藍(lán)莓果渣多酚-納米硒的制備、表征及抑菌活性

徐雅琴，鐘敬偉，李國強(qiáng)，王欣茹，常松濤，楊 昱，王麗波

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)文理學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

藍(lán)莓（Vacciniumspp.），杜鵑花科、越橘屬藍(lán)果類型植物的俗稱。藍(lán)莓果實(shí)中含有豐富的多酚類生物活性成分，如花青素、黃酮和酚酸等[1-3]。藍(lán)莓多酚成分具有較強(qiáng)的抗氧化、抗炎、保護(hù)心臟和調(diào)節(jié)免疫力等功效[4]。據(jù)報(bào)道，藍(lán)莓鮮果加工后所產(chǎn)生的藍(lán)莓果渣仍中含有大量多酚類物質(zhì)[5]，但目前通常將其丟棄，只有少量用作食品添加劑、薄膜改良劑等[6]，如能合理運(yùn)用果渣中多酚類物質(zhì)，將進(jìn)一步提高藍(lán)莓的利用率。

硒是人體必需的微量元素，可提高人體免疫力、預(yù)防心血管疾病、延緩人的衰老[7-9]。因此，硒的補(bǔ)充對人體至關(guān)重要。近年來，研究發(fā)現(xiàn)納米硒相比于常規(guī)形式硒的吸收利用率高、生物活性高、毒性低，原因可能是納米材料獨(dú)特的高比表面積、小尺寸效應(yīng)[10]。同時(shí)納米硒還具有抑菌和抗癌活性。王娜等利用沒食子酸修飾制備的納米硒顆粒，發(fā)現(xiàn)對金黃色葡萄球菌與大腸桿菌均具有較強(qiáng)的抑菌活性[11]。Wang Yijun等[12]報(bào)道，硒顆粒越小，在體內(nèi)和體外系統(tǒng)中癌細(xì)胞生長抑制效果越好，因納米硒的小尺寸效應(yīng)更容易作用于細(xì)胞表面生物膜和細(xì)胞內(nèi)部。

納米硒的制備常采用化學(xué)方法，其中利用植物多酚制備納米硒具有明顯優(yōu)勢。植物多酚是具有多元酚結(jié)構(gòu)的次生代謝物，具有較強(qiáng)的還原能力，能夠有效的將硒鹽轉(zhuǎn)化為單質(zhì)硒[13]；由于多酚中的官能團(tuán)與納米顆粒之間的作用方式，使納米顆粒分子間存在強(qiáng)烈的靜電斥力，避免納米顆粒產(chǎn)生聚集，可形成穩(wěn)定、分散的球形結(jié)構(gòu)[14]。植物多酚自身有一定的抑菌活性，如Yang Guiyun等[15]發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓多酚對金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞性李斯特菌、鼠傷寒沙門氏菌和大腸桿菌都具有較好的抑菌效果，這對納米硒顆粒的抑菌性起到促進(jìn)作用。

本研究以藍(lán)莓果渣為原料提取多酚，利用多酚為模板制備藍(lán)莓果渣多酚-納米硒。對藍(lán)莓果渣多酚-納米硒進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征并測定其抑菌活性、抑菌機(jī)理，以期為進(jìn)一步利用藍(lán)莓果渣以及制備具有高抑菌活性的納米硒顆粒提供理論基礎(chǔ)和實(shí)踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍(lán)莓果渣購置于尚志市綠野漿果有限公司，分裝后于－20 ℃貯存。藍(lán)莓果渣解凍后，置于60 ℃的恒溫干燥箱中烘干，研磨，過40 目篩，得到藍(lán)莓果渣干粉，真空密封保存。

