血漿ctDNA 與彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤免疫亞型及預(yù)后相關(guān)性

劉京偉 許風(fēng)霞 周倩

彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤（Diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）是最常見(jiàn)的非霍奇金淋巴瘤（Non-Hodgkin's lymphoma，NHL）亞型，約占NHL 的30%～40%［1-2］。DLBCL 具有明顯的異型性及侵襲性，近年來(lái)，隨著利妥昔單抗的廣泛應(yīng)用，患者生存期有所提高，但仍有部分患者治療后復(fù)發(fā)，預(yù)后較差［3］。因此，識(shí)別高危患者，實(shí)施個(gè)體化治療成為DLBCL 研究熱點(diǎn)。循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）是循環(huán)游離DNA（circulating cell free DNA，cfDNA）的一部分，由腫瘤細(xì)胞直接分泌，具有精確分子監(jiān)測(cè)效能［4］。目前，ctDNA 已被證明可用于肝癌、非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤診斷、預(yù)后評(píng)估和復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)，具有作為生物標(biāo)志物的潛在作用［5-6］。本研究嘗試探討DLBCL 患者血漿ctDNA 表達(dá)與免疫亞型及預(yù)后的相關(guān)性。報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018 年4 月至2021 年4 月山東省臨沂市中心醫(yī)院94 例DLBCL 患者為研究對(duì)象，均符合DLBCL 診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］，并經(jīng)組織病理和免疫組化確診；均采用標(biāo)準(zhǔn)R-CHOP 方案免疫化學(xué)治療；患者及家屬知情同意。其中男58 例，女36 例，年齡平均（58.93±7.82）歲。本研究經(jīng)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

①臨床資料收集：記錄入組患者性別、年齡、B 癥狀、美國(guó)東部協(xié)作腫瘤組（Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG）體能狀況（performance status，PS）評(píng)分、國(guó)際預(yù)后指數(shù)（International Prognostic Index，IPI）評(píng)分、有無(wú)大包塊、疾病分期、乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase，LDH）水平、B細(xì)胞淋巴瘤-2（B cell lympho-ma/leukemia 2 gene，Bcl-2）/核內(nèi)原癌基因（nuclear oncogene，MYC）雙表達(dá)、免疫亞型。②血漿ctDNA 檢測(cè)：化療前采集外周血10 mL，24 h 內(nèi)離心，分離血漿。提取血漿游離DNA（德國(guó)Qiagen 公司QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit），進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)（美國(guó)Thermo公司Invitrogen Qubit kit 試劑盒及熒光計(jì)）。捕獲免疫球蛋白重鏈（IgH）目標(biāo)基因組區(qū)域（美國(guó)InvivoScribe 公 司LymphoTrack IGH assay kit），擴(kuò)增。構(gòu)建DNA 文庫(kù)，加入MiSeq Reagent Kit V2（美國(guó)Illumina 公司）試劑盤(pán)中，進(jìn)行二代測(cè)序（Illumina 測(cè)序儀，美國(guó)Illumina 公司）。導(dǎo)出FASTQ 文件，分析數(shù)據(jù)（LymphoTrack 軟件）?？寺⌒蛄蓄l率＞5%為單克隆性重排序列［8］。③免疫亞型：采用免疫組化法檢測(cè)MUM-1（北京中杉金橋公司鼠抗人MUM-1 單克隆抗體）、Bcl-6（北京中杉金橋公司鼠抗人Bcl-6 單克隆抗體）、CD10（福州邁新生物技術(shù)有限公司鼠抗人CD10 單克隆抗體），Bcl-6、CD10 在細(xì)胞核表達(dá)，CD10 在細(xì)胞膜表達(dá)，CD10 陽(yáng)性為生發(fā)中心B 細(xì)胞樣（Germinal center B-cell-lik，GCB）；Bcl-6、CD10 均陰性為非GCB；若CD10 陰性，Bcl-6 陽(yáng)性，用MUM1 來(lái)分類(lèi)，MUM1陰性為GCB，MUM1 陽(yáng)性為非GCB［9］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 22.0 處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料用n（%）表示，χ2檢驗(yàn)，等級(jí)資料采用Ridit 檢驗(yàn)；預(yù)后影響因素采用COX 回歸分析；使用相對(duì)超危險(xiǎn)度比（RERI）、歸因比（AP）、交互作用指數(shù)（SI）分析ctDNA、免疫亞型評(píng)估DLBCL 患者預(yù)后的交互作用。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DLBCL 患者血漿ctDNA 表達(dá)

