利用蔗糖產(chǎn)尿苷二磷酸葡萄糖的大腸桿菌構(gòu)建

姚睿,趙麗婷,陳磊,李由然,顧正華,石貴陽(yáng),丁重陽(yáng)*

1(江南大學(xué),糧食發(fā)酵與食品生物制造國(guó)家工程研究中心,江蘇 無(wú)錫,214122) 2(江南大學(xué),糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 無(wú)錫,214122) 3(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無(wú)錫,214122)

尿苷二磷酸葡萄糖(uridine diphosphate glucose,UDP-glucose)是由葡萄糖的半縮醛羥基與尿苷二磷酸的末端磷酸基之間脫水縮合形成的化合物,它不僅是細(xì)胞壁合成的前體物質(zhì),也是尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(uridine diphosphate glucuronic acid,UDP-GlcA)、尿苷二磷酸半乳糖(uridine diphosphate galactose,UDP-Gal)等糖供體的重要前體物質(zhì)[1-3]。這些核苷酸糖為寡糖、多糖、糖苷等生物活性大分子[4-6]的合成提供多種糖供體,實(shí)現(xiàn)了其結(jié)構(gòu)的多樣化。UDP-葡萄糖作為其他UDP糖合成的起點(diǎn),其可用性是高速率合成其他任何相關(guān)低聚糖的先決條件[7-9]。但是UDP-葡萄糖價(jià)格昂貴且不易獲得,因此如何高效獲得UDP-葡萄糖成為當(dāng)下必須解決的問題。

近年來(lái),隨著研究者對(duì)UDP-葡萄糖研究的不斷深入,多級(jí)酶聯(lián)催化反應(yīng)策略已被廣泛用于UDP-糖基供體的循環(huán)再生。UDP-糖基供體依賴的糖基轉(zhuǎn)移酶(glycosyltransferase,UGTs)與蔗糖合酶(sucrose synthase, SuSy,EC 2.4.1.13)的偶聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行UDP-葡萄糖的循環(huán)供應(yīng)是近年來(lái)研究最為廣泛的UDP-葡萄糖循環(huán)再生體系,它可催化蔗糖和UDP可逆地轉(zhuǎn)化為果糖和UDP-葡萄糖,實(shí)現(xiàn)UDP-葡萄糖的一步合成[10]。酶法合成體系雖然能夠以廉價(jià)的底物合成UDP-葡萄糖,但該催化體系不穩(wěn)定、操作復(fù)雜,往往需要添加輔因子。

隨著合成生物學(xué)的不斷發(fā)展,代謝工程逐漸成為一種更為簡(jiǎn)便和標(biāo)準(zhǔn)化的手段。目前大多數(shù)的研究主要集中在以UDP-葡萄糖等核苷酸糖為原料高效合成透明質(zhì)酸、肝素、柚皮素等[11-13]大分子代謝網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建,并未對(duì)UDP-葡萄糖從頭合成這一關(guān)鍵環(huán)節(jié)的代謝網(wǎng)絡(luò)展開深入研究。UDP-葡萄糖作為重要的中間代謝產(chǎn)物,可被快速用于合成含糖基化合物以維持細(xì)胞能量,與細(xì)胞生長(zhǎng)息息相關(guān),這為其檢測(cè)帶來(lái)難度。此外,蔗糖合酶的催化底物蔗糖作為豐富的雙糖,可使得細(xì)胞工廠的構(gòu)建更加經(jīng)濟(jì)和環(huán)保,然而目前大多數(shù)工業(yè)大腸桿菌(Escherichiacoli)不能利用蔗糖[14-16],構(gòu)建直接利用蔗糖的大腸桿菌細(xì)胞工廠,其在蔗糖環(huán)境下能否維持滲透壓平衡,實(shí)現(xiàn)細(xì)胞正常生長(zhǎng)也是一個(gè)難題。

