雨生紅球藻新型抗氧化肽的制備純化、鑒定篩選及其對(duì)秀麗線蟲抗氧化能力的影響

何宛詩，鄭欽生，陳小艷，夏增慧，曹 庸，劉曉娟

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東省功能食品活性物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642）

人體長(zhǎng)時(shí)間處于不良環(huán)境或隨著年齡增長(zhǎng)，抗氧化抵御系統(tǒng)會(huì)衰弱，且因自由基形成過多或消除過慢，氧化還原穩(wěn)態(tài)被打破，從而在機(jī)體內(nèi)造成氧化應(yīng)激，引起不可逆的細(xì)胞破壞。氧化應(yīng)激可誘發(fā)心血管疾病、阿爾茨海默癥及癌癥等多種慢性疾病[1-3]。為降低這些疾病風(fēng)險(xiǎn)，人們?cè)絹碓絻A向于服用抗氧化劑，以輔助協(xié)調(diào)身體的氧化還原平衡。一些食源性生物活性肽具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、易吸收、穩(wěn)定性好、無免疫反應(yīng)等優(yōu)勢(shì)，在抗氧化劑領(lǐng)域備受青睞，利用自然資源篩選和獲得抗氧化效用的肽產(chǎn)品，正在成為食品和醫(yī)療行業(yè)研究的動(dòng)力[4-5]。

作為新食品原料，雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高的海洋微藻[6]。為提取藻中的“超級(jí)抗氧化劑”蝦青素，全球范圍內(nèi)雨生紅球藻的年產(chǎn)量達(dá)545 t，我國(guó)是世界雨生紅球藻蝦青素市場(chǎng)的產(chǎn)能大國(guó)之一[7]。然而，大規(guī)模生產(chǎn)蝦青素的同時(shí)也留下了大量工業(yè)藻渣，應(yīng)用局限于動(dòng)物飼料或被直接丟棄。雨生紅球藻渣含有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，其中蛋白質(zhì)含量達(dá)20.8%～22.2%，仍存在值得探究的高附加值[8-9]。本團(tuán)隊(duì)前期通過生物酶解法從雨生紅球藻渣蛋白中獲得抗氧化酶解物，并顯示較好的體外抗氧化能力[10]。微藻蛋白酶解物是生物活性肽的優(yōu)質(zhì)來源，可經(jīng)過進(jìn)一步的純化提高其利用價(jià)值。Hu Xiao等[11]利用超濾、凝膠層析色譜和反相液相色譜技術(shù)分離裂壺藻蛋白酶解物，并通過電噴霧電離質(zhì)譜法鑒定多肽結(jié)構(gòu)，獲得裂壺藻抗氧化肽PYK，相比純化前的蛋白酶解物，抗氧化肽PYK顯示出更強(qiáng)的羥自由基清除能力和還原力。因此，分離純化是強(qiáng)化微藻多肽功能活性的關(guān)鍵技術(shù)，可進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)藻渣的綜合利用。截止目前，關(guān)于雨生紅球藻生物活性肽的研究還有待完善。

近幾年，為了克服傳統(tǒng)多肽分離法的耗資大、周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)，計(jì)算機(jī)輔助建模技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于多肽構(gòu)效關(guān)系評(píng)估和活性篩選[12-13]。分子模擬對(duì)接技術(shù)常用于預(yù)測(cè)和篩選生物活性肽，其中融合多學(xué)科領(lǐng)域的專業(yè)知識(shí)，具有高效準(zhǔn)確的特點(diǎn)[14]?；趲缀闻潴w和能量配體原則，分子對(duì)接可以利用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，模擬蛋白質(zhì)或多肽與配體之間的結(jié)合模式和結(jié)合自由能，實(shí)現(xiàn)對(duì)二者間作用方式、作用力類型、相互作用位置及其他結(jié)合信息的預(yù)測(cè)[15]。一般而言，分子對(duì)接的結(jié)合自由能與活性之間顯著相關(guān)，二者線性R2可達(dá)0.974 3，表示對(duì)接最小結(jié)合能與功能活性之間具有較強(qiáng)的線性關(guān)系[16-19]。Wen Chaoting等[20]采用分子對(duì)接對(duì)比5 條西瓜籽抗氧化肽P1～P5與1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、2,2′-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽離子自由基的結(jié)合情況，結(jié)果顯示P1（RDPEER）與兩個(gè)自由基的最小結(jié)合自由能最低，預(yù)測(cè)P1與配體之間形成了較強(qiáng)的氫鍵和疏水性互作用，意味著其抗氧化活性最強(qiáng)。該預(yù)測(cè)結(jié)果在Wen Chaoting等[21]的其他實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)，P1的自由基清除能力和抑制活性氧（reactive oxygen species，ROS）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）的能力最強(qiáng)，與分子對(duì)接結(jié)果對(duì)應(yīng)。