94 例DLBCL 患者中，78 例ctDNA 檢測(cè)呈陽(yáng)性，16例ctDNA 檢測(cè)呈陰性，陽(yáng)性率達(dá)82.98%（78/94）。

2.2 DLBCL 患者血漿ctDNA 表達(dá)與病理特征的關(guān)系

IPI 評(píng)分高風(fēng)險(xiǎn)患者ctDNA 陽(yáng)性表達(dá)率高于IPI 評(píng)分低風(fēng)險(xiǎn)患者，ⅡB～Ⅳ患者ctDNA 陽(yáng)性表達(dá)率高于Ⅰ～ⅡA 患者，Bcl-2/MYC 雙表達(dá)患者ctDNA 陽(yáng)性表達(dá)率高于無(wú)Bcl-2/MYC 雙表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 DLBCL 患者血漿ctDNA 表達(dá)與病理特征的關(guān)系［n（%）］Table 1 Relationship between plasma ctDNA expression and pathological features in DLBCL patients［n（%）］

2.3 DLBCL患者血漿ctDNA表達(dá)與免疫亞型的關(guān)系

94 例DLBCL 患者中，GCB 31 例，非GCB 63例。GCB 患者中ctDNA 陽(yáng)性22 例，陽(yáng)性表達(dá)率70.97%（22/31）；非GCB 患者中ctDNA 陽(yáng)性56 例，陽(yáng)性表達(dá)率88.89%（56/63）。非GCB 患者ctDNA陽(yáng)性表達(dá)率高于GCB 患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.724，P=0.030）。免疫組化圖。見(jiàn)圖1。

2.4 DLBCL 患者預(yù)后單因素分析

治療后隨訪(fǎng)1 年，生存78 例，死亡16 例。單因素分析顯示，性別、年齡、B 癥狀、ECOG PS 評(píng)分、IPI 評(píng)分、有無(wú)大包塊與DLBCL 患者預(yù)后無(wú)關(guān)（P＞0.05），疾病分期、LDH 水平、Bcl-2/MYC 雙表達(dá)、免疫亞型、ctDNA 陽(yáng)性率對(duì)DLBCL 患者預(yù)后有關(guān)（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 DLBCL 患者預(yù)后單因素分析［n（%）］Table 2 Univariate analysis of prognosis in DLBCL patients［n（%）］

2.5 DLBCL 患者預(yù)后多因素COX 回歸分析

以預(yù)后情況為因變量（賦值：生存=0，死亡=1），將表2 中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的項(xiàng)作為自變量（賦值：疾病分期：Ⅰ～ⅡA=1，ⅡB～Ⅳ=2；LDH 水平：正常=1，升高=2；Bcl-2/MYC 雙表達(dá)：無(wú)=0，有=1；免疫亞型：GCB=1，非GCB=2；ctDNA：陰性=0，陽(yáng)性=1），應(yīng)用COX 回歸模型分析，結(jié)果顯示，免疫亞型為非GCB 型、ctDNA 陽(yáng)性均為DLBCL患者死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 DLBCL 患者預(yù)后多因素COX 回歸分析Table 3 COX regression analysis of multivariate prognostic factors in DLBCL patients

2.6 ctDNA、免疫亞型評(píng)估DLBCL 患者預(yù)后的交互作用

ctDNA 陽(yáng)性為（+），陰性為（-），免疫亞型非GCB 型為（+），GCB 型為（-）。調(diào)整混雜因素后，ctDNA、免疫亞型對(duì)DLBCL 患者不良預(yù)后存在正向交互作用，二者均為（+）時(shí)不良預(yù)后是二者均為（-）時(shí)的49.500 倍，是其他未知因子（OR=1）的34.140 倍（RERI=34.140），協(xié)同效應(yīng)為二者單獨(dú)存在產(chǎn)生效應(yīng)之和的3.390 倍（SI=3.390），在二者共存的不良預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)中有68.97%（AP=68.97%）是由兩者協(xié)同作用引起的。見(jiàn)表4。

表4 ctDNA、免疫亞型評(píng)估DLBCL 患者預(yù)后的交互作用Table 4 Interaction of ctDNA and immune subtypes in evaluating prognosis of DLBCL patients