本研究選用遺傳背景清晰的E.coliBL21(DE3)為出發(fā)菌株,通過(guò)引入來(lái)自E.coliATCC 13281中非磷酸烯醇式丙酮酸依賴性磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(not phosphoenolpyruvate-phosphotransferase system,非PEP-PTS系統(tǒng))[17-19]中的蔗糖通透酶(sucrose permease, CscB)、果糖激酶(fructokinase, CscK)和來(lái)自多型亞硝化螺菌(Nitrosospiramultiformis)的蔗糖合酶(sucrose synthase, SuSy)(圖1),以期實(shí)現(xiàn)體內(nèi)的蔗糖到UDP-葡萄糖一步合成,水解產(chǎn)物果糖可以同時(shí)被消耗用于細(xì)胞生長(zhǎng)。構(gòu)建具有有效利用蔗糖能力的工業(yè)菌株將促進(jìn)蔗糖作為碳源的使用,有助于石油化工經(jīng)濟(jì)向生物經(jīng)濟(jì)的過(guò)渡,為今后利用UDP-葡萄糖生產(chǎn)多種具有不同糖苷鍵型的葡萄糖基化生物分子提供通用性底盤微生物菌株,也為后續(xù)利用UDP-葡萄糖合成相關(guān)大分子物質(zhì)的代謝網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建提供了關(guān)鍵的一環(huán)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

本研究所使用的菌株和質(zhì)粒見表1。

表1 本研究所使用的菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

蛋白質(zhì)和酵母粉,Oxoid公司;Na2HPO4、KH2PO4、NH4Cl、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、維生素B1、FeCl3·6H2O、CoCl2·2H2O、H3BO3、MnCl2·4H2O、EDTA·2 Na·2H2O、NaCl,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

UDP-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品,上海源葉生物科技有限公司;卡那霉素、氯霉素、氨芐青霉素、鹽酸大觀霉素,Thermo Fisher Scientific公司;異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)、蔗糖、質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒,上海生物工程股份有限公司;引物合成及測(cè)序,金維智生物科技有限公司;限制性內(nèi)切酶、phantaDNA聚合酶,TaKara公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10,酵母粉5,NaCl 10,將pH值調(diào)整至7.0。LB固體培養(yǎng)基另加入1.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的瓊脂粉。

改良的M9蔗糖培養(yǎng)基(g/L):蔗糖20,NaCl 0.5,Na2HPO46.78,KH2PO43,NH4Cl 0.5,MgSO4·7H2O 0.24,CaCl2·2H2O 0.04,維生素B10.001,天冬氨酸2和微量元素1%(體積分?jǐn)?shù)),將pH值調(diào)整到7.4。其中蔗糖單獨(dú)滅菌后再加入M9培養(yǎng)基。

微量元素液(g/L):FeCl3·6H2O 0.83、CoCl2·2H2O 0.01、H3BO30.01、MnCl2·4H2O 0.016、EDTA·2Na·2H2O 6.37。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

本研究使用的引物如表2所示。選用來(lái)自大腸桿菌E.coliATCC 13281中的cscB、cscK基因和來(lái)自N.multiformis的susy基因構(gòu)建蔗糖利用模塊。根據(jù)NCBI公布的各基因及載體序列設(shè)計(jì)PCR引物(表2)。通過(guò)同源重組構(gòu)建質(zhì)粒pACYC-KBS、pET-KBS、pET28a-KBS、SBK-Pcsc-T。基于天然啟動(dòng)子Pcsc構(gòu)建,選擇啟動(dòng)子PT7、PrrnD、Ptac,分別以Pn-F/Pn-R(n為相應(yīng)啟動(dòng)子)為引物擴(kuò)增得到啟動(dòng)子PT7、PrrnD、Ptac,通過(guò)同源重組連接到經(jīng)過(guò)NheI酶切的載體SBK-Pcsc-T上,得到重組質(zhì)粒SBK-PT7-Pcsc-T、SBK-Ptac-Pcsc-T、SBK-PrrnD-Pcsc-T。

