糯米面團中金黃色葡萄球菌生長預測模型的構建

凍梓杰，黃陽陽，周偉濤，黃忠民,2,3，艾志錄,2,3，鄭 琦，王曉杰,2，索 標,2,3,*

（1.河南農業(yè)大學食品科學技術學院，河南 鄭州 450002；2.農業(yè)農村部大宗糧食加工重點實驗室，河南 鄭州 450002；3.國家速凍米面制品加工技術研發(fā)專業(yè)中心，速凍面米及調制食品河南省工程實驗室，河南 鄭州 450002）

食源性致病菌是導致食物中毒的最主要原因[1]，根據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，世界上近十分之一的人在食用受污染的食物后患病，每年有數(shù)十萬人直接或間接死于食源性疾病[2]，因此，由食源性致病菌引起的食源性疾病已成為全球關注的重要問題[3]。金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是常見的食源性致病菌且廣泛存在于環(huán)境中，大多數(shù)感染金黃色葡萄球菌的人在感染后6～48 h會出現(xiàn)嘔吐、腹瀉、惡心、腹部絞痛等癥狀[4]。前人研究表明，金黃色葡萄球菌廣泛分布于米面制品中[5]。糯米面團主要由糯米粉制成，是我國傳統(tǒng)米面食品的主要原料之一，隨著糯米產(chǎn)品品種的不斷多樣化及其工業(yè)化生產(chǎn)的加速發(fā)展，其食用的安全性越來越引起人們的關注[6]，糯米面團的高水分活度是引起微生物增殖的重要原因之一[7]，因此在糯米面團加工制作、貯藏過程中加強致病菌的防控具有重要意義。

微生物生長預測模型可以用來描述在不同環(huán)節(jié)如食品的加工、運輸以及銷售等過程中環(huán)境條件變化對微生物生長數(shù)量的影響[8]，現(xiàn)已被廣泛應用于預測食品的貨架期、HACCP體系建立以及食品安全風險評估等[9]。Huang Zhongmin等[10]揭示在4～45 ℃條件下，不同金黃色葡萄球菌的生長擬合模型具有較大差異。Park等[11]研究了3～37 ℃條件下蛋黃中金黃色葡萄球菌混合菌懸液的生長動力學，證明采用Baranyi一級模型和Ratkowsky平方根模型可較好地模擬金黃色葡萄球菌在此環(huán)境下的生長。Hwang等[12]采用一步動力學分析法構建微生物三級預測模型，描述了蠟樣芽孢桿菌在炒飯中的生長和存活情況。然而，目前有關糯米面團中金黃色葡萄球菌的生長模型尚未建立。

本研究通過一級和二級模型描述4～37 ℃條件下金黃色葡萄球菌在糯米面團中的生長規(guī)律，并建立其生長動力學模型，以期為糯米面團中金黃色葡萄球菌的風險評估提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糯米粉 益海嘉里食品工業(yè)有限公司；BP瓊脂平板基礎、肉膏蛋白胨肉湯LB、酵母浸粉（yeast extract，YE）、亞碲酸鉀卵黃增菌液 北京路橋技術股份有限公司；氯化鈉（分析純）天津市德恩化學試劑有限公司；無菌均質袋 青島海博生物技術有限公司。

金黃色葡萄球菌ATCC 8095來源于美國典型菌種保藏中心，金黃色葡萄球菌NCTC 8325來源于英國典型菌種保藏中心；菌株均保存于－70 ℃甘油管中。

1.2 儀器與設備

SX-500高壓蒸汽滅菌鍋 日本Tomy公司；SW-CJ-1FD型潔凈工作臺 蘇州凈化有限公司；WS-250恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海比朗儀器有限公司；SCIENTZ-09無菌均質器 寧波新芝生物科技股份有限公司；HZQ-A恒溫恒濕搖床 蘇州威爾實驗用品有限公司；5430R型高速臺式冷凍離心機 德國Eppendorf公司；MDF-U5412醫(yī)用低溫冰箱 無錫久平儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液的制備

參照Ellouze 等[13]的方法，將金黃色葡萄球菌ATCC 8095和NCTC 8325菌株接種到LB-YE肉湯中，在37 ℃過夜培養(yǎng)至指數(shù)后期，并采用0.85 g/100 mL無菌生理鹽水清洗3 次，將兩種金黃色葡萄球菌等體積混合制備混合母液，得到約108CFU/mL的菌懸液備用。

1.3.2 糯米面團的制備、細菌接種與計數(shù)