因此，本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，將雨生紅球藻蛋白酶解物作為原料，以ABTS陽離子自由基清除力為活性跟蹤指標(biāo)，采用超濾、制備型和分析型液相色譜進(jìn)行分離純化，制備抗氧化效果最佳的多肽組分；然后，經(jīng)液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)法鑒定多肽組分的氨基酸序列，并利用分子對(duì)接技術(shù)研究多肽清除ABTS陽離子自由基的能力，以揭示雨生紅球藻抗氧化肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)，闡明抗氧化肽的作用機(jī)理；基于秀麗隱桿線蟲模型研究藻多肽的體內(nèi)抗氧化活性。為雨生紅球藻渣的高值化利用提供依據(jù)，并為食源性抗氧化劑的生產(chǎn)提供開發(fā)思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雨生紅球藻渣由荊州市天然蝦青素有限公司提供。野生型N2線蟲購(gòu)買于Caenorhabditis Genetics Center。大腸桿菌（Escherichia coli）OP50由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院惠贈(zèng)。

堿性蛋白酶（200 000 U/g）、ABTS（98%）、鏈霉素硫酸鹽（分析純，98%）上海源葉生物科技有限公司；技術(shù)瓊脂粉、胰蛋白胨 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；膽固醇、次氯酸鈉溶液（分析純）上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司；MDA試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒、二奎啉甲酸（bicinchoninic acid，BAC）總蛋白定量試劑盒 南京建成生物工程研究所；純化鑒定中的試劑均為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AL104天平 瑞士梅特勒-托利多公司；PB-10 pH計(jì)賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；HSJ-2A磁力水浴鍋 常州澳華儀器有限公司；超濾管（3、10 kDa）美國(guó)Millipore公司；PREP 150LC制備型液相色譜分析儀美國(guó)Waters公司；LC-10AT VP Plus分析型液相色譜儀日本Shimadzu公司；ALPHA 2-4 LDplus冷凍干燥機(jī)德國(guó)Marin Christ公司；JXFSTPR-32全自動(dòng)樣品快速研磨儀 上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；EnSpire多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)PerkinElmer公司；生化培養(yǎng)箱 寧波萊?？萍加邢薰尽?/p>

1.3 方法

1.3.1 雨生紅球藻酶解物制備

參考前期研究的方法[10]，用堿溶酸沉法從雨生紅球藻渣中提取蛋白質(zhì)，然后在底物質(zhì)量濃度9 g/100 mL、加酶量質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.7%、溫度40 ℃、pH 11.5和3 h的條件下，加入堿性蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解結(jié)束后以6 000 r/min轉(zhuǎn)速離心20 min，將上清液進(jìn)行冷凍干燥，獲得雨生紅球藻酶解物。

1.3.2 分離純化

1.3.2.1 超濾[22]

利用分子質(zhì)量為10 kDa和3 kDa的超濾膜依次對(duì)雨生紅球藻酶解物進(jìn)行純化，得到3 個(gè)分子質(zhì)量不同的組分，收集各組分并進(jìn)行凍干，以評(píng)價(jià)各組的ABTS陽離子自由基清除活性，并選出最優(yōu)組分進(jìn)一步分離純化。