表2 質(zhì)粒構(gòu)建相關(guān)引物Table 2 Primers used for plasmid construction

1.2.2 重組菌株在蔗糖-M9培養(yǎng)基中生長(zhǎng)特性的測(cè)定

蔗糖合酶SuSy在作用的過(guò)程中需要UDP的參與,而天冬氨酸是UDP合成的前體物質(zhì)(圖2),在M9蔗糖培養(yǎng)基中補(bǔ)加適量的天冬氨酸替代直接補(bǔ)加UDP得到改良的M9培養(yǎng)基用于發(fā)酵。通過(guò)改良的M9蔗糖固體平板對(duì)重組菌株利用蔗糖的能力進(jìn)行初步篩選,將平板中生長(zhǎng)情況良好的菌株接種到24孔板中,以高通量的形式進(jìn)行二次篩選。選取性狀優(yōu)良的菌株,在50 mL改良的M9蔗糖培養(yǎng)基中,0 h 時(shí)加入0.1 mmol/L IPTG,30 ℃、200 r/min培養(yǎng),定時(shí)檢測(cè)發(fā)酵液OD600nm值監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)。

圖2 尿嘧啶核苷二磷酸合成途徑Fig.2 Synthesis of uracil nucleoside diphosphate

1.2.3 CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)

基于CRISPR-Cas9系統(tǒng)[20]利用pCas和pTargetF質(zhì)粒對(duì)大腸桿菌的基因組進(jìn)行編輯。以arsB位點(diǎn)的編輯為例,提取E.coliBL21 (DE3)的基因組DNA,以arsB-A1-F/R、arsB-A2-F/R為引物,擴(kuò)增得到上下游片段,以質(zhì)粒SBK-PT7-Pcsc-T為模板,SBK-F/R為引物,擴(kuò)增得到表達(dá)盒,同源重組得到打靶片段SBK-arsB。通過(guò)可以靶向arsB的質(zhì)粒pTar-arsB定向編輯獲得重組菌株EP02。重組菌株EP03也以此方法構(gòu)建。

1.2.4 蔗糖含量的測(cè)定

離心收集上清液并用0.22 μm濾膜過(guò)濾,通過(guò)HPLC測(cè)定培養(yǎng)基中殘留的蔗糖含量。HPLC檢測(cè)條件如下:流動(dòng)相為0.05%的硫酸溶液,流速為0.8 mL/min,示差檢測(cè)器,液相色譜柱為Dikma CarboPac H+(300 mm×8.0 mm,6 μm),柱溫50 ℃,進(jìn)樣量10 μL。

1.2.5 UDP-葡萄糖的生產(chǎn)、提取與分析

離心收集細(xì)胞,通過(guò)V(乙腈)∶V(甲醇)∶V(水)=2∶2∶1的比例從細(xì)胞中提取UDP-葡萄糖。采用由Agilent 1100系列LC系統(tǒng)和AB Sciex API-4000 MS組成的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)分析代謝物。

樣品在Waters XBridge C-18色譜柱上分離,流速為0.4 mL/min,B為純乙腈溶液,采用以下梯度:0～0.5 min,50% B;0.5～1 min, B線性上升至90%;1～1.25 min,90% B;1.25～1.5 min,B線性下降至50%;1.5～2 min,50% B,采用多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring,MRM)模式獲得質(zhì)譜。用購(gòu)買的UDP-葡萄糖(純度>98%)建立校正曲線[21-22]。

1.2.6 熒光定量PCR方法

使用含有目的片段的單拷貝克隆質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品,測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品濃度,并對(duì)其進(jìn)行10倍稀釋,設(shè)置7個(gè)梯度,以不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品作為模板進(jìn)行RT-PCR。反應(yīng)體系:上下游引物各1 μL,SYBR Green Master Mix 25 μL,模板DNA 1 μL,dd H2O 22 μL。以標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)作為橫坐標(biāo),測(cè)得的Ct值作為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 蔗糖通透酶基因、果糖激酶基因和蔗糖合酶基因的克隆及表達(dá)

本研究將合成得到目的基因cscB、cscK和susy克隆到質(zhì)粒pET28a的EcoR I、NheI兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間,基因大小分別為1 248、915、1 385 bp,測(cè)序結(jié)果與GenBank報(bào)道的基因序列完全一致,表明重組質(zhì)粒pET28a-cscB、pET28a-cscK、pET28a-susy構(gòu)建成功。

