代謝組學(xué)在食源性致病弧菌研究中的應(yīng)用進(jìn)展

趙燕妮,武若冰,余瑞,張森虎,李華,劉歡*

1(陜西科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,陜西 西安,710021) 2(南方科技大學(xué),公共分析測(cè)試中心,廣東 深圳,518055)

弧菌是海洋環(huán)境中豐富的致病菌之一,在世界各地的海水水域中均可見其身影。其生長(zhǎng)迅速且擁有很強(qiáng)的適應(yīng)能力,可在短時(shí)間內(nèi)引起病害的大面積爆發(fā),嚴(yán)重制約著我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)和捕撈業(yè)的持續(xù)發(fā)展,甚至威脅人類生命健康。到目前為止,已超過100種弧菌被鑒定,其中創(chuàng)傷弧菌、副溶血弧菌、霍亂弧菌等是世界范圍內(nèi)引起人類食源性弧菌病的主要病原菌。由致病性弧菌引起的食源性疾病通常與食用生的或未煮熟的海鮮有關(guān),食源性弧菌感染的常見癥狀包括急性腸胃炎、敗血癥等。同時(shí),食源性弧菌病具有明顯的季節(jié)性分布,一般在每年5～7月為發(fā)病高峰期。此外,隨著全球氣候變暖,發(fā)病率持續(xù)上升[1-3]。

抗生素是弧菌病害防治的主要手段,起初抗生素具有見效快、價(jià)格低廉等優(yōu)勢(shì),然而濫用抗生素可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性,甚至?xí)霈F(xiàn)超級(jí)細(xì)菌。開發(fā)新型安全、高效的病害防治手段已成為當(dāng)前亟待解決的問題。為了使弧菌病害防治手段的開發(fā)做到有的放矢,開展弧菌致病機(jī)制的基礎(chǔ)研究工作就顯得尤為重要。

多組學(xué)技術(shù),即整合基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)及代謝組學(xué)等,可為細(xì)菌致病機(jī)制及新型防治手段的設(shè)計(jì)與開發(fā)提供更加系統(tǒng)的理論支持。目前有關(guān)弧菌致病機(jī)制等方面的研究主要依托于基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),然而這些研究方法主要集中在基因和蛋白等生物體生命活動(dòng)的上游調(diào)控元件[4]。小分子代謝物作為基因和蛋白表達(dá)的末端產(chǎn)物,可以更直接、準(zhǔn)確地反映生物體當(dāng)前的狀態(tài)。通過考察生物體內(nèi)小分子代謝物水平及代謝網(wǎng)絡(luò)的變化,可為細(xì)菌毒力調(diào)控機(jī)制的研究提供新的視角。代謝組學(xué)作為系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分,可對(duì)生物體內(nèi)在生命過程中存在的代謝物進(jìn)行全面表征、鑒定與定量分析,其在理解弧菌與宿主之間相互關(guān)系、揭示弧菌耐藥機(jī)制及致病機(jī)制中扮演著重要角色。然而,目前基于代謝組學(xué)技術(shù)在食源性弧菌研究中的應(yīng)用尚未見綜述。針對(duì)于此,本文介紹了食源性弧菌的分類、代謝組學(xué)技術(shù)的分析流程及其在揭示宿主免疫應(yīng)答反應(yīng)、弧菌致病機(jī)制及抗生素耐藥性相關(guān)研究方面的進(jìn)展,有望為食源性致病弧菌的新型防控手段的開發(fā)提供新視角和新思路。

1 食源性致病弧菌

食源性致病弧菌是一種人畜共患病原菌,可導(dǎo)致人類或水產(chǎn)動(dòng)物創(chuàng)傷性感染、敗血癥等,主要包括霍亂弧菌、副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌等。食源性弧菌的致病性主要取決于其毒力因子(如鞭毛、腸毒素、外膜蛋白、鐵磷化合物、生物被膜、黏附因子、Ⅲ型分泌系統(tǒng)等),而毒力因子的表達(dá)會(huì)受到群體感應(yīng)系統(tǒng)、雙組分系統(tǒng)、非編碼sRNA分子等精密調(diào)控[5-9]。