X-5大孔樹脂 南開大學(xué)化工廠；二甲基亞砜上海阿拉丁生化科技股份有限公司；金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)保藏；枯草芽孢桿菌、副溶血弧菌 北納生物科技有限公司；李斯特菌由吉林大學(xué)保藏；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術(shù)有限公司；堿性磷酸酶測試試劑盒、蛋白定量測試試劑盒 南京建成科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JY92-2D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 新芝生物科技股份有限公司；FDU-1100冷凍干燥機(jī) 東京理化機(jī)械株式會社；Nano ZS90粒度及電位分析儀 英國馬爾文儀器有限公司；FTS135型傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）儀美國Bio-Rad公司；H-7650透射電子顯微鏡（transmission electron microscopy，TEM）日本日立公司；EDX-7000能量色散型X射線熒光光譜儀（energy dispersive X-ray spectroscopy，EDX）、UV-2700雙光束紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；X Pert3 Powder X射線衍射儀（X-ray powder diffraction，XRD）荷蘭帕納科公司；XSP-19C倒置顯微鏡 上海巴拓儀器有限公司；Spark 10M多功能酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司。

1.3 方法

1.3.1 藍(lán)莓果渣多酚的提取與純化

采用超聲輔助硫酸銨/乙醇雙水相法提取藍(lán)莓果渣多酚[16]。具體操作如下：準(zhǔn)確稱取14.0 g硫酸銨溶于30.0 mL去離子水，再加入20.0 mL無水乙醇，攪拌均勻，靜置直至形成澄清透明的兩相。按照料液比1∶80（g/mL）稱取藍(lán)莓果渣干粉于體系中，在超聲功率340 W條件下提取39 min。將粗提液抽濾、離心（3 500 r/min，20 min）除掉殘?jiān)?，?jīng)分液漏斗靜置分層萃取，得到上相多酚提取液。

多酚提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮（50 ℃）后，采用X-5型號大孔樹脂（2.5 cm×55 cm）純化。上樣質(zhì)量濃度1.4 mg/mL、上樣量100 mL、流速0.5 mL/min條件下，進(jìn)行多酚的動態(tài)吸附。待吸附飽和后用去離子水洗脫，再用乙醇溶液（乙醇∶水=7∶3，V/V，pH 6.0）洗脫。收集多酚洗脫液、減壓濃縮、凍干，獲得純化藍(lán)莓果渣多酚（total phenol，TP）。采用福林-酚法測定TP純度[17]。

1.3.2 納米硒和藍(lán)莓果渣多酚-納米硒的制備

納米硒的合成：向Na2SeO3溶液（10 mmol/L）加入等體積的VC溶液（2.0 mg/mL），將其置于磁力攪拌器上，充分混勻，添加1.0 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為8.5，在超聲功率為500 W下，冰浴反應(yīng)10 min。靜置24 h后，去離子水透析72 h，50 ℃濃縮，凍干，獲得納米硒（selenium nanoparticles，SeNPs）樣品。

藍(lán)莓果渣多酚納米硒的制備：準(zhǔn)確移取0.2 mL TP溶液（2.0 mg/mL）于燒杯中，將其置于磁力攪拌器上攪拌，緩慢滴加2.0 mL 25 mmol/L的Na2SeO3溶液，攪拌3 min，使其混合均勻，繼續(xù)加入2.0 mL 50 mmol/L的VC溶液，用去離子水補(bǔ)至20.0 mL，混合液置于超聲波細(xì)胞破碎儀中，在冰浴、超聲功率500 W下制備10 min。制備液于室溫放置24 h后，使用去離子水透析36 h，濃縮，凍干，得到多酚-納米硒（TP-SeNPs）樣品。

1.3.3 TP-SeNPs的結(jié)構(gòu)表征

1.3.3.1 FTIR分析

分別將樣品（TP、SeNPs與BP-SeNPs）與KBr顆粒于研缽中研磨，然后轉(zhuǎn)移到模具中20 MPa壓力下壓片約0.5 min。在4 000～400 cm－1范圍內(nèi)進(jìn)行FTIR掃描。

1.3.3.2 粒徑和Zeta電位

將SeNPs和TP-SeNPs配制成0.25 mg/mL的溶液，過0.45 μm水系膜后，采用Nano ZS90粒度及電位分析儀測定粒子直徑和Zeta電位、多分散性指數(shù)（polydispersity index，PDI）。

1.3.3.3 TEM形貌觀察

將SeNPs和TP-SeNPs加去離子水適當(dāng)稀釋并超聲，取少量滴在涂有碳膜的銅柵上，鋪展在室溫下干燥，在100 kV的加速電壓下通過透射電子顯微鏡比較其形貌，大小和均勻性。