1.3.2.2 制備型液相色譜

參考Kim等[23]方法，利用SunFire Prep C18OBD色譜柱（19 mm×250 mm，5 μm），在制備型高效液相色譜系統(tǒng)上對(duì)超濾組分進(jìn)行分離純化。色譜條件：流動(dòng)相A為體積分?jǐn)?shù)0.1%三氟乙酸溶液，流動(dòng)相B為乙腈；線性梯度洗脫程序：0～18 min，90%～67.5% A、10%～32.5% B，流速5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm，重復(fù)多次進(jìn)樣收集各分離峰，冷凍干燥后測(cè)量各峰組分的ABTS陽離子自由基清除活性，選出活性最強(qiáng)的組分進(jìn)行下一步分離。

1.3.2.3 分析型液相色譜

根據(jù)Agrawal等[24]方法，利用Diamonsil C18分析液相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），在分析型高效液相色譜系統(tǒng)上對(duì)一次分離所得組分進(jìn)行分離純化。色譜條件：流動(dòng)相A為體積分?jǐn)?shù)0.1%三氟乙酸溶液，流動(dòng)相B為乙腈；線性梯度洗脫程序：0～10 min，90% A、10% B；10～20 min，90%～80% A、10%～20% B；20～22 min，80%～90% A、20%～10% B，流速0.5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm，富集各分離峰，冷凍干燥后測(cè)量各峰組分的ABTS陽離子自由基清除活性，選出活性最強(qiáng)的多肽組分。

1.3.3 結(jié)構(gòu)鑒定

參考Xia Zhen 等[25]方法，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）法對(duì)多肽組分進(jìn)行氨基酸序列測(cè)定。色譜條件：C18反相色譜柱（Acclaim PepMap RSLC，75 μm×25 cm，2 μm，100 ?）；流動(dòng)相A為0.1%甲酸-水，流動(dòng)相B為80%乙腈溶液（含0.1%甲酸）；梯度洗脫程序：0～60 min，95%～62% A、5%～38% B。質(zhì)譜條件：采用ThermoFisher Q Exactive系統(tǒng)結(jié)合納升噴霧Nano Flex離子源，噴霧電壓為1.9 kV，離子傳輸管加熱溫度為275 ℃。采用PEAKS Studio 8.5（Bioinformatics Solutions Inc.Waterloo，加拿大）軟件對(duì)原始文件進(jìn)行分析，并根據(jù)樣本種類對(duì)目標(biāo)蛋白數(shù)據(jù)庫在Uniprot中進(jìn)行檢索。

1.3.4 分子對(duì)接篩選

參考Agrawal等[24]方法，利用Chemdraw 19.0繪制多肽的三維結(jié)構(gòu)，并從PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中下載ABTS陽離子自由基配體分子的結(jié)構(gòu)（CID號(hào)：6301202）。對(duì)多肽結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化后，在Autodock 4.2.6軟件進(jìn)行多肽與ABTS陽離子自由基的分子對(duì)接，對(duì)接結(jié)果的二維與三維結(jié)構(gòu)可在Ligplot 2.1和PyMOL軟件查看。

1.3.5 ABTS陽離子自由基清除活性的測(cè)定

參照賈曉燕等[26]方法測(cè)定ABTS陽離子自由基清除率，并稍作修改。配制ABTS陽離子自由基儲(chǔ)備液（終濃度為7 mmol/L ABTS和2.45 mmol/L過硫酸鉀），并在室溫黑暗環(huán)境中靜置過夜。測(cè)定前用0.01 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.4）稀釋成ABTS陽離子自由基工作液，使溶液在734 nm波長(zhǎng)處的吸光度為0.70±0.05。測(cè)定時(shí)，在96 孔板中加入100 μL ABTS陽離子自由基工作液和100 μL待測(cè)樣品，于室溫黑暗處放置10 min，測(cè)定波長(zhǎng)734 nm處的吸光度；同時(shí)空白組數(shù)值由100 μL ABTS陽離子自由基工作液與100 μL三級(jí)水反應(yīng)獲得，對(duì)照組由100 μL磷酸緩沖液混合100 μL待測(cè)樣品獲得。