1.1 對(duì)人類致病的食源性弧菌

食源性致病弧菌引起的人類疾病可分為兩大類:霍亂和非霍亂感染。霍亂弧菌是引起人類重大流行病-霍亂的病原體,是弧菌屬中對(duì)人類公共衛(wèi)生影響最為嚴(yán)重的病原菌,具有發(fā)病急、傳染性強(qiáng)、發(fā)病率高等特點(diǎn)。霍亂弧菌致病島1(Vibrio Cholerae pathogenicity island 1, VPI-1)是霍亂弧菌基因組島(genomic islands, GI)中最具特征的基因之一,可編碼許多促進(jìn)霍亂發(fā)展的毒力因子,對(duì)于霍亂弧菌的定植和霍亂毒素(cholera toxin, CT)的產(chǎn)生至關(guān)重要,當(dāng)霍亂弧菌缺乏VPI-1時(shí),則不會(huì)對(duì)人類產(chǎn)生威脅[10]。非霍亂弧菌(如副溶血性弧菌、創(chuàng)傷弧菌)也已成為日本、美國(guó)、泰國(guó)等國(guó)引起食源性感染的主要病原菌之一。若人食用被其污染的水產(chǎn)品,常會(huì)出現(xiàn)2～10 d的水樣腹瀉、腹痛,甚至出現(xiàn)急性腸胃炎、敗血癥等。由tdh和trh基因編碼的熱穩(wěn)定直接溶血素(thermostable direct hemolysin, TDH)或TDH相關(guān)溶血素(TDH-related hemolysin, TRH)被認(rèn)為是副溶血弧菌的主要毒力因子。其中,TDH是一種具有中心孔的四聚體,可在脂質(zhì)體上形成跨膜孔,使細(xì)胞內(nèi)外的離子滲透不平衡,最終導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、溶解[11]。與TDH類似,TRH能在紅細(xì)胞膜中形成氯離子(Cl-)通道,導(dǎo)致離子通量改變[12]。與副溶血弧菌不同,創(chuàng)傷弧菌是一種高度致命的人類病原體,其死亡率是所有食源性病原體中最高的,確診病例的死亡率接近50%。這歸因于創(chuàng)傷弧菌可表達(dá)多種致命外毒素,這些毒素具有嚴(yán)重侵襲性和損傷力[13]。研究發(fā)現(xiàn)MARTX(multifunctional-autoprocessingrepeats-in-toxin)是創(chuàng)傷弧菌重要的外毒素之一,其可形成一種孔洞導(dǎo)致紅細(xì)胞內(nèi)Ca+內(nèi)流,進(jìn)而誘導(dǎo)了紅細(xì)胞的促凝活性增加,最終引起人類紅細(xì)胞形態(tài)的改變和血栓的形成[14]。這些病原體在成功定殖于生物體內(nèi)后,均會(huì)通過產(chǎn)生一系列的毒力因子來干擾機(jī)體正常的新陳代謝,其引起的主要癥狀也大致相似,主要包括腸粘膜細(xì)胞受損、腸道感染等。