1.3.3.4 EDX分析

取適量的TP-SeNPs樣品粘在樣品臺上，利用濺射的方法在真空下鍍一層100 nm左右的金膜，通過EDX能譜確定TP-SeNPs體系的表面元素組成和分布。

1.3.3.5 XRD分析

參考Ye Xiguang等[18]的方法，使用XRD儀對TP、SeNPs、TP-SeNPs進(jìn)行物相分析，以確定納米硒體系的確切晶型。儀器參數(shù)條件為電壓40 kV，電流40 mA，入射束角度掃描范圍5°～90°。

1.3.4 TP-SeNPs抑菌活性測定1.3.4.1 菌懸液制備

在無菌操作臺中，將－80 ℃儲存的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、李斯特菌、枯草芽孢桿菌與副溶血弧菌菌種保藏液解凍后，分別接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)箱中37 ℃（副溶血弧菌30 ℃培養(yǎng)）培養(yǎng)至對數(shù)期，進(jìn)行傳代，將第2代菌濃度稀釋至106CFU/mL，得到菌懸液。

1.3.4.2 最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的測定

采用二倍稀釋法在96 孔微板上測定細(xì)菌的MIC[19]。將100 μL 25 mg/mL的TP-SeNPs樣品溶液與100 μL各供試菌懸液混合，通過倍比稀釋獲得質(zhì)量濃度為12.50、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.20、0.10 mg/mL的混合液。同時(shí)設(shè)置不含TP-SeNPs樣品溶液的陰性對照組與菌懸液陽性對照組?；旌弦河?7 ℃（副溶血弧菌30 ℃培養(yǎng)）振蕩培養(yǎng)箱中孵育24 h（李斯特菌培養(yǎng)48 h）后，順次依序觀察到第1個(gè)混合液體呈澄清透明的樣品質(zhì)量濃度即為MIC。同時(shí)，通過酶標(biāo)儀測定培養(yǎng)0 h與24 h（或48 h）時(shí)混合液OD600nm的變化輔助判別MIC值。

1.3.4.3 TP-SeNPs對李斯特菌生長速率的影響

根據(jù)Zhao Meimei等[20]報(bào)道的方法測定。在無菌環(huán)境下，取5.0 mL濃度為106CFU/mL的李斯特菌懸液于無菌試管中，隨后加入2.0 mg/mL TP-SeNPs樣品混合均勻，使樣品的終質(zhì)量濃度依次為1/4 MIC、1/2 MIC、1 MIC、2 MIC、4 MIC，并以5%二甲亞砜溶液代替樣品作為空白對照組。混合液置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隨機(jī)在0～48 h不同時(shí)間段取樣，測定實(shí)驗(yàn)組與對照組的OD600nm，繪制時(shí)間-抑菌曲線。

1.3.4.4 TP-SeNPs對李斯特菌生物被膜的影響

按照1.3.4.2節(jié)中方法，將得到的不同倍數(shù)MIC李斯特菌混合液在37 ℃溫箱中分別培養(yǎng)6、12、24、48 h。用滅菌磷酸鹽緩沖溶液漂洗3 次后吸干，甲醇固定，1%結(jié)晶紫染色，再用滅菌磷酸鹽緩沖溶液漂洗4 次，待干燥后，通過顯微鏡觀察細(xì)菌生物被膜的生長情況。

1.3.4.5 生物被膜抑制率測定

將不同倍數(shù)MIC李斯特菌混合液置于37 ℃溫箱孵育48 h。棄去孔板內(nèi)培養(yǎng)液，用無菌磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗1～3 次，隨后向孔中加入100 μL 0.1%結(jié)晶紫溶液，并孵育30 min。丟棄結(jié)晶紫溶液，再次用無菌PBS洗滌平板。殘留底物用200 μL 33%的乙酸溶液溶解，室溫靜置20 min，用酶標(biāo)儀測定OD570nm。生物被膜抑制率按照下式進(jìn)行計(jì)算：