通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳驗(yàn)證重組菌株中酶的表達(dá)情況,酶CscB(蛋白ID:ABG82031.1)、CscK(蛋白:ID ABG82030.1)和SuSy(蛋白ID:WP_011381564.1)蛋白分子質(zhì)量分別為45.8、33.6、87.5 kDa。在誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)菌株ESBK01生長(zhǎng)情況較差,其余菌株生長(zhǎng)情況良好(圖3-A、圖3-B),推測(cè)過(guò)表達(dá)蔗糖通透酶CscB可能會(huì)對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響。以天然啟動(dòng)子Pcsc低表達(dá)CscB[23],結(jié)果顯示該酶可以正常表達(dá)(圖3-C),因此在構(gòu)建UDP-葡萄糖合成途徑時(shí)應(yīng)適當(dāng)下調(diào)cscB基因的轉(zhuǎn)錄水平。上述結(jié)果表明基因cscB、cscK、susy在E.coliBL21(DE3)中成功表達(dá)。

A-搖瓶生長(zhǎng)對(duì)比圖;B-重組酶的SDS-PAGE電泳圖(M-標(biāo)準(zhǔn)蛋白 Marker;1-空載破碎液;2-ESBK01粗酶液;3-ESBK02粗酶液; 4-ESBK03粗酶液);C-Pcsc下基因cscB的誘導(dǎo)表達(dá) (M-標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker;1-空載破碎液;2-基因cscB粗酶液)圖3 cscB、cscK、susy基因的克隆及表達(dá)Fig.3 Cloning and SDS-PAGE results of cscB, cscK, and susy genes

2.2 蔗糖利用和UDP-葡萄糖生產(chǎn)模塊的構(gòu)建

2.2.1 轉(zhuǎn)錄水平的質(zhì)粒拷貝數(shù)調(diào)節(jié)

攜帶不同表達(dá)框的重組質(zhì)粒構(gòu)建如圖4所示,將利用蔗糖產(chǎn)UDP-葡萄糖途徑中涉及到的基因構(gòu)建到不同拷貝數(shù)的質(zhì)粒上(包括質(zhì)粒pACYCDuet-1、pETDuet-1以及pET28a)從而調(diào)控基因劑量,以篩選出能夠?qū)崿F(xiàn)該途徑的重組菌株。為了下調(diào)基因cscB的轉(zhuǎn)錄水平,按照?qǐng)D4所示構(gòu)建重組質(zhì)粒。通過(guò)菌落PCR進(jìn)行驗(yàn)證,PCR片段與對(duì)應(yīng)表達(dá)元件大小相近,重組菌株ESBK05、ESBK06和ESBK07構(gòu)建成功。

A-ESBK05;B-ESBK06;C-ESBK07圖4 重組菌株ESBK05、ESBK06、ESBK07的構(gòu)建Fig.4 Construction of the recombinant strains ESBK05, ESBK06, and ESBK07

為了驗(yàn)證不同拷貝數(shù)的質(zhì)粒對(duì)蔗糖利用和UDP-葡萄糖合成的影響,將構(gòu)建好的菌株ESBK05、ESBK06和ESBK07經(jīng)過(guò)篩選后在添加0.5 mmol/L UDP的M9蔗糖培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng),搖瓶發(fā)酵結(jié)果如表3所示,重組菌株均未生長(zhǎng)。

表3 重組菌株ESBK01～07在蔗糖培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況Table 3 Growth of recombinant strain ESBK01-07 on sucrose medium

2.2.2 不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子串聯(lián)調(diào)節(jié)