1.2 對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物體致病的食源性弧菌

魚類、雙殼類和單殼類等一系列海洋生物疾病的流行也與食源性弧菌感染密切相關(guān)。其中,溶藻弧菌是引起海洋魚蝦類患病的一種常見病菌,其可感染多種海洋生物如黑鯛、鮭點(diǎn)石斑魚、黃鰭鯛、凡納濱對(duì)蝦、文蛤等,主要表現(xiàn)為生物體皮膚潰爛、不同部位的充血腫脹甚至死亡[15]。此外,溶藻弧菌可通過分泌大量的胞外產(chǎn)物(extracellular products, ECPs)逃避宿主的自然防御并干擾宿主正常的新陳代謝,已知的胞外產(chǎn)物包括外膜蛋白、溶血素、腸毒素、鐵磷化合物、蛋白酶等,其中外膜蛋白與細(xì)菌黏附、毒力以及環(huán)境適應(yīng)性等息息相關(guān)。BUNPA等人[16]從發(fā)病魚體中分離得到的溶藻弧菌中,共鑒定出7種獨(dú)特的蛋白質(zhì),其中外膜蛋白A(outer membrane protein A, OmpA)的表達(dá)最強(qiáng),是溶藻弧菌致病所必需的關(guān)鍵因子。擬態(tài)弧菌也被認(rèn)為是引起水產(chǎn)動(dòng)物患病的病原菌,其感染具有病程短和死亡率高的流行特征。有研究發(fā)現(xiàn)擬態(tài)弧菌已嚴(yán)重影響我國(guó)淡水鲇養(yǎng)殖的生態(tài)平衡,這可能與擬態(tài)弧菌中Ⅱ型分泌系統(tǒng)(type II secretion system, T2SS)有關(guān),其負(fù)責(zé)多種胞外蛋白酶和毒素的分泌,當(dāng)T2SS基因簇缺失時(shí)鲇魚的存活率上升[17]。

為了預(yù)防和控制與弧菌有關(guān)的疾病,以抗生素為代表的治療手段在弧菌防治方面取得了一定的進(jìn)展,但仍存在抗生素耐藥性等安全隱患,實(shí)施新的抗生素替代品(如植物源抑菌劑、疫苗等)以控制食源性致病弧菌,是向可持續(xù)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)過渡的一個(gè)重要步驟。為了使弧菌病害防治手段的開發(fā)做到有的放矢,開展弧菌致病機(jī)制的基礎(chǔ)研究工作就顯得尤為重要。目前弧菌致病機(jī)制的研究主要集中在基因和蛋白等生物體生命活動(dòng)的上游調(diào)控元件中,而代謝物是生物系統(tǒng)內(nèi)化學(xué)反應(yīng)的產(chǎn)物和底物,是各種生理活動(dòng)綜合的結(jié)果,因而更能直接、準(zhǔn)確地反映生理和病理的結(jié)果。代謝組學(xué)被認(rèn)為是用于表征小分子代謝物的高級(jí)分析方法,現(xiàn)在已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到微生物領(lǐng)域。

2 代謝組學(xué)技術(shù)

2.1 代謝組學(xué)的概況

代謝組學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分,是一門研究生命體中所有代謝物受外部環(huán)境刺激后的變化規(guī)律的學(xué)科,能夠系統(tǒng)的反映生物體整體或組織細(xì)胞生理功能及其與內(nèi)在或外在因素的相互作用[18-19]。代謝組學(xué)技術(shù)借助生物信息學(xué)和化學(xué)計(jì)量學(xué)以及先進(jìn)的分析平臺(tái),使其在整體上挖掘生物體功能信息、研究生物體內(nèi)小分子代謝物變化規(guī)律等具有獨(dú)特且顯著的優(yōu)勢(shì),已被廣泛應(yīng)用于食源性弧菌致病機(jī)制的研究中。

2.2 食源性致病弧菌的代謝組學(xué)分析流程

完整的代謝組學(xué)分析流程包括樣品采集和提取、數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)的預(yù)處理、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析、代謝物鑒定及數(shù)據(jù)解釋(圖1)。在生物樣本的采集、預(yù)處理和制備過程中,由于細(xì)胞內(nèi)的酶系活躍,代謝產(chǎn)物不斷經(jīng)歷化學(xué)反應(yīng)。有學(xué)者提出淬滅取樣能最大程度保留細(xì)菌的代謝特征,避免生物樣品在采集過程中發(fā)生額外的新陳代謝[20]。此外,細(xì)胞內(nèi)代謝物化學(xué)性質(zhì)(如極性、非極性)存在很大的差異性且濃度跨越范圍廣,為擴(kuò)大化合物提取的覆蓋度,常用的提取溶劑有甲醇水、甲醇/氯仿/水、甲基叔丁基醚/甲醇/水等[21]。另外對(duì)于含有羥基、巰基、氨基等極性代謝物還需進(jìn)一步衍生化處理以提高質(zhì)譜檢測(cè)的靈敏度[22]。值得注意的是,不同弧菌之間存在特異性,培養(yǎng)條件也不盡相同,研究者會(huì)根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求及弧菌特性優(yōu)化提取溶劑的選擇及配比,所以對(duì)弧菌樣品的提取目前尚無統(tǒng)一的方法。