將糯米粉置于紫外燈下30 min以滅活背景菌群，將糯米粉與無菌水按質量比5∶4混合揉制均勻制成約5 g的糯米面團，并分裝在無菌均質袋中，制作全程在無菌操作臺下進行。將菌懸液用0.85 g/100 mL無菌生理鹽水稀釋至約4（lg（CFU/mL）），吸取100 μL稀釋后菌液均勻接種至糯米面團表面并密封采樣袋。

分別將接種后的糯米面團放置于4、11、18、25、32 ℃和37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中貯藏。4 ℃和11 ℃條件下每間隔24 h、18 ℃條件下每間隔12 h、25 ℃條件下每間隔6 h、32 ℃和37 ℃條件下每間隔3 h取出一組進行金黃色葡萄球菌濃度測定，不同溫度下測定終止時間以生長達到穩(wěn)定后期為準。每個樣品在無菌條件下加入45 mL的0.85 g/100 mL無菌生理鹽水，用無菌均質器以12 次/s拍打2 min。取100 μL梯度稀釋液涂布至BP平板，放置在37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后進行計數(shù)。每個處理至少3 個平行。

1.3.3 糯米面團中金黃色葡萄球菌一級生長模型的建立

分別采用Huang[14]、Baranyi[15]和修正的Gompertz模型[16]作為一級生長模型擬合各溫度下糯米面團中金黃色葡萄球菌生長曲線。其中Huang模型如式（1）、（2）所示，Baranyi模型如式（3）、（4）所示，修正的Gompertz模型如式（5）所示：

式中：Y（t）為t時刻金黃色葡萄球菌的數(shù)量（lg（CFU/g））；Y0、Ymax為初始菌數(shù)量和穩(wěn)定期菌數(shù)量（lg（CFU/g））；μmax為最大比生長速率/h－1；t為培養(yǎng)時間/h；λ為延滯時間/h；h0為反應細菌所處的生理狀態(tài)[17]，h0＝λμmax；α為常數(shù)（α=4）。

1.3.4 二級模型的建立

分別使用Ratkowsky平方根模型[18]和Huang平方根模型[19]構建二級模型，用以評價溫度對糯米面團中金黃色葡萄球菌生長速率的影響，Ratkowsky和Huang模型計算如式（6）、（7）所示：

式中：Tmin和Tmax分別為微生物最低、最高生長溫度/℃；T0為最低生長溫度/℃；T為培養(yǎng)溫度/℃；μmax為生長速率/h－1。

1.3.5 模型的外部驗證

金黃色葡萄球菌在20 ℃左右時生長較為平緩，且糯米制品在加工過程中環(huán)境溫度大約為20 ℃，可較好地作為生長預測模型外部驗證的驗證溫度[20]，因此本研究額外開展20 ℃恒溫條件下糯米面團中金黃色葡萄球菌生長實驗，收集生長數(shù)據(jù)；并將實測值與模型預測值進行比較以確認模型的擬合度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

本研究使用Microsoft Excel 2019進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和處理，采用預測微生物學軟件IPMP 2013和Origin 2019作圖并分析，對糯米面團中金黃色葡萄球菌的生長數(shù)據(jù)進行擬合處理。利用Origin 2019軟件，繪制一、二級模型并進行分析。

2 結果與分析

2.1 糯米面團中金黃色葡萄球菌一級生長模型的建立

為研究溫度對糯米面團中金黃色葡萄球菌生長的影響，選用4、11、18、25、32 ℃和37 ℃溫度節(jié)點，分別使用Huang模型、Baranyi模型、修正的Gompertz模型方程進行非線性擬合，這3 種模型也是目前常用的描述致病菌生物生長的一級模型[21]。各溫度下金黃色葡萄球菌生長擬合曲線如圖1所示，金黃色葡萄球菌初始濃度為3.9～4.3（lg（CFU/g）），隨著貯藏溫度的升高，相同時間下細菌濃度逐漸增加。在4 ℃時金黃色葡萄球菌生長速率緩慢，恒溫培養(yǎng)7 d（168 h）后，其細菌濃度為4.5（lg（CFU/g）），增加約0.5（lg（CFU/g）），未觀察到明顯的生長，不能進行一級生長模型的有效擬合（圖2）。在11～37 ℃溫度區(qū)間時糯米面團中金黃色葡萄球菌均能正常生長且進行模型擬合，因此本研究選取此溫度階段下生長數(shù)據(jù)用于數(shù)據(jù)分析。