基于對(duì)啟動(dòng)子元件特性的認(rèn)識(shí),通過(guò)啟動(dòng)子串聯(lián)策略構(gòu)建串聯(lián)啟動(dòng)子能有效提高啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度。蔗糖合酶SuSy為途徑中的關(guān)鍵酶,因此針對(duì)SuSy串聯(lián)啟動(dòng)子從而進(jìn)一步增強(qiáng)SuSy的表達(dá)強(qiáng)度。構(gòu)建了分別帶有PT7-csc、Ptac-csc、PrrnD-csc的重組質(zhì)粒SBK-PT7-Pcsc-T、SBK-Ptac-Pcsc-T、SBK-PrrnD-Pcsc-T(圖5),將其轉(zhuǎn)化至宿主菌并通過(guò)菌落PCR進(jìn)行驗(yàn)證,PCR片段與對(duì)應(yīng)表達(dá)元件大小相近,重組菌株ESBK09、ESBK10和ESBK11構(gòu)建成功。

圖5 重組質(zhì)粒SBK-Pn-Pcsc-T的構(gòu)建Fig.5 Construction of the recombinant plasmids SBK-Pn-Pcsc-T

重組菌經(jīng)過(guò)篩選后在添加0.5 mmol/L UDP的M9蔗糖培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng),結(jié)果如表4所示,重組菌株ESBK09生長(zhǎng),而其他重組菌株仍未生長(zhǎng)。結(jié)果表明相比于天然啟動(dòng)子Pcsc,啟動(dòng)子串聯(lián)策略提高了蔗糖合酶SuSy的表達(dá)強(qiáng)度,由于啟動(dòng)子強(qiáng)度PT7>PrrnD>Ptac,只有在強(qiáng)啟動(dòng)子PT7介導(dǎo)下的重組菌株才能實(shí)現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng),蔗糖利用和UDP-葡萄糖合成途徑構(gòu)建成功。

表4 重組菌株ESBK09、ESBK10和ESBK11在 蔗糖培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況Table 4 Growth of recombinant strain ESBK09, ESBK10, and ESBK11 on sucrose medium

2.3 重組菌株ESBK09的細(xì)胞生長(zhǎng)和蔗糖利用

如圖6-A所示,重組菌株在改良的M9蔗糖固體培養(yǎng)基上出現(xiàn)大小不一的菌落,選擇生長(zhǎng)情況較好的菌株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。原始菌株作為對(duì)照組在改良的M9蔗糖培養(yǎng)基中OD600nm值最高僅達(dá)到0.5左右,說(shuō)明原始菌株并不能利用蔗糖。如圖6-B所示,重組菌株ESBK09生長(zhǎng)情況較好,但延滯期較長(zhǎng),15 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,40 h后進(jìn)入穩(wěn)定期,OD600值最高可達(dá)到6.0左右,生物量可達(dá)到5.3 g/L,比生長(zhǎng)速率最高可達(dá)到0.15 h-1,蔗糖消耗率在60%左右。通過(guò)qPCR方法測(cè)定重組菌在抗性培養(yǎng)條件下基因拷貝數(shù)的變化情況,結(jié)果如圖6-D所示,重組菌20～40 h進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期,基因cscK、susy拷貝數(shù)最大值出現(xiàn)在25 h左右,基因cscB的最大值出現(xiàn)在20 h左右,基因susy相較于其他兩個(gè)基因拷貝數(shù)明顯偏低,蔗糖的消耗以及重組菌株ESBK09的生長(zhǎng)進(jìn)一步證明了該途徑構(gòu)建成功。

A-M9蔗糖固體平板篩選;B-生長(zhǎng)及糖耗曲線;C-比生長(zhǎng)速率;D-基因拷貝數(shù)圖6 重組菌株ESBK09液體發(fā)酵Fig.6 Liquid fermentation of recombinant strain ESBK09

