.acetotolerans和L.hilgardii。階段I、II和III中A.malorum、L.paralimentarius和L.pontis的線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）評分最高，分別為其主要的差異菌種（圖3E）。

2.4 差異菌種間相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析

通過計(jì)算Spearman相關(guān)系數(shù)研究發(fā)酵過程中差異細(xì)菌間的共存關(guān)系。選擇|r|＞0.60、P＜0.05作為網(wǎng)絡(luò)強(qiáng)相關(guān)節(jié)點(diǎn)的條件篩選出10 個(gè)菌種，進(jìn)行繪圖，如圖4所示。細(xì)菌群落中L.acetotolerans與各發(fā)酵階段的差異細(xì)菌具有顯著相關(guān)性（P＜0.05）。階段I的差異菌種之間均呈正相關(guān)，其中A.malorum、W.cibaria、A.pasteurianus、K.intermedius、P.pentosaceus、G.oxydans和L.sakei，這些菌種具有較高的有機(jī)酸和乙酸生產(chǎn)能力，可以導(dǎo)致酒醅酸化，維持發(fā)酵的正常進(jìn)行，也為乳酸乙酯的合成提供了前體物質(zhì)；L.siliginis多分離于酸面團(tuán)中；而L.mesenteroides和B.licheniformis可以釋放各種酶水解酒醅中的蛋白質(zhì)和淀粉，為發(fā)酵過程中微生物提供物質(zhì)及能量[27]。階段II的差異菌種之間呈正相關(guān)，其中L.paralimentarius利用葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸，L.plantarum可產(chǎn)丁酸[28]，L.brevis具有較高的γ-氨基丁酸生產(chǎn)能力[29]，而L.cerevisiae在白酒中的研究較少，其在白酒釀造過程中的具體作用還需進(jìn)一步研究。階段III的3 個(gè)差異菌種之間也呈正相關(guān)，L.pontis為異型發(fā)酵乳酸菌，可改善面包的風(fēng)味和味道[30-31]，L.acetotolerans可以促進(jìn)具有水果味、花香和甜香酯類物質(zhì)風(fēng)味的產(chǎn)生[32]，L.hilgardii參與葡聚糖的產(chǎn)生[33]，促使某些細(xì)菌的生長。發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)的差異影響微生物之間的相互作用。不同發(fā)酵階段的差異菌種之間呈負(fù)相關(guān)，同一發(fā)酵階段的差異菌種之間呈正相關(guān)，這是可能由于各階段的“分工”不同導(dǎo)致微生物之間存在競爭和共生等關(guān)系[34]。

2.5 發(fā)酵過程中環(huán)境因子變化及其與細(xì)菌群落間的關(guān)系

如圖5所示，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，理化因子呈明顯動態(tài)變化。水分含量、酸度和蛋白含量呈現(xiàn)上升趨勢，淀粉含量和pH值呈現(xiàn)下降趨勢。而溫度呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，氨基酸態(tài)氮和乙醇含量呈現(xiàn)先升高后降低再升高的變化規(guī)律。

圖5 發(fā)酵過程中理化指標(biāo)動態(tài)變化Fig.5 Dynamic changes in physicochemical indicators during fermentation

基于CCA將微生物群落與理化因子進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，排序軸CC1貢獻(xiàn)率為54.19%，排序軸CC2貢獻(xiàn)率為28.44%（圖6A）。pH值和淀粉含量主要影響階段I的細(xì)菌群落，其中淀粉含量的影響最大，在這一階段中淀粉分解成還原糖，充足的糖供應(yīng)有利于微生物的生長和代謝[35]。溫度和氨基酸態(tài)氮含量主要影響發(fā)酵階段II的細(xì)菌群落，其中溫度對細(xì)菌群落的影響最大，溫度的變化反應(yīng)酒醅發(fā)酵是否正常，這是微生物的生長代謝產(chǎn)生生物熱與酒醅發(fā)酵環(huán)境熱能傳遞平衡的結(jié)果[36]。酸度、水分和蛋白質(zhì)含量主要影響發(fā)酵階段III的細(xì)菌群落，其中水分含量影響較大，水分含量是釀酒過程中關(guān)鍵指標(biāo)之一，酒醅所含水分含量影響發(fā)酵空間的氣密性，水分含量偏高導(dǎo)致發(fā)酵的氣密性差，抑制好氧菌的生長，增加厭氧菌的生長，容易發(fā)生酸??；如果酒醅水分含量偏低，對出酒率和酒品質(zhì)都有影響[37]。差異菌種與環(huán)境因子相關(guān)性（圖6B）表明，階段I的差異菌種主要與pH值呈正相關(guān)，與酸度呈負(fù)相關(guān)，其中L.mesenteroides和P.pentosaceus呈高度正相關(guān)（P＜0.001）。階段II的差異菌種主要與溫度呈正相關(guān)，其中L.plantarum和L.cerevisiae與溫度高度相關(guān)（P＜0.001）。在階段III的差異菌種中L.acetotolerans與水分和酸度呈高度正相關(guān)（P＜0.001），與pH 值、溫度呈高度負(fù)相關(guān)（P＜0.001），這表明不同種類的細(xì)菌受不同環(huán)境影響較大，具體情況還需對菌株進(jìn)一步分離驗(yàn)證。