圖1 食源性致病弧菌的代謝組學(xué)分析流程[18]Fig.1 Metabolomics analysis process of foodborne pathogenic Vibrio spp.[18]

目前,代謝組學(xué)常用的數(shù)據(jù)采集技術(shù)包括核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)和MS。其中,基于NMR的代謝組學(xué)技術(shù)具有樣品制備簡(jiǎn)單、無損傷性、重現(xiàn)性高等優(yōu)勢(shì)[23],但也存在靈敏度較低、動(dòng)態(tài)范圍有限、覆蓋度小等不足。與NMR相比,MS技術(shù)擁有更高的靈敏度、更好的結(jié)構(gòu)鑒定能力以及更寬的線性范圍,可產(chǎn)生豐富的數(shù)據(jù)集,其常與氣相色譜(gas chromatography, GC)、液相色譜(liquid chromatography, LC)、毛細(xì)管電泳(capillary electrophoresis, CE)聯(lián)用以提高檢測(cè)的靈敏度及分離能力。GC-MS是代謝組學(xué)研究中較為成熟的分析平臺(tái),一般用于分離鑒定分子質(zhì)量在50～600 Da的易揮發(fā)性化合物,但對(duì)于難揮發(fā)及熱不穩(wěn)定性的物質(zhì)需要衍生化來提高其揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性[24]。LC-MS是目前應(yīng)用最廣泛的分析平臺(tái),它結(jié)合了液相色譜技術(shù)卓越的分離能力和質(zhì)譜的高分辨率和高靈敏度的特點(diǎn),可對(duì)一些熱穩(wěn)定性差、難揮發(fā)的非極性化合物進(jìn)行分析[25]。CE-MS是代謝組學(xué)研究中逐漸興起的分析平臺(tái),與GC-MS、LC-MS相比,CE-MS適合分析一些強(qiáng)極性離子化合物,如有機(jī)酸、氨基酸、核苷酸等[26]。上述單一的分析平臺(tái)均具有一定的偏向性,不能全面的覆蓋生物體內(nèi)的所有代謝物。雖然多平臺(tái)可以更好地覆蓋弧菌的代謝物,但高額的成本也令人們望而卻步,因此提高各平臺(tái)的覆蓋度和靈敏度是目前亟需解決的難題。

對(duì)于儀器分析獲得的代謝組學(xué)原始數(shù)據(jù),首先要進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理,轉(zhuǎn)化成可用于統(tǒng)計(jì)學(xué)和化學(xué)計(jì)量學(xué)分析的數(shù)據(jù)形式,再進(jìn)行方法驗(yàn)證以確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和有效性。目前一些免費(fèi)的第三方軟件受到人們的青睞,如XCMS、MET-IDEA、MZmine、AMDIS等。這些軟件可以識(shí)別大部分儀器生成的數(shù)據(jù)格式,且軟件程序是開源的,可以根據(jù)用戶的需求,對(duì)算法進(jìn)行改進(jìn)[27]。最后結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法(多變量分析和單變量分析)挖掘代謝組學(xué)數(shù)據(jù)中有用的信息,并借助生物信息學(xué)對(duì)代謝物進(jìn)行生物解釋。