式中：OD0為空白對照組的光密度；OD1為試樣組的光密度。

1.3.4.6 生物被膜活性細(xì)胞檢測

將不同倍數(shù)MIC李斯特菌混合液混合液置于37 ℃溫箱孵育48 h。棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，用無菌PBS沖洗1～3 次，然后在孔中加入100 μL四唑藍(lán)溶液，孵育4 h后，吸出上清液，用二甲基亞砜（100 μL）終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀測定OD570nm。生物被膜細(xì)胞活力按照下式計(jì)算：

式中：OD0為空白對照組的光密度；OD1為試樣組的光密度。

1.3.4.7 TP-SeNPs對李斯特菌細(xì)胞膜通透性的影響

將不同倍數(shù)MIC李斯特菌混合液在37 ℃溫箱中分別培養(yǎng)0、10、14、18、22 h，混合樣品8 000 r/min離心10 min收集上清液，按照總蛋白含量測定試劑盒說明書中測定步驟測定上清液中蛋白質(zhì)含量，并通過260 nm波長處OD值測定核酸含量。

1.3.4.8 TP-SeNPs對李斯特菌細(xì)胞壁通透性的影響

通過測定堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）的泄漏情況確定TP-SeNPs對李斯特菌細(xì)胞壁的影響。按照1.3.4.6節(jié)所述制備上清液，采用AKP試劑盒測定上清液中AKP活性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 TP與TP-SeNPs的制備

超聲輔助硫酸銨/乙醇雙水相法制得T P 純度為（21.10±0.75）%，經(jīng)X-5大孔樹脂純化后，TP純度達(dá)到（77.52±0.38）%，無多糖、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。TP凍干樣品為紅褐色固體，如圖1A所示。TP用去離子水溶解后，添加到硒鹽中并加入VC，混合液的顏色從深紫色變?yōu)槌燃t色。溶液顏色變化表明了硒鹽被還原后形成TP-SeNPs顆粒[21]，凍干樣品為黑色固體，如圖1B所示。SeNPs為紅棕色固體，如圖1C所示。

“金魚和人一樣，都是生命，不能剝奪它們看到真相世界的權(quán)利?！币缓己薏坏藐惽芭_立刻走人，便說：“萬物皆有靈，眾生且平等。人不喜歡一個(gè)環(huán)境，還可以離開，金魚就只能被動地接受人類強(qiáng)加給它們的環(huán)境。我看這樣吧，你去買一只方形魚缸回來，咱們直接把它換了。”

圖1 TP（A）、TP-SeNPs（B）和SeNPs（C）產(chǎn)品外觀Fig.1 Visual appearance of TP (A),TP-SeNPs (B) and SeNPs (C)

2.2 TP-SeNPs結(jié)構(gòu)表征

2.2.1 紅外光譜

如圖2A所示，SeNPs在官能團(tuán)區(qū)幾乎沒有吸收峰。而TP與TP-SeNPs表現(xiàn)出相似的特征吸收，不同的是，TP樣品在1 338.60 cm－1處有對應(yīng)酚羥基的變形振動峰[22]。與TP相比，TP-SeNPs中酚羥基的變形振動峰減弱。此外，TP在3 377.36 cm－1處有一個(gè)O—H伸縮振動峰[23]，該吸收峰與硒鹽相互作用時(shí)發(fā)生紅移至3 211.48 cm－1，峰強(qiáng)度明顯降低且變的更寬，說明TP的O—H基團(tuán)和納米硒的硒原子之間有著類似氫鍵的相互作用（O—H…Se），因此可以推測TP參與了還原過程[24]。

圖2 TP-SeNPs的紅外光譜（A）、粒徑分布（B）和電位（C）Fig.2 FTIR spectrum (A),particle size distribution (B) and potential (C) of TP-SeNPs

由圖2B可知，SeNPs經(jīng)TP分散后，平均粒徑從（486.95±18.55）nm降低至（101.15±3.01）nm，PDI從0.444降低至0.334，PDI越低，顆粒聚集性越小。經(jīng)TP分散后，納米硒粒徑變小，TP-SeNPs體系已屬于納米級別（≈100 nm），均一性增強(qiáng)且分散度降低。