2.4 染色體組的整合

在質(zhì)粒上過(guò)表達(dá)代謝通路相關(guān)的酶存在重組菌株延滯期較長(zhǎng)以及質(zhì)粒不穩(wěn)定等問題,很難達(dá)到穩(wěn)定生產(chǎn)的目的,將基因cscB、cscK、susy整合到基因組上未篩選到能夠利用蔗糖的重組菌株,進(jìn)而通過(guò)轉(zhuǎn)入不同游離質(zhì)粒的方式分別增強(qiáng)susy,cscK的表達(dá),來(lái)實(shí)現(xiàn)重組菌株的正常生長(zhǎng)。導(dǎo)入重組質(zhì)粒pET28a-cscK、pET28a-susy、susy-PT7-Pcsc-cscK-T后誘導(dǎo)表達(dá),搖瓶發(fā)酵結(jié)果如表5所示,重組菌株EPT01、EPT02、EPT03均生長(zhǎng)。如圖7所示,在3株生長(zhǎng)的重組菌株中,重組菌株EPT03在改良的蔗糖培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好,10 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,20 h后進(jìn)入穩(wěn)定期,OD600值可達(dá)到4.8左右,與重組菌株ESBK09相比有所降低,比生長(zhǎng)速率最高可到達(dá)0.6 h-1,蔗糖消耗率在70%左右;菌株EPT01和EPT02蔗糖利用能力較差,培養(yǎng)70 h其OD600nm值均低于2.0,且后期再無(wú)增長(zhǎng),其中菌株EPT01消耗了大約5%的蔗糖,菌株EPT02消耗了接近2%的蔗糖?？傮w看來(lái),重組菌株EPT03生長(zhǎng)情況與重組菌株ESBK09相比延滯期縮短了近1倍,最高比生長(zhǎng)速率是菌株ESBK09的4倍,蔗糖消耗率也有所增加,因此認(rèn)為重組菌株EPT03略優(yōu)于重組菌株ESBK09。

表5 重組菌株EPT01、EPT02和EPT03在蔗糖 培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況Table 5 Growth of recombinant strain EPT01, EPT02, and EPT03 on sucrose medium

A-重組菌株EPT01、EPT02生長(zhǎng)及糖耗曲線;B-重組菌株EPT01、EPT02比生長(zhǎng)速率;C-重組菌株EPT03生長(zhǎng)及糖耗曲線; D-重組菌株EPT03比生長(zhǎng)速率;E-重組菌株生物量檢測(cè)圖7 重組菌株EPT01、EPT02和EPT03的液體發(fā)酵Fig.7 Liquid fermentation of recombinant strain EPT01,EPT02, and EPT03

2.5 EPT重組菌株中相關(guān)代謝途徑的分析

蔗糖代謝相關(guān)基因的引入改變了原始菌株原有代謝途徑(圖1),為了進(jìn)一步檢測(cè)基因cscB、cscK、susy的表達(dá)以及對(duì)重組菌株主要代謝途徑相關(guān)基因是否產(chǎn)生了影響,通過(guò)qPCR方法測(cè)定葡萄糖激酶GLK(EC:2.7.1.2)、葡萄糖磷酸變位酶PGM(EC:5.4.2.2)、葡萄糖磷酸異構(gòu)酶PGI(EC:5.3.1.9)、葡萄糖-1-磷酸尿苷酸轉(zhuǎn)移酶GALU(EC:2.7.7.9)[24]的基因拷貝數(shù)發(fā)現(xiàn)(圖8-A),在重組菌株EPT01、EPT02、EPT03中,基因glk、pgm、pgi、galU的轉(zhuǎn)錄并未受到影響。在重組菌株EPT01中,蔗糖合酶SuSy拷貝數(shù)過(guò)低,因此果糖無(wú)法正常合成,菌株生長(zhǎng)較差;在重組菌株EPT02中,當(dāng)蔗糖進(jìn)入胞內(nèi)后在蔗糖合酶SuSy作用下合成UDP-葡萄糖和果糖,但是由于基因cscK表達(dá)量不夠,胞內(nèi)果糖無(wú)法被高效利用,菌株生長(zhǎng)較差。重組菌株EPT03相較于其他兩株,基因cscB、cscK、susy都處于高表達(dá)水平,該菌株生長(zhǎng)情況良好。因此,只有當(dāng)關(guān)鍵途徑基因cscK、susy均處于高表達(dá)水平時(shí),該途徑才可以達(dá)到一個(gè)高效利用蔗糖狀態(tài),綜上所述,重組菌株EPT03的構(gòu)建實(shí)現(xiàn)了蔗糖利用和細(xì)胞生長(zhǎng),后續(xù)將作為底盤工程菌株用于多糖類物質(zhì)以及糖復(fù)合物的合成。