3 基于代謝組學(xué)技術(shù)在食源性致病弧菌研究中的進(jìn)展

近年來,代謝組學(xué)技術(shù)在理解弧菌與宿主之間的相互作用關(guān)系、揭示弧菌耐藥機(jī)制及致病機(jī)制中扮演著重要的角色。其中,食源性弧菌侵襲宿主可激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生一系列的代謝變化,通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析獲得與宿主免疫應(yīng)答密切相關(guān)的生物標(biāo)志物,并結(jié)合外部驗(yàn)證闡明關(guān)鍵生物標(biāo)志物的生物功能,可為后續(xù)抗菌物質(zhì)的研發(fā)提供靶點(diǎn)。此外,代謝組學(xué)可為系統(tǒng)解析抗生素對(duì)細(xì)菌代謝調(diào)控機(jī)制提供有力工具,可用于揭示耐藥弧菌代謝特性,闡明耐藥機(jī)制并改善抗生素殺菌效果;結(jié)合代謝組學(xué)技術(shù)與分子生物學(xué)技術(shù),可對(duì)食源性致病弧菌的毒力調(diào)控因子的具體調(diào)控功能系統(tǒng)地進(jìn)行闡述,為弧菌新型防治手段的設(shè)計(jì)與開發(fā)提供理論依據(jù)(圖2)。

圖2 基于代謝組學(xué)在食源性致病弧菌研究中的策略[28-40]Fig.2 Research strategies of foodborne pathogenic Vibrio spp.based on metabolomics [28-40]

3.1 代謝組學(xué)技術(shù)在揭示宿主免疫應(yīng)答方面的研究

當(dāng)水產(chǎn)動(dòng)物受到食源性弧菌侵襲時(shí),免疫系統(tǒng)會(huì)激發(fā)一系列的生化反應(yīng)過程來調(diào)節(jié)代謝資源分配,以支持其在應(yīng)激條件下的防御和生存,然而目前人們對(duì)于食源性弧菌引起宿主的應(yīng)激代謝反應(yīng)尚不完全清楚。利用代謝組學(xué)技術(shù)探究弧菌與宿主之間的相互作用關(guān)系,有助于更好地理解生物系統(tǒng)內(nèi)復(fù)雜的免疫應(yīng)激過程,為弧菌病害的防治提供新的參考。富集的能量代謝對(duì)宿主抵抗病原菌至關(guān)重要,如果能量代謝調(diào)節(jié)失衡必將引起宿主組織功能障礙,進(jìn)而影響宿主正常的生理代謝活動(dòng),因此了解宿主在免疫應(yīng)激過程中的能量代謝是必要的。有研究發(fā)現(xiàn)在感染副溶血弧菌的泥蟹中,副溶血弧菌是通過減少與能量合成相關(guān)的代謝物(琥珀酸、蘋果酸、乳酸)導(dǎo)致泥蟹不同組織中ATP含量的減少,能量代謝的減弱大大提高了泥蟹死亡的風(fēng)險(xiǎn)[28]。也有研究發(fā)現(xiàn)被哈維氏弧菌感染的凡納濱對(duì)蝦對(duì)能量的需求增加,主要表現(xiàn)為隨著感染天數(shù)的增加,碳水化合物的含量始終處于整體下調(diào)的趨勢(shì),這可能是由于蝦在免疫過程中會(huì)消耗大量能量,而碳水化合物可被調(diào)用參與能量代謝,進(jìn)而引起其含量的降低[29]。此外,脂肪酸合成及分解途徑也可在宿主受到弧菌威脅或環(huán)境脅迫時(shí)參與能量調(diào)節(jié),應(yīng)對(duì)免疫應(yīng)答反應(yīng)。SU等[30]研究發(fā)現(xiàn)感染副溶血弧菌的蛤蜊體內(nèi)甘油三酯的合成途徑相對(duì)于甘油三酯的脂解途徑明顯減弱、脂肪酸從頭合成途徑加強(qiáng),這促進(jìn)了游離脂肪酸的β氧化進(jìn)而通過富集蛤蜊體內(nèi)的能量代謝以應(yīng)對(duì)副溶血弧菌的感染。