圖6 細(xì)菌群落與理化因子CCA（A）和差異菌種與理化指標(biāo)相關(guān)性熱圖（B）Fig.6 CCA of bacterial community and physicochemical factors (A) and heatmap of correlation between differential species and physicochemical indicators (B)

2.6 發(fā)酵過程中細(xì)菌群落自組裝機(jī)理

微生物群落變化通常歸于兩種現(xiàn)象：物種替換（不同樣本間物種交換和替代）和物種流失（物種的增加或減少）[38]。如圖7A、B所示，本研究的發(fā)酵過程中物種替換（圖7B）幾乎貢獻(xiàn)了大部分的細(xì)菌群落演替。隨著發(fā)酵過程的進(jìn)行，物種替換呈現(xiàn)先上升后下降再上升的變化趨勢，與物種流失（圖7A）呈現(xiàn)相反的變化。階段I細(xì)菌群落的替換最低，可能是由于環(huán)境細(xì)菌的進(jìn)入導(dǎo)致細(xì)菌多樣性增加，而階段II、III，由于在發(fā)酵過程中微生物的代謝活動導(dǎo)致釀造環(huán)境發(fā)生變化，從而使替換迅速升高?？傊?，替換是群落演替的主要機(jī)制，同時(shí)流失對于細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的演替也至關(guān)重要。不同發(fā)酵階段的替換發(fā)生率呈現(xiàn)上升趨勢，表明發(fā)酵階段中的細(xì)菌群落中的物種在不斷發(fā)生交換和替代，細(xì)菌群落因發(fā)酵過程的進(jìn)行而發(fā)生演替。

圖7 β多樣性分解（A、B）、NST評價(jià)（C）和自組裝動態(tài)變化Sankey圖（D）Fig.7 Decomposition of beta-diversity (A and B),NST evaluation (C) and Sankey diagram showing dynamic changes in self-assembly (D)

為探索確定性和隨機(jī)性對微生物群落組裝的相對重要性，基于零模型的NST進(jìn)行評價(jià)，如圖7C所示，隨機(jī)過程主導(dǎo)了整個(gè)發(fā)酵過程中細(xì)菌群落的組裝結(jié)果。發(fā)酵過程中細(xì)菌群落的絕大部分NST＞0.5，表明整個(gè)過程主要受到隨機(jī)性過程的影響。而在階段II和III，少數(shù)細(xì)菌群落也會受到確定性（NST＜0.5）的影響，表明隨著發(fā)酵過程的進(jìn)行，微生物對原料的分解和其自身代謝活動使細(xì)菌群落受到隨機(jī)性和確定性過程的影響。此外，iCAMP方法將確定性和隨機(jī)性過程分為5 個(gè)特定的生態(tài)過程（圖7D）。確定性過程包括均勻選擇（homogeneous selection，HoS）和異質(zhì)選擇（heterogeneous selection，HeS），而隨機(jī)過程包括擴(kuò)散限制、均勻擴(kuò)散和漂移（drift，DR）[14]。其中DR是發(fā)酵過程中細(xì)菌群落的主要過程，其次是HoS和HeS。然而，不同發(fā)酵階段呈現(xiàn)不同的過程，階段I小部分為HoS，可能因?yàn)榘l(fā)酵0 d引入大量的環(huán)境微生物導(dǎo)致酒醅中某些微生物發(fā)生變化。階段II大部分為HoS，這種均勻選擇是由于一定的環(huán)境選擇壓力導(dǎo)致，階段III大部分為DR，這很大可能是因?yàn)榘l(fā)酵環(huán)境的隨機(jī)性擾動。綜上，隨著發(fā)酵進(jìn)行，細(xì)菌群落自組裝主要受到隨機(jī)過程中DR的影響。