A-重組菌株EPT01-03拷貝數(shù)比較;B-重組菌株EPT03拷貝數(shù)圖8 重組菌株EPT01、EPT02和EPT03基因拷貝數(shù)Fig.8 Gene copy number of recombinant strain EPT01, EPT02, and EPT03

測(cè)定重組菌EPT03在抗性培養(yǎng)條件下基因拷貝數(shù)的變化情況,結(jié)果如圖8-B所示,重組菌EPT03在10～20 h進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期,基因cscB拷貝數(shù)最大值出現(xiàn)在10 h左右,基因cscK、susy最大拷貝數(shù)出現(xiàn)在5 h左右,基因susy拷貝數(shù)相較于基因cscK明顯偏低。相較于重組菌株ESBK09來(lái)說(shuō),基因cscB的拷貝數(shù)略有下調(diào),但并未對(duì)菌株的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響,且各個(gè)基因拷貝數(shù)的峰值明顯提前,重組菌株EPT03的生長(zhǎng)周期相較于重組菌株ESBK09明顯縮短,進(jìn)一步驗(yàn)證了重組菌株EPT03略優(yōu)于重組菌株ESBK09。

2.6 UDP-葡萄糖的測(cè)定

重組菌株EPT03發(fā)酵培養(yǎng),取發(fā)酵25 h的樣品進(jìn)行分析測(cè)定,結(jié)果如圖9所示,UDP-葡萄糖出峰時(shí)間為0.241 min,與標(biāo)樣的出峰時(shí)間一致,UDP-葡萄糖產(chǎn)量為65.65 μg/g千重,由此判斷蔗糖利用和UDP-葡萄糖合成途徑構(gòu)建成功。

圖9 標(biāo)樣(UDP-葡萄糖)和樣品的液相色譜及ESI質(zhì)譜圖Fig.9 Liquid chromatogram and ESI mass spectrum of standard(UDP-glucose)and smple

3 結(jié)論與討論

本研究提出了一種簡(jiǎn)單有效的方法,以E.coliBL21 (DE3)為出發(fā)菌株,通過(guò)引入蔗糖合酶(SuSy)、蔗糖通透酶(CscB)和果糖激酶(CscK),設(shè)計(jì)并構(gòu)建了一條以蔗糖為底物合成UDP-葡萄糖的新路徑。在此基礎(chǔ)上,借助系統(tǒng)代謝工程策略,確定了高拷貝數(shù)質(zhì)粒(pMD19-T)和啟動(dòng)子串聯(lián)策略(Pcsc-PT7)是這3種酶合成UDP-葡萄糖的最優(yōu)策略。同時(shí),蔗糖的利用是通過(guò)染色體整合和質(zhì)粒構(gòu)建共同實(shí)現(xiàn)的,使無(wú)法利用蔗糖的大腸桿菌菌株能夠穩(wěn)定、高效地利用蔗糖。工程菌株EPT03的成功構(gòu)建實(shí)現(xiàn)了從蔗糖到UDP-葡萄糖的一步合成,也為今后利用UDP-葡萄糖生產(chǎn)多種具有不同糖苷鍵型的葡萄糖基化生物分子提供強(qiáng)大的底盤微生物菌株[2]。