Zeta電位的大小被用來預(yù)測膠體溶液中納米顆粒的穩(wěn)定性。由圖2C可知，TP-SeNPs帶負(fù)電，表明硒納米粒子相互排斥，具有非聚集傾向。TP-SeNPs電位為（－29.8±1.16）mV，比SeNPs高3.19 倍，表明經(jīng)多酚分散的納米硒穩(wěn)定性更好，綠色合成的納米粒子在膠體溶液中一定程度上穩(wěn)定。相比Lai Haoqiang等[25]以茶多酚作為分散劑獲得的納米硒粒子粒徑為200 nm、電位為－10 mV，藍(lán)莓果渣TP-SeNPs粒徑更小，穩(wěn)定性更高。

2.2.2 TEM光譜

由圖3A、B可知，未加藍(lán)莓果渣多酚制備的納米硒為球狀，但團(tuán)聚在一起，呈簇狀分布，導(dǎo)致其穩(wěn)定性較差，易聚集沉底，喪失生物活性。TP-SeNPs顆粒聚集現(xiàn)象顯著改善，納米硒顆粒以近似球狀的形態(tài)獨(dú)立分布在視野中，且大小均勻，分散性良好。這與粒徑測定結(jié)果一致，即TP-SeNPs體系中納米硒的粒徑（101.15±3.01）nm遠(yuǎn)小于SeNPs（486.95±18.55）nm。由此可證明，TP-SeNPs是一個(gè)相對穩(wěn)定的體系。據(jù)報(bào)道，采用茶多酚[25]與鞣酸[26]作分散劑也得到了類似的納米硒顆粒。

圖3 TP-SeNPs結(jié)構(gòu)表征Fig.3 Structural characterization of TP-SeNPs

2.2.3 EDX光譜

由圖3 C 可知，給定樣品中原子百分比分別為12.50% Se、67.45% C和20.05% O組成，無其他元素的干擾信號，說明體系純度較高。元素Se在1.39、11.23、12.47 keV處有明顯的信號吸收峰，其中主吸收峰位于1.39 keV，證實(shí)了硒鹽經(jīng)還原變?yōu)閱钨|(zhì)形態(tài)，這與Sharma等[27]報(bào)道一致。

由圖3D可知，TP在11°與25°的2θ處存在兩個(gè)寬峰，沒有尖銳和狹窄的衍射峰，說明TP為無定形結(jié)構(gòu)。SeNPs在約24°與30°的2θ處出現(xiàn)明顯的衍射峰，與文獻(xiàn)中報(bào)道的一致，分別對應(yīng)于晶體硒100和101的晶格面[26]。對比SeNPs的XRD衍射峰，TP-SeNPs在24°的衍射峰明顯減弱、30°的衍射峰消失。同時(shí)對應(yīng)110、102、111、201晶面的41°、43°、45°、52°，2θ衍射峰均不明顯，表明TP-SeNP顆粒是非晶型結(jié)構(gòu)[28]。

2.3 TP-SeNPs的抑菌活性

2.3.1 MIC

由表1可知，TP-SeNPs、TP和SeNPs均有一定抑菌作用。其中SeNPs主要對3 種革蘭氏陽性菌有較好的抑制效果，TP對革蘭氏陰性菌和陽性菌都有抑制作用。TP-SeNPs對革蘭氏陽性菌的抑制效果優(yōu)于革蘭氏陰性菌，可能的原因是革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞壁含有較多肽聚糖，不含有脂多糖，其表面凈負(fù)電荷比革蘭氏陰性菌少，因此對細(xì)胞的保護(hù)作用較差，樣品容易在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染，抑制核酸合成，干擾能量系統(tǒng)[29]。同時(shí)，TP-SeNPs中的酚羥基也會與細(xì)胞蛋白中的氨基或羧基相互作用，抑制細(xì)菌的生長[30]。在3 種革蘭氏陽性菌中，TP-SeNPs對李斯特菌的抑制能力最強(qiáng)，MIC為0.06 mg/mL，因此選擇李斯特菌進(jìn)行后續(xù)抑菌活性的測定。

表1 TP-SeNPs對不同細(xì)菌的MIC值Table 1 MIC of TP-SeNPs against different bacteria mg/mL