結(jié)合理化因子與細(xì)菌群落之間的相關(guān)性，因此推測淀粉含量是影響階段I的細(xì)菌群落演替的主要因素，溫度和水分含量分別是影響階段II和階段III的細(xì)菌群落演替的重要因素。

3 討論

微生物多樣性賦予傳統(tǒng)發(fā)酵食品多樣的菌群結(jié)構(gòu)，其中核心微生物既為風(fēng)味賦予特征性與多樣性，也為產(chǎn)品的質(zhì)量提供穩(wěn)定性[39]。精準(zhǔn)定位參與傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物物種、揭示發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)變化及群落自組裝機(jī)理對進(jìn)一步提升產(chǎn)品質(zhì)量及安全性意義重大。本實(shí)驗(yàn)利用PacBio SMRT測序技術(shù)開展傳統(tǒng)清香型白酒發(fā)酵過程中細(xì)菌群落的多樣性及結(jié)構(gòu)演替規(guī)律的研究。

在發(fā)酵過程中，細(xì)菌的多樣性和豐度表現(xiàn)出明顯的特征和動態(tài)變化。高豐度優(yōu)勢微生物通常被認(rèn)為是食品發(fā)酵的重要組成部分[40]。經(jīng)注釋分析，在本研究中有4 個(gè)廣泛分布的細(xì)菌屬（Lactobacillus、Acetobacter、Pediococcus和Weissella），這與其他研究報(bào)道結(jié)果[41]有所差異，這可能與地區(qū)原料環(huán)境不同有關(guān)。擴(kuò)增子全長測序能夠更精確地定位物種信息，也為進(jìn)一步分析其功能奠定基礎(chǔ)。本研究中優(yōu)勢物種主要有L.pontis和L.acetotolerans，這與山西汾酒[42]、牛欄山二鍋頭[43]和青稞酒[44]等清香型白酒釀造系統(tǒng)中報(bào)道的優(yōu)勢乳酸菌種有明顯差異。此外，發(fā)酵0、3 d和12 d是細(xì)菌α多樣性、β多樣性和物種組成動態(tài)變化的主要時(shí)間節(jié)點(diǎn)。

進(jìn)一步根據(jù)細(xì)菌菌群的差異將整個(gè)發(fā)酵過程可分為3 個(gè)階段：I階段（0 d）、II階段（3～10 d）和III階段（12～28 d）。不同發(fā)酵階段具有不同的標(biāo)志性差異菌種，這些差異菌種一部分來自優(yōu)勢菌種，另一部分來自稀有菌種。其中A.malorum（階段I）、L.paralimentarius（階段II）和L.pontis（階段III）是各發(fā)酵階段主要的差異菌種。微生物群落是在資源競爭、營養(yǎng)共生和群體感應(yīng)等相互作用下形成的復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)[45]。L.acetotolerans、L.pontis與其他菌種均相關(guān)，不同發(fā)酵階段中差異菌種之間呈負(fù)相關(guān)，屬于同一發(fā)酵階段的差異菌種之間呈正相關(guān)，說明其中各物種在發(fā)酵過程中發(fā)揮的作用不同，此外還存在物種之間的相互競爭與共生等關(guān)系[43]。

清香型白酒的釀造屬于固態(tài)發(fā)酵法，是邊糖化邊發(fā)酵工藝[46]。糖化主要是淀粉等多糖酶解轉(zhuǎn)化形成葡萄糖等可發(fā)酵性糖，發(fā)酵主要完成葡萄糖到乙醇及微量風(fēng)味組分的轉(zhuǎn)變[47]。階段I中淀粉含量高，微生物繁殖快，短時(shí)間內(nèi)生成大量發(fā)酵熱，導(dǎo)致酒醅溫度升高，微生物利用氧氣進(jìn)行生長繁殖及各類代謝活動產(chǎn)生CO2，引起pH值降低，酸度升高。階段II中隨著淀粉被消耗，微生物繁殖速度降低，酒醅溫度下降，厭氧及兼性厭氧細(xì)菌微生物的大量增殖生成多種有機(jī)酸，導(dǎo)致酒醅酸度增加，適量的酸能增加白酒的后味，使酒體更加豐滿。在階段III中一些具有酯化作用的微生物代謝產(chǎn)生較多的酶，對階段I生成的酸和醇產(chǎn)生催化酯化反應(yīng)的作用，酸度的增加有利于酯類物質(zhì)的形成，酯類物質(zhì)的生成會消耗酸類物質(zhì)，導(dǎo)致pH值逐步降低。酯類的生成會消耗乙醇以及厭氧微生物利用乙醇進(jìn)行生長繁殖[48]，造成乙醇含量呈現(xiàn)動態(tài)變化。酒醅中的水分一部分來自于釀造用水，另一部分來自于釀酒微生物發(fā)酵代謝[49]，水分為整個(gè)發(fā)酵順利進(jìn)行奠定基礎(chǔ)。差異菌種與理化因子關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，階段I和II的微生物與淀粉含量、pH值和溫度正相關(guān)，階段III的差異菌種主要與酸度、水分含量和氧化還原電位呈正相關(guān)。因此，發(fā)酵環(huán)境對發(fā)酵過程影響顯著[50]。