式中：A0為空白的吸光度；A1為樣品的吸光度；A2為對(duì)照的吸光度。

1.3.6 利用秀麗線蟲測(cè)定抗氧化活性[27]

秀麗線蟲在含有線蟲生長(zhǎng)培養(yǎng)基（nematode growth medium，NGM）瓊脂的培養(yǎng)皿上生長(zhǎng)，并置于20 ℃的培養(yǎng)箱中培育。為保證樣品純度，通過固相合成法制得雨生紅球藻抗氧化肽（Haematococcus pluvialisantioxidant peptide，HPp，純度99.21%）。將多肽樣品溶解在蒸餾水中，并以體積比5∶95與大腸桿菌OP50混合，配制最終濃度分別為0、50、100 μmol/L和200 μmol/L的菌液，接種在NGM板中作為秀麗線蟲的食物。使用裂解法獲得同一時(shí)期的蟲卵，待秀麗線蟲的受精卵發(fā)育至L4期，完成同期化。

在秀麗線蟲完成同期化后喂食藥物，當(dāng)處理4 d時(shí)，用M9緩沖液沖洗，低溫研磨，除去沉淀后得到線蟲研磨液，5 000 r/min離心10 min，取線蟲研磨物的上清液。用BCA試劑盒測(cè)定各組秀麗線蟲研磨液的蛋白含量，并使用相應(yīng)試劑盒測(cè)定MDA含量和SOD、CAT活力。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 雨生紅球藻抗氧化肽的分離純化

2.1.1 抗氧化肽的超濾分離純化

通過堿性蛋白酶水解得到的產(chǎn)物需要進(jìn)一步純化和富集，以獲得特定生物活性的多肽。以分子質(zhì)量為純化標(biāo)準(zhǔn)，酶解物經(jīng)超濾分離得到3 種分子質(zhì)量不同的組分，分別為F1（＞10 kDa），F(xiàn)2（3～10 kDa）和F3（＜3 kDa），結(jié)果見圖1所示。結(jié)果表明，F(xiàn)3在3 個(gè)組分里的ABTS陽離子自由基清除能力最強(qiáng)，在0.25 mg/mL的清除率達(dá)（38.11±1.11）%（P＜0.05）。研究表明分子質(zhì)量是影響多肽抗氧化活性的關(guān)鍵因素[2]。小分子肽因體積小更容易被人體吸收，或更易與目標(biāo)自由基相互作用，能更好地發(fā)揮活性，從而具有更強(qiáng)的抗氧化效果[5]。據(jù)報(bào)道，抗氧化肽的分子質(zhì)量通常在200～2 000 Da范圍內(nèi)，超濾組分F3在該分子質(zhì)量范圍[28]。因此，確定組分F3為進(jìn)一步分離對(duì)象。

圖1 超濾組分F1、F2和F3的ABTS陽離子自由基清除能力Fig.1 ABTS radical cation scavenging capacity of ultrafiltration fractions F1,F2 and F3

2.1.2 抗氧化肽的制備型液相色譜分離純化

反相液相色譜技術(shù)通過連續(xù)相和流動(dòng)相將物質(zhì)從混合物中分離出來，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于多肽純化中[29]。使用制備型液相色譜儀對(duì)組分F3進(jìn)一步純化，在不同保留時(shí)間下依次收集組分I～VI，如圖2A所示，分離得到6 個(gè)組分I、II、III、IV、V和VI。

圖2 組分I、II、III、IV、V和VI的HPLC圖（A）和ABTS陽離子自由基清除率（B）Fig.2 Chromatograms (A) and ABTS radical cation scavenging capacity (B) of six subfractions purified by preparative HPLC