此外,利用代謝組學(xué)技術(shù)探尋弧菌所引起的宿主免疫應(yīng)答的生物標(biāo)記物,進(jìn)而揭示疾病表型下宿主的深刻內(nèi)在變化是目前研究的熱點(diǎn)。YE等[31]利用1H NMR代謝學(xué)技術(shù)分析發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,感染溶藻弧菌的梭子蟹肌肉中肌苷一磷酸(inosine monophosphate, IMP)水平下降了82.4%,猜測(cè)IMP是梭子蟹免疫應(yīng)答過程中的潛在生物標(biāo)志物,但其在宿主免疫過程中的作用并未研究。為了更深入的了解海洋生物的免疫應(yīng)答反應(yīng),有學(xué)者提出了功能代謝組學(xué),其結(jié)合生物信息學(xué)和體內(nèi)外實(shí)驗(yàn),系統(tǒng)的解釋了關(guān)鍵生物標(biāo)志物在免疫反應(yīng)中的作用。GONG等[32]采用功能代謝組學(xué)的方法研究了溶藻弧菌感染斑馬魚后,死亡斑馬魚和存活斑馬魚的代謝差異,結(jié)果表明與未感染的對(duì)照組相比,死亡組中色氨酸豐度降低,而存活組的色氨酸豐度增加,進(jìn)一步采用體內(nèi)注射的方式給予被感染的斑馬魚外源性色氨酸并檢測(cè)其存活率,發(fā)現(xiàn)色氨酸以劑量依賴的方式促進(jìn)斑馬魚的存活。YANG等[33]發(fā)現(xiàn)感染溶藻弧菌后存活的斑馬魚體內(nèi)三羧酸循環(huán)是受影響最大的途徑,該途徑中的蘋果酸發(fā)生了顯著上調(diào),進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)外源注射蘋果酸可以重新激活感染斑馬魚的三羧酸循環(huán),促進(jìn)?；撬岬暮铣?來提高斑馬魚的生存率?？傮w而言,采用功能性內(nèi)源代謝物不僅可以增強(qiáng)水產(chǎn)動(dòng)物的抗感染力,亦可以降低耐藥菌的產(chǎn)生,即可通過非依賴性的方法來防治弧菌感染,從而起到保護(hù)海洋生物的作用,是目前弧菌病害防治技術(shù)發(fā)展的新方向。

3.2 代謝組學(xué)技術(shù)用于抗生素耐藥性相關(guān)的研究

由于抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的廣泛使用,導(dǎo)致耐藥細(xì)菌的數(shù)量急劇增加。因此,迫切需要進(jìn)一步了解細(xì)菌耐藥機(jī)制和改善抗生素殺菌效果,以控制耐藥性病原菌。目前,越來越多的證據(jù)表明細(xì)菌與抗菌藥物接觸后,可通過改變自身的代謝狀態(tài)使其不被抗菌藥物殺滅。通過代謝組學(xué)監(jiān)測(cè)細(xì)菌在抗生素作用下的代謝反應(yīng)及適應(yīng)機(jī)制,可系統(tǒng)的了解耐藥菌的生理代謝特征及耐藥機(jī)制。YIN等[34]利用代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)兩種不同質(zhì)量濃度(0.3 μg/mL、0.5 μg/mL)的氧氟沙星處理后的溶藻弧菌進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)脂肪酸生物合成途徑的增強(qiáng)能夠使細(xì)菌在0.5 μg/mL的抗生素脅迫下較好的生長(zhǎng),進(jìn)一步的分析表明抑制脂肪酸生物合成途徑可阻止細(xì)菌在高劑量抗生素壓力下的生長(zhǎng)。LIU等[35]發(fā)現(xiàn)在抗頭孢他啶的溶藻弧菌(ceftazidime-resistantV.alginolyticus, VA-RCAZ)中出現(xiàn)丙酮酸循環(huán)減弱、脂肪酸生物合成途徑增強(qiáng)的代謝特征,深入發(fā)現(xiàn)VA-RCAZ中丙酮酸循環(huán)中的檸檬酸、琥珀酸豐度降低,而富馬酸、蘋果酸豐度增加,表明丙酮酸循環(huán)上游代謝可能減弱,導(dǎo)致下游產(chǎn)物的積累,促進(jìn)大量的乙酰輔酶A進(jìn)入脂肪酸生物合成途徑,進(jìn)而增強(qiáng)VA-RCAZ對(duì)頭孢他啶的耐藥性。綜上所述,抑制脂肪酸代謝可作為抗生素治療過程中預(yù)防抗生素耐藥菌進(jìn)化的一個(gè)潛在新策略。