代謝網(wǎng)絡(luò)中酶的相對(duì)表達(dá)水平的平衡對(duì)于增強(qiáng)代謝網(wǎng)絡(luò)是至關(guān)重要的[25]。只有當(dāng)關(guān)鍵途徑基因cscK、susy均處于高表達(dá)水平,而蔗糖通透酶CscB在內(nèi)源性csc啟動(dòng)子誘導(dǎo)表達(dá)時(shí),該途徑才可以達(dá)到一個(gè)高效利用蔗糖的狀態(tài)。XU等[26]將大腸桿菌中合成脂肪酸的代謝通路分為3個(gè)模塊,通過(guò)對(duì)3個(gè)模塊的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行組合優(yōu)化,進(jìn)一步提高了脂肪酸的產(chǎn)量;ZHAO等[27]通過(guò)調(diào)節(jié)唾液酸合成途徑中不同基因的表達(dá)強(qiáng)度,優(yōu)化相關(guān)基因的啟動(dòng)子強(qiáng)度,維持了代謝網(wǎng)絡(luò)的平衡,大大提高了唾液酸的產(chǎn)量。平衡相關(guān)基因表達(dá)水平常見的手段包括基因劑量水平的質(zhì)?？截悢?shù)調(diào)節(jié),轉(zhuǎn)錄水平的啟動(dòng)子工程等[28-30]。染色體插入位點(diǎn)也可能會(huì)影響調(diào)控基因的表達(dá),因此需要評(píng)估不同插入位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄水平,以便在特定菌株中實(shí)現(xiàn)最佳生長(zhǎng)速率[23]。

UDP-葡萄糖作為生物體中重要的中間代謝產(chǎn)物,其合成與利用始終處于一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)[31],參與合成多種糖類物質(zhì)以維持細(xì)胞能量,其可用性與細(xì)胞生長(zhǎng)息息相關(guān),往往生成后便被細(xì)胞快速利用,因此難以積累[32]。在大腸桿菌中,UDP-葡萄糖代謝分解成UDP-GlcA、UDP-Gal以及海藻糖-6-磷酸等物質(zhì),進(jìn)而合成下游大分子物質(zhì)。通過(guò)對(duì)相關(guān)代謝途徑最終代謝產(chǎn)物的檢測(cè),進(jìn)而對(duì)本研究中重組大腸桿菌中的UDP-葡萄糖流向進(jìn)行代謝流的監(jiān)測(cè),有利于后續(xù)以重組菌株EPT03作為底盤工程菌的UPD-葡萄糖高效利用代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行調(diào)控。

UDP-葡萄糖在代謝網(wǎng)絡(luò)中屬于中間物質(zhì),其可用性是代謝途徑中下游物質(zhì)合成的關(guān)鍵限制因素,在確保UDP-葡萄糖合成的基礎(chǔ)上強(qiáng)化下游途徑可以高效合成目的產(chǎn)物。首先,UDP-葡萄糖合成模塊作為合成大分子物質(zhì)的代謝網(wǎng)絡(luò)中至關(guān)重要的一部分,可為后續(xù)的糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)提供糖供體,只有先實(shí)現(xiàn)UDP-葡萄糖合成才有望通過(guò)引入下游代謝途徑實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的合成。DE BRUYN等[11]應(yīng)用代謝工程策略,引入了蔗糖磷酸化酶,有效合成葡萄糖-1-磷酸,進(jìn)而合成UDP-葡萄糖,又通過(guò)引入多功能葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶,使該菌株能夠高效生產(chǎn)14種酯類物質(zhì)。YAN等[33]合理調(diào)控大腸桿菌代謝網(wǎng)絡(luò),提高宿主細(xì)胞內(nèi)UDP-葡萄糖的合成,通過(guò)引入花青素生物合成途徑基因在大腸桿菌中成功合成了花青素。此外,UDP-葡萄糖的高效合成有利于下游代謝產(chǎn)物的積累,MAO等[34]過(guò)表達(dá)了pgm基因和galU基因,提高了UDP-葡萄糖合成途徑的碳源流量,在此基礎(chǔ)上引入下游途徑使產(chǎn)物產(chǎn)量提高了8倍。THUAN等[5]在大腸桿菌中過(guò)表達(dá)諾卡氏菌屬來(lái)源的pgm基因和大腸桿菌來(lái)源的galU基因促進(jìn)UDP-葡萄糖的合成進(jìn)而使下游糖苷的產(chǎn)量大大增加。通過(guò)微生物細(xì)胞工廠理性設(shè)計(jì)優(yōu)化代謝網(wǎng)絡(luò),對(duì)底盤工程菌株的代謝路徑進(jìn)行改造,動(dòng)態(tài)調(diào)控生物合成途徑,有利于實(shí)現(xiàn)代謝流高效流向目標(biāo)產(chǎn)物的合成方向。