由圖2B可知，組分VI在0.25 mg/mL的ABTS陽離子自由基清除率達(dá)（43.37±0.19）%，顯著高于其他組分（P＜0.05）。多肽的疏水性質(zhì)與抗氧化活性密切相關(guān)，色氨酸、脯氨酸等疏水性氨基酸能夠促進(jìn)肽在脂質(zhì)-水界面處溶解，從而更高效地清除自由基[2]。根據(jù)C18色譜柱的分離原理，最后一個(gè)響應(yīng)峰對(duì)應(yīng)的極性最小，其疏水性很大概率比其他組分大，這也可能是VI抗氧化活性強(qiáng)于其他組分的原因。因此，選擇VI組分參與下一步純化。

2.1.3 抗氧化肽的分析型液相色譜分離純化

為達(dá)到精密度更高的純化效果，使用分析型液相色譜進(jìn)一步對(duì)組分VI分離，得到3 個(gè)組分i、ii和iii。如圖3所示，組分i的ABTS陽離子自由基清除活性顯著高于組分ii和iii（P＜0.05），在0.25 mg/mL質(zhì)量濃度下清除率達(dá)（96.97±2.00）%。

匯總后可知（表1），經(jīng)過3 個(gè)分離步驟的純化，雨生紅球藻蛋白酶解物的ABTS陽離子自由基清除率逐步增強(qiáng)（P＜0.05），超濾組分F3、制備液相組分VI和分析液相組分i的清除活性分別是蛋白酶解物的1.16、1.33 倍和2.96 倍，這也充分說明分離純化可有效篩選活性組分。因此，富集組分i進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，以探明雨生紅球藻抗氧化肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)。

表1 雨生紅球藻源不同純化多肽組分的ABTS陽離子自由基清除活性Table 1 ABTS radical cation scavenging capacity of protein hydrolysate from H.pluvialis and its peptide fractions

2.2 雨生紅球藻抗氧化肽的結(jié)構(gòu)鑒定

目前常用的多肽結(jié)構(gòu)鑒定方法有蛋白質(zhì)/肽序列分析儀法、質(zhì)譜法和核磁共振等方法，其中質(zhì)譜法具有高靈敏度和高效率等優(yōu)點(diǎn)，適用于肽類物質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)檢測(cè)[11]。因此，本研究采用HPLC-MS/MS法檢測(cè)雨生紅球藻抗氧化多肽組分i的組成及序列。檢測(cè)方法的掃描范圍為m/z100～1 500，通過PEAKS Studio軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和De novo分析。經(jīng)過Uniprot數(shù)據(jù)庫檢索，得到10 個(gè)多肽序列，命名為i-1～i-10，其肽段信息見表2所示，肽鏈質(zhì)譜圖見圖4。

表2 雨生紅球藻多肽的結(jié)構(gòu)鑒定Table 2 Structural characterization of H.pluvialis peptide fractions

圖4 雨生紅球藻多肽i-1～i-10的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.4 Secondary mass spectra of H.pluvialis peptides i-1 to i-10

由表2可知，i-1～i-10的肽鏈長(zhǎng)度均在5～10以內(nèi)，分子質(zhì)量在576.29～736.35 Da范圍內(nèi)，這些肽鏈的尺寸符合大部分抗氧化肽的結(jié)構(gòu)特征[28]。另外，所有多肽序列的疏水性氨基酸含量均在60%以上，其電離性質(zhì)具有一定優(yōu)勢(shì)，可能增強(qiáng)多肽的抗氧化能力[30]。結(jié)果表明部分肽鏈序列來自葉綠素，而葉綠素已被證明是生產(chǎn)生物活性肽的良好蛋白原料[31]。作為光合作用的位點(diǎn)，葉綠體是細(xì)胞中自由基的主要來源，因此需要強(qiáng)大的防御系統(tǒng)以保護(hù)自身的完整性[32]。面對(duì)氧化應(yīng)激、強(qiáng)光脅迫等極端信號(hào)時(shí)，葉綠體會(huì)促進(jìn)細(xì)胞器內(nèi)蛋白酶的運(yùn)作，以葉綠素結(jié)合蛋白等為底物，產(chǎn)生相應(yīng)活性的多肽作出抗逆響應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)防御基因表達(dá)和相應(yīng)次級(jí)代謝物合成[33]。因此推斷來源于葉綠素的多肽具有強(qiáng)抗氧化能力的原因，可能與葉綠體應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激的機(jī)制有關(guān)。曾有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在極大螺旋藻中，來源于葉綠素蛋白的多肽RALGFDFRR比來源于其他蛋白的多肽，具有更大發(fā)揮抗氧化活性的潛力[34]。綜上所述，本研究推測(cè)雨生紅球藻抗氧化肽具備分子質(zhì)量小、疏水性氨基酸含量高、來源于葉綠素蛋白等特點(diǎn)。