2.3.2 TP-SeNPs對李斯特菌的抑制作用

圖4A為TP-SeNPs體系對李斯特菌的時(shí)間-殺滅曲線。空白對照組的李斯特菌在0～48 h內(nèi)生長狀況良好，符合典型的生長規(guī)律。添加TP-SeNPs后，李斯特菌的生長和繁殖都受到了不同程度的抑制。隨著TP-SeNPs質(zhì)量濃度的增加，細(xì)菌增長變緩慢。當(dāng)TP-SeNPs添加量小于MIC時(shí)，李斯特菌的生長仍舊呈現(xiàn)典型生長趨勢，但生長對數(shù)期的開始時(shí)間延后，且時(shí)間縮短。當(dāng)添加量達(dá)到2 MIC以上時(shí)，細(xì)菌幾乎沒有增殖跡象。這些結(jié)果說明低質(zhì)量濃度的TP-SeNPs可延緩李斯特菌的生長，高質(zhì)量濃度TPSeNPs可完全抑制李斯特菌的生長，且與對李斯特菌的抑制作用呈正相關(guān)。

圖4 TP-SeNPs對李斯特菌的時(shí)間殺滅曲線（A）和生物被膜（B）的影響Fig.4 Effect of TP-SeNPs on the time killing curve (A) and biofilm formation (B) of L.monocytogene

2.3.3 細(xì)菌生物被膜抑制率和活性細(xì)胞檢測

如圖4B所示，在所有測試濃度（1/4～4 MIC）范圍內(nèi)，TP-SeNPs呈現(xiàn)質(zhì)量濃度依賴的方式抑制李斯特菌生物被膜的形成（P＜0.05）。當(dāng)加入TP-SeNPs質(zhì)量濃度為1/4 MIC時(shí)，對生物被膜形成的抑制率為（25.10±2.01）%，而當(dāng)其質(zhì)量濃度增加至4 MIC時(shí)，抑制率達(dá)到（86.76±0.40）%，提高了約2.5 倍。

在活細(xì)胞中，線粒體琥鉑酸脫氫酶可以將MTT還原為深紫色結(jié)晶狀物質(zhì)，而死細(xì)胞不可以，因此可以通過MTT比色法反映活細(xì)胞的數(shù)量與代謝活力。由圖4B可知，隨著TP-SeNPs質(zhì)量濃度的增加，李斯特菌生物膜細(xì)胞活力顯著下降（P＜0.05）。加入TP-SeNPs質(zhì)量濃度為4 MIC（0.24 mg/mL）時(shí)，生物膜細(xì)胞活力僅（30.78±0.87）%，抑制率為69.22%。已有報(bào)道，由藍(lán)莓提取物（6.25 mg/mL）處理單核細(xì)胞性李斯特菌的生物被膜72 h后，生物被膜的細(xì)胞活力抑制率為64.4%[31]。比較可知，TP-SeNPs的抑菌效果優(yōu)于藍(lán)莓提取物。

2.3.4 TP-SeNPs對李斯特菌生物被膜的影響

細(xì)菌群落和自身分泌的胞外聚合物質(zhì)組成的生物膜[32-33]，容易使食品變質(zhì)，給食品安全造成潛在的隱患。生物膜對消毒劑、低溫等不利條件耐受性強(qiáng)。例如李斯特菌可通過嵌入胞外聚合物基質(zhì)而增強(qiáng)對抗菌和消毒劑處理的耐藥性。因此，抑制生物被膜的形成可以有效降低李斯特菌的危害。

如圖5所示，李斯特菌在6 h時(shí)，生物被膜形成較少，隨著時(shí)間的延長，微菌落逐漸擴(kuò)大，連接成網(wǎng)狀，接著生物被膜成熟，網(wǎng)狀間隙變密，形成多層狀結(jié)構(gòu)，到48 h時(shí)，生物被膜進(jìn)一步變得密致，形成復(fù)雜的團(tuán)狀結(jié)構(gòu)，這與曹啟航等[33]結(jié)果一致。但隨著TP-SeNPs質(zhì)量濃度依次增加，生物被膜的形成呈現(xiàn)劑量依賴性下降。當(dāng)TP-SeNPs質(zhì)量濃度為1/2 MIC時(shí)，仍有生物被膜的形成，但與空白對照相比，生物被膜的緊密程度明顯降低，多層狀結(jié)構(gòu)不明顯；當(dāng)TP-SeNPs質(zhì)量濃度為4 MIC時(shí)，培養(yǎng)6 h后有少量細(xì)菌黏附于載玻片，12 h后黏附細(xì)菌數(shù)量增多，出現(xiàn)較大的微菌落，24 h后微菌落向四周擴(kuò)散，48 h菌落連成細(xì)微的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，但并未形成致密的生物被膜。以上結(jié)果表明，TP-SeNPs對李斯特菌生物被膜的形成具有抑制作用。