此外,功能代謝組學(xué)作為一種改善抗生素殺菌效果的新型技術(shù),其可在代謝組學(xué)闡明細(xì)菌耐藥機(jī)制的基礎(chǔ)上,通過代謝調(diào)節(jié)劑(如關(guān)鍵的生物標(biāo)志物)對(duì)具有耐藥特性的代謝通路或途徑進(jìn)行重編程,以干擾耐藥細(xì)菌體內(nèi)耐藥活性物質(zhì)的產(chǎn)生,從而增強(qiáng)現(xiàn)有抗生素介導(dǎo)的殺菌效果。ZHANG等[36]通過代謝組學(xué)發(fā)現(xiàn)抗慶大霉素的溶藻弧菌細(xì)胞內(nèi)葡萄糖含量顯著降低,外源添加葡萄糖能夠改善慶大霉素對(duì)耐藥菌的殺菌效果,這是由于葡萄糖可逆轉(zhuǎn)耐藥菌中氧化還原反應(yīng)的減弱,促進(jìn)溶藻弧菌對(duì)慶大霉素的吸收,使得抗生素殺傷作用大大提高。KUANG等[37]發(fā)現(xiàn)丙氨酸與慶大霉素聯(lián)合使用會(huì)引起抗慶大霉素溶藻弧菌胞內(nèi)的一氧化氮合酶活性及一氧化氮水平降低,進(jìn)而增強(qiáng)慶大霉素對(duì)耐藥菌的殺傷效果,而精氨酸的加入則會(huì)促進(jìn)一氧化氮的形成,提高丙氨酸與慶大霉素協(xié)調(diào)作用下耐藥菌的存活率。

3.3 代謝組學(xué)技術(shù)在揭示弧菌致病機(jī)制方面的研究

雖然食源性致病弧菌感染的致病機(jī)制已有研究,但每個(gè)感染階段分子機(jī)制的潛在復(fù)雜性在很大程度上尚不清楚。代謝組學(xué)技術(shù)能對(duì)食源性致病弧菌的某個(gè)毒力因子或毒力相關(guān)基因的具體調(diào)控功能進(jìn)行分析,可以從小分子層面系統(tǒng)地闡明弧菌的致病機(jī)制。副溶血性弧菌的三型分泌系統(tǒng)Ι(typeⅢ secretion systemΙ, T3SSΙ)可將不同的效應(yīng)物和毒素輸送到細(xì)胞質(zhì)中,導(dǎo)致細(xì)胞毒性和嚴(yán)重的疾病,其包括4個(gè)效應(yīng)器分別是VopQ、VopR、VopS、Vop0450。NGUYEN等[38]利用GC-MS代謝組學(xué)技術(shù)研究了副溶血弧菌毒力因子T3SSΙ的致病機(jī)制,用4株攜帶特定效應(yīng)器(VopQ、VopR、VopS、Vop0450)的副溶血性弧菌突變株感染Caco-2細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)T3SSΙ中的VopQ效應(yīng)器在誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞感染中發(fā)揮了重要作用,該效應(yīng)子顯著改變了宿主細(xì)胞的糖酵解、三羧酸循環(huán)和氨基酸代謝,并通過耗盡細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽和增加活性氧的產(chǎn)生來破壞宿主細(xì)胞的氧化還原動(dòng)態(tài)平衡。RNA伴侶Hfq(host factor for RNA phage Qβ)蛋白是細(xì)菌主要的調(diào)控因子之一,參與調(diào)節(jié)各種關(guān)鍵的生理活動(dòng),對(duì)細(xì)菌適應(yīng)不同環(huán)境和生長(zhǎng)條件至關(guān)重要。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)Hfq對(duì)溶藻弧菌的生長(zhǎng)、環(huán)境適應(yīng)能力以及毒力因子的表達(dá)具有重要的調(diào)控作用。進(jìn)一步基于代謝組學(xué)和脂質(zhì)組學(xué)分析方法研究了hfq的缺失對(duì)溶藻弧菌代謝的影響,分析發(fā)現(xiàn)hfq基因缺失可抑制支鏈氨基酸、芳香族氨基酸的合成,促進(jìn)三羧酸循環(huán),從而影響弧菌的逆境防御和能量代謝。此外,hfq缺失觸發(fā)了游離脂肪酸和核苷的從頭合成,并促進(jìn)了磷脂和鞘磷脂的分解代謝,進(jìn)一步調(diào)節(jié)了細(xì)胞的分裂和生長(zhǎng)[39]。小分子非編碼RNA(sRNA)被認(rèn)為在細(xì)菌新陳代謝和毒力調(diào)控中發(fā)揮著重要作用,LIU等[40]鑒定了一種細(xì)胞密度依賴的sRNA分子——Qrr,采用代謝組學(xué)技術(shù)研究了Qrr對(duì)溶藻弧菌代謝的調(diào)控作用,分析發(fā)現(xiàn)qrr的缺失會(huì)導(dǎo)致大多數(shù)溶血磷脂顯著上調(diào),溶血磷脂是由甘油磷脂前體通過磷脂酶介導(dǎo)的脂解作用而產(chǎn)生的代謝物,推測(cè)qrr的缺失會(huì)加快磷脂的分解代謝,這與Δqrr菌株生長(zhǎng)緩慢、生物膜形成減少的生理表型相一致。