2.3 利用分子對(duì)接技術(shù)篩選雨生紅球藻抗氧化肽

一般而言，分子模擬對(duì)接預(yù)測(cè)的結(jié)合能越低，意味著蛋白與配體的相互作用越強(qiáng)、結(jié)合越穩(wěn)定。目前，分子對(duì)接技術(shù)主要用于抗高血壓肽、抗高血糖肽的機(jī)制研究，在抗氧化肽的篩選和機(jī)理研究方面具有極大潛力。因此，為了高效篩選及精準(zhǔn)確定目標(biāo)多肽，在結(jié)構(gòu)鑒定的基礎(chǔ)上，結(jié)合利用分子對(duì)接技術(shù)對(duì)雨生紅球藻多肽與ABTS陽離子自由基的相互作用展開研究[31,35]。

在進(jìn)行分子對(duì)接之前，采用PeptideRanker系統(tǒng)（http://distilldeep.ucd.ie/PeptideRanker/）對(duì)10 條多肽進(jìn)行初步的生物活性預(yù)測(cè)[36]。表3顯示，i-1～i-10的活性預(yù)測(cè)得分均高于50 分，表示這些多肽均有大于50%的概率存在生理活性，達(dá)到初步篩選的標(biāo)準(zhǔn)。然后，設(shè)置ABTS陽離子自由基為配體，通過Autodock軟件模擬多肽和配體間的結(jié)合情況，比較各肽之間的最小結(jié)合自由能（表3）。結(jié)果顯示i-1～i-8與ABTS陽離子自由基的結(jié)合自由能小于0 kcal/mol，表示其能在一般情況下自發(fā)地與配體發(fā)生相互作用，其中i-1與ABTS陽離子自由基的最小結(jié)合能最低，為－5.01 kcal/mol，表示該肽最容易與ABTS陽離子自由基結(jié)合，并發(fā)揮清除作用，意味著i-1的抗氧化能力最強(qiáng)。

表3 雨生紅球藻抗氧化肽的計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)結(jié)果Table 3 In silico prediction of H.pluvialis antioxidant peptides

借助Ligplot和PyMOL工具，觀察i-1與ABTS陽離子自由基在二維與三維空間的具體結(jié)合情況，深入解析多肽發(fā)揮活性的機(jī)理。如圖5所示，i-1的氨基酸殘基Lys-1、Thr-3與ABTS陽離子自由基形成2 個(gè)氫鍵，長(zhǎng)度分別為2.74 ?和3.08 ?；肽鏈上氨基酸殘基Phe-2、Pro-4和Ala-5與配體的苯環(huán)產(chǎn)生3 個(gè)的疏水作用，這2 種作用力對(duì)復(fù)合物的形成和穩(wěn)定十分重要[38]。此外，從對(duì)接結(jié)合的三維圖像圖6可知，多肽i-1中Pro-4的五元環(huán)與ABTS陽離子自由基的苯環(huán)形成類似偏移堆積的結(jié)構(gòu)，這種π-π共軛作用有利于體系的穩(wěn)定，協(xié)助多肽更高效地清除自由基[35,38]。