圖1 不同溫度下糯米面團中金黃色葡萄球菌的一級生長模型Fig.1 Primary models for S.aureus growth prediction in glutinous rice dough at different temperatures

圖2 4℃條件下糯米面團中金黃色葡萄球菌的生長曲線Fig.2 Growth curve of S.aureus in glutinous rice dough at 4℃

如圖1所示，采用上述3 種一級模型對數(shù)據(jù)進行擬合后，金黃色葡萄球菌在各溫度下（11～37 ℃）的實驗實測值均接近相應模型預測值，表明3 個模型均能成功描述樣品中細菌的生長情況。各培養(yǎng)溫度下糯米面團中金黃色葡萄球菌呈現(xiàn)出典型的3 個生長特征階段：延滯期、對數(shù)期和穩(wěn)定期；且隨著溫度的升高，其延滯期總體逐漸降低，細菌生長速率逐漸增加。延滯期的長短取決于多種因素，環(huán)境溫度對延滯期有顯著影響，其規(guī)律一般表現(xiàn)為延滯期隨著溫度的升高而逐漸減少[22]。

2.2 一級模型的比較分析

本實驗采用延滯時間（λ）和最大比生長速率（μmax）指標判定微生物生長速率的快慢，用赤池信息準則（akaike information criterion，AIC）、準確因子（Af）、偏差因子（Bf）、均方誤差（mean squared error，MSE）、均方根誤差（root mean square error，RMSE）以及決定系數(shù)（R2）對模型進行評價[23]。其中R2、Af和Bf越趨近于1則代表該模型在此溫度下擬合效果越好，AIC、MSE和RMSE越小代表該模型擬合精確度越高[24]。

由表1可知，在11～37 ℃時，Huang模型中金黃色葡萄球菌的μmax隨溫度的升高由0.044 h－1增加至0.651 h－1，而相對應的λ由14.454 h降低至1.200 h；在Baranyi模型擬合下μmax隨溫度的升高由0.045 h－1增加至0.708 h－1，λ由16.933 h降低至1.607 h；修正的Gompertz模型中μmax隨溫度的升高由0.046 h－1增加至0.611 h－1，λ由16.463 h降低至1.083 h。表1中上述3 種一級生長模型（Huang、Baranyi和修正的Gompertz）中AIC、MSE、RMSE和R2較為接近，R2且各模型間參數(shù)無明顯差異，說明3 種模型對糯米面團中金黃色葡萄球菌的生長曲線均具有較好的擬合精確度。但在低溫環(huán)境下（11 ℃）和較高環(huán)境下（37 ℃）修正的Gompertz模型中AIC和RMSE明顯低于其他兩種模型、R2系數(shù)高于其他兩種模型，表明此溫度下（11 ℃和37 ℃）糯米面團中金黃色葡萄球菌生長曲線更適合用修正的Gompertz模型進行擬合。在較溫和的溫度區(qū)間（18、25 ℃和32 ℃）內修正的Gompertz模型與其他兩種模型間參數(shù)無明顯差異，均能較好地模擬金黃色葡萄球菌在糯米面團的生長。

表1 不同溫度糯米面團中金黃色葡萄球菌的生長動力學參數(shù)Table 1 Growth kinetic parameters of S.aureus in glutinous rice dough at different temperatures

修正的Gompertz模型在低溫11 ℃和適宜37 ℃條件下表現(xiàn)最佳，此時一級模型參數(shù)優(yōu)于Huang和Baranyi模型，在溫和溫度（18～32 ℃）下表現(xiàn)良好，3 種一級模型差異并不顯著，這可能是因為該范圍包括金黃色葡萄球菌理想生長溫度[25]，使其生長更具可預測性。本研究和Lu等[26]在熟制米飯中金黃色葡萄球菌的研究結果有所差異，Huang、Baranyi和修正的Gompertz模型均能較好地擬合金黃色葡萄球菌在12～35 ℃條件下的生長，但Huang模型在此條件下的擬合度最佳，這可能與此研究在以大米為基質的前提下加入豬肉松且進行了熟制有關，生長基質的不同可能是導致差異的主要原因。