發(fā)酵過程中，物種替換和物種流失兩種現(xiàn)象導(dǎo)致微生物群落多樣性的形成，而影響其形成和自組裝的生態(tài)進(jìn)程包括基于環(huán)境選擇和生物競爭生態(tài)位理論的確定性過程，以及基于擴(kuò)散和隨機(jī)出生死亡中性理論的隨機(jī)性過程[51]。清香型白酒發(fā)酵過程中大部分細(xì)菌群落幾乎都是替換現(xiàn)象[13]，基于iCAMP群落組裝進(jìn)一步挖掘發(fā)現(xiàn)主要為隨機(jī)性過程中的生態(tài)DR[52]，即入缸時(shí)（階段I）帶入的微生物定植并占據(jù)酒曲微生物的生態(tài)位造成細(xì)菌菌群的隨機(jī)出生、死亡和繁殖，這種現(xiàn)象可能來源于淀粉含量的影響，白酒釀造中多數(shù)細(xì)菌依賴真菌降解淀粉產(chǎn)生的還原糖作為碳源，進(jìn)行生長繁殖和代謝。釀造過程中因?yàn)樵虾途魄牟煌瑢?dǎo)致所產(chǎn)生的還原糖不同，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)菌所利用的碳源不同，最終影響細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)差異[53]。因此淀粉含量是影響階段I細(xì)菌群落自組裝的主要因素。溫度可以在短時(shí)間內(nèi)影響白酒釀造過程中功能微生物群落結(jié)構(gòu)（階段II），導(dǎo)致發(fā)酵環(huán)境發(fā)生擾動，細(xì)菌受到均勻選擇促使一些細(xì)菌群落發(fā)生系統(tǒng)發(fā)育性聚集，使得更適應(yīng)這種環(huán)境微生物的相對豐度提高。水分含量的控制是代謝活動和生命的關(guān)鍵組成部分，階段III作為細(xì)菌呼吸作用的最后階段，各種芳香化合物（主要是酸和酯）通過物理變化（范德華相互作用等）與化學(xué)反應(yīng)（如還原、氧化和酯化等）實(shí)現(xiàn)平衡[54]。所以水分含量是導(dǎo)致階段III的細(xì)菌群落自組裝的主要因素。而且不同生物體對環(huán)境變化的反應(yīng)也存在很大的差異。在不同微生物種群中，分散能力、多樣化和對DR的敏感性也有本質(zhì)上的不同。這些因素最終造成發(fā)酵過程由選擇的確定性過程逐漸向DR主導(dǎo)的隨機(jī)性過程轉(zhuǎn)變。

綜上所述，由于開放的發(fā)酵環(huán)境和動態(tài)的發(fā)酵過程，清香型白酒發(fā)酵過程中所涉及的微生物群落表現(xiàn)出明顯的多樣性和動態(tài)性。本研究通過對清香型白酒發(fā)酵過程中細(xì)菌菌群物種進(jìn)行精準(zhǔn)定位，揭示細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的演替及自組裝機(jī)制，為進(jìn)一步提升清香型白酒釀造工藝，優(yōu)化產(chǎn)品穩(wěn)定性和安全性提供了基礎(chǔ)理論。然而，本研究只關(guān)注了酒醅發(fā)酵過程中優(yōu)勢細(xì)菌菌種的演替，除此之外還存在大量的低豐度物種，這些物種隨著發(fā)酵過程的進(jìn)行還可能具有一定的功能和對群落自組裝的貢獻(xiàn)。因此，未來應(yīng)結(jié)合測序技術(shù)的理論知識，將PacBio SMRT測序和傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法相結(jié)合，根據(jù)酒醅發(fā)酵基質(zhì)環(huán)境和不同微生物生物學(xué)特征，進(jìn)一步對中、低豐度的微生物物種進(jìn)行分離和功能驗(yàn)證。