圖5 KFTPAP與ABTS陽離子自由基之間的二維對(duì)接結(jié)果圖Fig.5 Two-dimensional model of KFTPAP binding with ABTS radical cation

圖6 KFTPAP與ABTS陽離子自由基之間的三維對(duì)接結(jié)果圖Fig.6 Three-dimensional model of KFTPAP binding with ABTS radical cation

上述結(jié)果表明，在10 條多肽中，i-1最有可能具備清除ABTS陽離子自由基的能力，具有最強(qiáng)的抗氧化活性。i-1更易清除自由基的原因，可能不只是高疏水氨基酸含量和低分子質(zhì)量的單獨(dú)作用，還綜合了其他結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的作用，如上述提到的蛋白來源于強(qiáng)抗氧化的葉綠素蛋白，或序列上C端聚集較多疏水性氨基酸等[30-31]。據(jù)報(bào)道，序列中C端的氨基酸性質(zhì)對(duì)活性物質(zhì)的生理活性有較大影響[30]。研究表明，C端聚集較多疏水性氨基酸的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)有助于提高肽鏈的trolox等價(jià)抗氧化能力、氧化自由基吸收能力和超氧陰離子自由基清除能力，從而提高多肽對(duì)機(jī)體的抗氧化能力[39]。例如，金烏賊多肽DVEDLEAGLAK通過增強(qiáng)SOD-3的表達(dá)，改善秀麗線蟲的抗氧化性能，其中原因可能與其序列C端含有大量疏水性氨基酸有關(guān)[40]。通過數(shù)據(jù)庫全面檢索，目前未有文獻(xiàn)報(bào)道過此肽，故最終確定i-1為新型HPp，氨基酸序列為KFTPAP。

2.4 HPp的抗氧化能力測(cè)定

在執(zhí)行分子對(duì)接程序后，為進(jìn)一步驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，通常會(huì)測(cè)定目標(biāo)多肽的功能活性，并結(jié)合對(duì)接情況解釋其作用機(jī)理[13]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用固相合成方法制備HPp KFTPAP，進(jìn)一步利用秀麗隱桿線蟲模型評(píng)價(jià)多肽的抗氧化能力。機(jī)體通過抗氧化酶系統(tǒng)使體內(nèi)具有抗氧化能力，維持體內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)，如果氧化還原穩(wěn)態(tài)被打破，機(jī)體可能會(huì)發(fā)生氧化損傷，MDA等標(biāo)志物的含量會(huì)相應(yīng)增加[41-42]。

抗氧化酶系統(tǒng)包括SOD和CAT等，其酶活是評(píng)價(jià)活性物抗氧化能力的重要指標(biāo)[43]。對(duì)比攝入50、100、200 μmol/L濃度HPp線蟲與未攝入HPp線蟲的體內(nèi)抗氧化酶活力，結(jié)果如圖7、8所示。使用3 個(gè)濃度的HPp處理后，線蟲的SOD、CAT活力均顯示出增強(qiáng)的趨勢(shì)。其中，100 μmol/L HPp處理組的線蟲SOD活力顯著高于對(duì)照組，酶活增加了8.04%（P＜0.05），100 μmol/L和200 μmol/L HPp處理組的線蟲體內(nèi)CAT活力顯著高于對(duì)照組，酶活分別增加了1.56 倍和1.13 倍（P＜0.05）。結(jié)果表明HPp能有效改善秀麗線蟲的抗氧化酶系統(tǒng)，發(fā)揮抗氧化作用。

圖7 HPp濃度對(duì)秀麗線蟲SOD活力的影響Fig.7 Effect of HPp at various concentrations on SOD activity of C.elegans

圖8 HPp濃度對(duì)秀麗線蟲CAT活力的影響Fig.8 Effect of HPp at various concentrations on CAT activity of C.elegans