圖5 TP-SeNPs對李斯特菌生物被膜形成的影響Fig.5 Effect of TP-SeNPs on the biofilm formation of L.monocytogene

2.3.5 TP-SeNPs對李斯特菌細(xì)胞膜通透性的影響

細(xì)胞膜完整性是細(xì)菌抵擋外界抑菌物質(zhì)的關(guān)鍵因素，細(xì)胞中包含核酸、蛋白質(zhì)、酶、Na＋、K＋等物質(zhì)。其中，核酸和蛋白質(zhì)對于維持菌體正常的生理代謝具有重要的意義，因此可以通過蛋白質(zhì)與核酸的泄漏情況判斷細(xì)菌細(xì)胞膜是否破損。由圖6A、B可知，TP-SeNPs與李斯特菌作用后，隨著孵育時(shí)間的延長，與對照組相比菌液核酸釋放量急劇增加，且蛋白質(zhì)泄漏量也平緩上升。TP-SeNPs質(zhì)量濃度越大，泄漏情況越嚴(yán)重。由此表明TP-SeNPs破壞了李斯特菌細(xì)胞膜的通透性與完整性，使其內(nèi)容物流出，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)菌死亡。

圖6 TP-SeNPs對李斯特菌核酸（A）、蛋白質(zhì)（B）、AKP（C）泄漏的影響Fig.6 Leakage of DNA (A),protein (B) and AKP (C) from L.monocytogene treated with TP-SeNPs

2.3.6 TP-SeNPs對李斯特菌細(xì)胞壁通透性的影響

細(xì)胞壁作為細(xì)胞外部的剛性結(jié)構(gòu)，具有支持細(xì)胞形狀，承受壓力并保護(hù)細(xì)胞免受異物入侵的能力。而AKP屬于細(xì)胞膜和細(xì)胞壁之間的一組同工酶，當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)受到損傷時(shí)，則AKP會發(fā)生泄漏，故通過測定菌液上清液中AKP活力變化可以判斷細(xì)胞壁的通透性指標(biāo)。如圖6C所示，對照組中AKP活力始終在同一水平波動，實(shí)驗(yàn)組上清液中AKP活力在一定范圍內(nèi)以時(shí)間和劑量依賴性方式顯著增加（P＜0.05）。李斯特菌與4 MIC的TPSeNPs孵育22 h后，上清液中AKP活力達(dá)到了對照組的1.6 倍，綜上可知，TP-SeNPs提高了李斯特菌的細(xì)胞壁通透性是產(chǎn)生抑菌作用的原因之一。

3 結(jié)論

以藍(lán)莓果渣為原料，制得純度為（77.52±0.38）%的藍(lán)莓果渣多酚，以多酚為分散劑制備了TP-SeNPs。該方法具有環(huán)保、低成本、方法簡單等特點(diǎn)。TP-SeNPs相比納米硒更穩(wěn)定、粒徑更小、為近球形無定形固體。此外TP-SeNPs對李斯特菌有較強(qiáng)的抑菌活性，優(yōu)于TP和SeNPs的抑菌效果。TP-SeNPs抑菌機(jī)理初步測定表明：TP-SeNPs有效抑制李斯特菌生物被膜，破壞了李斯特菌細(xì)胞壁與細(xì)胞膜的通透性與完整性，造成細(xì)胞內(nèi)容物泄漏，生理活動受阻，進(jìn)而誘導(dǎo)李斯特菌死亡。本研究為藍(lán)莓果渣在食品和醫(yī)藥行業(yè)的可能應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。