2.3 糯米面團中金黃色葡萄球菌生長二級模型的比較分析

本研究采用Ratkowsky平方根模型和Huang平方根模型對貯藏溫度與生長速率之間的關系進行擬合，二級模型曲線如圖3所示。Ratkowsky平方根模型和Huang平方根模型的RMSE分別為0.048和0.051，且Af和Bf均接近1（表2），這表明2 種二級模型適用于描述溫度對糯米面團樣品中金黃色葡萄球菌生長速率的影響。如表3所示，由Ratkowsky平方根模型擬合金黃色葡萄球菌最低生長溫度和最高生長溫度分別為0.049 ℃和47.135 ℃，Huang平方根模型擬合結果分別為和4.641 ℃和47.121 ℃，本實驗中4 ℃條件下金黃色葡萄球菌仍存在緩慢生長的現(xiàn)象（圖2），在168 h內增長了約0.5（lg（CFU/g）），說明Huang平方根模型并不適合描述低溫下金黃色葡萄球菌的實際生長情況；Ratkowsky平方根模型的Af和Bf等模型擬合度參數(shù)均優(yōu)于Huang平方根模型，而且Ratkowsky平方根模型與金黃色葡萄球菌的生物學最低生長溫度較為吻合，因此本研究建議將其作為糯米面團中金黃色葡萄球菌的二級模型。Xie Zhaopeng等[27]研究表明，乳制品中金黃色葡萄球菌的最低、最佳和最高生長溫度分別為5.9、42.0 ℃和49.2 ℃；Valík等[28]證明金黃色葡萄球菌在生牛乳中最低生長溫度為4.56 ℃；Lu等[26]在研究中證明Huang平方根模型是擬合金黃色葡萄球菌在熟制米飯中存活的最優(yōu)二級模型（最低生長溫度為7.0～7.9 ℃）；但鑒于微生物生長預測模型的效率因生長基質、環(huán)境條件等因素而異，因此有必要對具體條件下的模型擬合情況進行具體分析。本實驗為了更好地模擬真實制作的流程，采用了兩株金黃色葡萄球菌進行混合培養(yǎng)并接種，前人研究結果中最低生長溫度（4～8 ℃）均高于本實驗結論（0.049 ℃），不同的生長基質和細菌菌種可能是造成最低生長溫度有所差異的重要原因。

表3 糯米面團中金黃色葡萄球菌生長速率的二級模型參數(shù)Table 3 Parameters of secondary models for the specific growth rate of S.aureus in glutinous rice dough

圖3 2 種二級模型描述溫度對糯米面團樣品中食源性致病菌生長速率影響的擬合曲線Fig.3 Curve fitting with two secondary models of the effect of temperature on the growth of foodborne pathogens in glutinous rice dough

經(jīng)過2.2節(jié)對3 種一級生長模型擬合度的對比，采用修正的Gompertz模型時，金黃色葡萄球菌λ與培養(yǎng)溫度有如圖4A所示的對數(shù)非線性關系；μmax和λ之間對數(shù)線性關系如圖4B所示，lnλ與lnμmax呈線性減少關系。

圖4 金黃色葡萄球菌生長動力學參數(shù)比較Fig.4 Comparison of S.aureus growth kinetic parameters

2.4 模型的外部驗證

為了從外部驗證修正的Gompertz模型在本研究的擬合準確度，在本研究中未設置的其他溫度（20 ℃）下進行了存儲實驗，并將實驗實測值與模型預測值進行更直觀比較（圖5）。圖中點越接近斜線，說明實驗值和預測值越接近，即所建立模型的效果越好。經(jīng)外部模型驗證證明，金黃色葡萄球菌在修正的Gompertz模型擬合情況下Af、Bf均小于1.15，且R2＞0.99，表示在此模型擬合下能很好地預測金黃色葡萄球菌的生長規(guī)律。

圖5 外部實驗20℃條件下實驗值與預測值的相關性比較Fig.5 Correlation between observed and predicted values in external experiments at 20℃

3 結論

研究了4～37 ℃恒溫條件下糯米面團中金黃色葡萄球菌的生長，并使用不同的一級和二級模型描述金黃色葡萄球菌生長受貯藏溫度的影響規(guī)律。根據(jù)一級模型擬合精確度參數(shù)對比分析，修正的Gompertz模型可更好地模擬細菌生長；通過對二級模型參數(shù)及實際生長情況分析，Ratkowsky平方根模型描述的溫度范圍較廣，且能夠更準確地預測最低生長溫度（0.049 ℃），因此更適合作為金黃色葡萄球菌的二級模型。修正的Gompertz模型和Ratkowsky平方根模型可用于預測恒溫貯藏條件下糯米面團中金黃色葡萄球菌的生長，并評估在糯米加工、貯藏等過程中溫度濫用的情況下金黃色葡萄球菌的風險。本研究結果對預測和監(jiān)控金黃色葡萄球菌在糯米面團的生長繁殖，保證以糯米為基質的食品安全性等方面具有參考價值。