值得注意的是,弧菌的致病性是多種毒力因子共同作用的結(jié)果,其中會(huì)涉及許多基因、蛋白質(zhì)、信號(hào)分子的調(diào)控,僅靠代謝學(xué)技術(shù)不能完全解讀弧菌復(fù)雜的致病過程。多組學(xué)整合分析克服了單個(gè)類型的“組學(xué)數(shù)據(jù)”的局限性,能夠在多層面多角度系統(tǒng)地解釋弧菌感染過程中復(fù)雜的分子機(jī)制,可極大地促進(jìn)潛在抗菌靶點(diǎn)的挖掘和藥物的開發(fā)。但目前多組學(xué)整合分析的研究還較為有限,并沒有在食源性致病弧菌中廣泛應(yīng)用。

4 結(jié)論

代謝組學(xué)是研究生命體中小分子代謝物受外部環(huán)境刺激后變化規(guī)律的一門學(xué)科,能夠系統(tǒng)全面地反映生物體生理功能及其與內(nèi)在或外在因素的相互作用關(guān)系。近年來,代謝組學(xué)技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于食源性致病弧菌的研究中,可實(shí)現(xiàn)對(duì)弧菌與宿主中復(fù)雜相互作用的探索,深入還原細(xì)菌耐藥機(jī)制、改善抗生素殺菌效果,并從小分子層面系統(tǒng)地闡明弧菌的致病機(jī)制,為食源性弧菌病害的防治提供了新的理論指導(dǎo)。然而,代謝組技術(shù)仍處于一個(gè)不斷發(fā)展的過程,還面臨著諸多問題和挑戰(zhàn),主要體現(xiàn)在每一個(gè)分析平臺(tái)都具有一定的偏向性,不能全面的覆蓋生物體的所有代謝物。雖然多平臺(tái)可以更好地覆蓋弧菌的代謝物,但高額的成本也令人們望而卻步,因此提高各平臺(tái)的覆蓋度和靈敏度是我們必須面對(duì)和亟需解決的難題。其次弧菌的致病性是多種毒力因素共同作用的結(jié)果,需要進(jìn)一步的研究來充分闡明這種復(fù)雜的分子機(jī)制,多組學(xué)技術(shù)的整合將加深對(duì)弧菌發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí),可極大地促進(jìn)潛在抗菌靶點(diǎn)的挖掘和新型藥物的開發(fā)。最后弧菌所引發(fā)的疾病是一個(gè)復(fù)雜且不斷變化的過程,常規(guī)的代謝組學(xué)分析獲取的代謝物是靜態(tài)結(jié)果,僅表征了生物反應(yīng)的最終結(jié)果,代謝流分析技術(shù)則可以很好地彌補(bǔ)這一局限,以期為弧菌致病機(jī)制的研究提供新參考。