體內(nèi)自由基含量過多會(huì)引發(fā)脂質(zhì)過氧化，生成大量MDA，從而加劇機(jī)體的氧化損傷[42]。HPp對(duì)線蟲體內(nèi)MDA含量的影響如圖9所示。低、中濃度HPp的攝入能有效降低線蟲的MDA水平。用100 μmol/L HPp培養(yǎng)線蟲后，其體內(nèi)MDA含量顯著下降了38.8%（P＜0.05）。結(jié)果表明HPp能有效降低秀麗線蟲體內(nèi)MDA含量。

圖9 HPp濃度對(duì)秀麗線蟲MDA含量的影響Fig.9 Effect of HPp at various concentrations on MDA content in C.elegans

與Wang Yali等[44]研究的牦牛骨膠原蛋白肽UU1（GASGPMGPR）相比，HPp能更大程度地提高秀麗線蟲的抗氧化性能，包括CAT活力和MDA含量。原因可能是多方面的，除了比UU1分子質(zhì)量小，具有更易被機(jī)體吸收作用的優(yōu)勢(shì)外，HPp的結(jié)構(gòu)中還含有苯丙氨酸，其中的芳香環(huán)和酚羥基可通過電子共振或電子離域，將ROS轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定的苯氧基，從而抑制自由基介導(dǎo)的過氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。此外，芳香環(huán)還能與羥自由基發(fā)生反應(yīng)，增強(qiáng)抗氧化功效[4]。研究發(fā)現(xiàn)，米糠肽KHNRGF和大豆多肽FDPAL在序列上同樣含有苯丙氨酸，這些多肽均有效地改善線蟲的抗氧化性能，包括增強(qiáng)SOD活力、減少ROS含量等，進(jìn)一步驗(yàn)證苯丙氨酸能提高HPp抗氧化能力[45-46]。由此可見，HPp可顯著改善秀麗線蟲體內(nèi)的抗氧化能力，其濃度為100 μmol/L時(shí)效果最佳。

3 結(jié)論

本研究利用分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定和分子對(duì)接技術(shù)，從藻渣酶解物中制備獲得具有較強(qiáng)活性的HPp，并評(píng)價(jià)體內(nèi)抗氧化活性。基于抗氧化活性的全程跟蹤，經(jīng)超濾、制備型和分析型液相色譜三級(jí)分離后，純化多肽組分ABTS陽離子自由基清除能力比蛋白酶解物分別高1.16、1.33 倍和2.96 倍。分析液相組分i具有最強(qiáng)的抗氧化能力，0.25 mg/mL組分i的ABTS陽離子自由基清除率達(dá)（96.97±2.00）%。對(duì)組分i進(jìn)行HPLC-MS/MS鑒定，獲得10 條多肽序列（i-1～i-10），這些多肽的肽鏈長(zhǎng)度均在5～10以內(nèi)，分子質(zhì)量在576.29～736.35 Da范圍內(nèi)，且疏水性氨基酸含量均在60%以上，符合抗氧化肽的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。運(yùn)用分子對(duì)接技術(shù)對(duì)10 條多肽進(jìn)行篩選預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示i-1與ABTS陽離子自由基之間最小結(jié)合能最低，氨基酸殘基跟配體產(chǎn)生2 個(gè)氫鍵、3 個(gè)疏水作用，并在三維空間形成π-π共軛作用。這意味著i-1的抗氧化能力最強(qiáng)，因此確定KFTPAP為HPp的序列。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，HPp能有效提高秀麗線蟲的抗氧化能力，體現(xiàn)在SOD、CAT活力及MDA含量。HPp在100 μmol/L時(shí)抗氧化作用效果最優(yōu)，增強(qiáng)SOD活力8.04%，提高CAT活力1.56 倍，并降低MDA水平38.8%。本團(tuán)隊(duì)推測(cè)HPp的C端聚集疏水性氨基酸、含有苯丙氨酸和來源于葉綠素蛋白，可能是HPp具有較強(qiáng)抗氧化能力的原因。研究結(jié)果可為雨生紅球藻渣的高值化利用提供依據(jù)，并為食源性抗氧化劑的開發(fā)提供思路。