3 討論

ctDNA 占總cfDNA＜1%，但易擴(kuò)增，隨著二代測(cè)序（Next generation sequencing，NGS）技術(shù)的臨床應(yīng)用，其檢測(cè)靈敏度顯著提高，已成為腫瘤研究領(lǐng)域熱點(diǎn)［10］。DLBCL 是B 淋巴細(xì)胞惡性克隆性增生所致，而B(niǎo) 淋巴細(xì)胞分化成熟過(guò)程中，其IgH受體基因片段過(guò)基因重排形成特異可變性（V）多樣性（D）連接（J）序列?；诖嗽恚琁gH VDJ 序列檢測(cè)可對(duì)B 淋巴細(xì)胞克隆性評(píng)估提供指導(dǎo)，并可作為DLBCL 分子標(biāo)記物。利用VDJ 通用引物將NGS 與VDJ 基因片段擴(kuò)增相結(jié)合，在DLBCL 患者血漿中進(jìn)行ctDNA 檢測(cè)，靈敏度可達(dá)到1×10-6［11］。本研究采用上述特異性的捕獲測(cè)序法進(jìn)行IgH 受體基因VDJ 重排的ctDNA 檢測(cè)，陽(yáng)性率達(dá)82.98%（78/94），與王佳萍等［12］研究一致。分析DLBCL 患者血漿ctDNA 表達(dá)與病理特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)IPI 評(píng)分高風(fēng)險(xiǎn)患者ctDNA 陽(yáng)性表達(dá)率高于IPI 評(píng)分低風(fēng)險(xiǎn)患者，ⅡB～Ⅳ患者ctDNA 陽(yáng)性表達(dá)率高于Ⅰ～ⅡA 患者，Bcl-2/MYC 雙表達(dá)患者ctDNA 陽(yáng)性表達(dá)率高于無(wú)Bcl-2/MYC 雙表達(dá)患者，提示ctDNA 可一定程度反映患者腫瘤負(fù)荷。而王佳萍等［12］研究卻顯示，DLBCL 患者血漿ctDNA 表達(dá)與IPI 評(píng)分、疾病分期無(wú)關(guān)。差異原因可能與選取樣本量及患者個(gè)體差異有關(guān)。上述結(jié)果表明，IgH VDJ 重排的ctDNA 檢測(cè)陽(yáng)性率較高，有助于DLBCL 早期輔助診斷，且可一定程度反映腫瘤負(fù)荷。

腫瘤分子生物學(xué)能夠更準(zhǔn)確地指導(dǎo)DLBCL治療和預(yù)后判斷。本研究結(jié)果提示DLBCL 患者血漿ctDNA 表達(dá)可能與免疫亞型存在一定相關(guān)性。非GCB 型DLBCL 特點(diǎn)在于，多始發(fā)于淋巴結(jié)外組織，易發(fā)生結(jié)外浸潤(rùn)，B 癥狀者占73.3%，Ⅲ、Ⅳ期患者占80.0%；而GCB 型結(jié)外浸潤(rùn)較少，多無(wú)B 癥狀，以Ⅰ、Ⅱ期多見(jiàn)［13］。因此，非GCB 型DLBCL 侵襲性高于GCB 型，這可能是ctDNA 高表達(dá)的重要因素。

COX 回歸模型分析結(jié)果提示DLBCL 患者免疫亞型、ctDNA 表達(dá)對(duì)預(yù)后具有一定預(yù)測(cè)價(jià)值，非GCB 型DLBCL 侵襲性更高，預(yù)后更差，與既往研究［14］一致。研究證實(shí)，IgH 基因重排可作為復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)的生物標(biāo)志物，特異度在98%以上［15］；而在臨床提示復(fù)發(fā)前，存在IgH 基因重排者占比存在較大差 異［16］。Roschewski 等［17］對(duì)108 例DLBCL患者治療2 個(gè)周期時(shí)IgH 基因重排進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)IgH 基因重排可提示早期復(fù)發(fā)，特異度為88%，靈敏度為47%。這些結(jié)果也提示ctDNA 可作為DLBCL 患者預(yù)后預(yù)測(cè)的生物標(biāo)志物，支持本研究結(jié)論。另外，交互作用分析可知，ctDNA、免疫亞型對(duì)DLBCL 患者不良預(yù)后存在正向交互作用。因此，免疫亞型為非GCB 型的DLBCL 患者更應(yīng)注重ctDNA 檢測(cè)，從而為早期干預(yù)提供指導(dǎo)。目前，ctDNA 檢測(cè)在DLBCL 中應(yīng)用價(jià)值已被初步驗(yàn)證，但檢測(cè)過(guò)程較復(fù)雜，尚無(wú)統(tǒng)一檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)及質(zhì)控，且成本高，尚無(wú)法在臨床廣泛應(yīng)用。

綜上可知，DLBCL 患者ctDNA 檢測(cè)陽(yáng)性率較高，且與病理特征、免疫亞型及預(yù)后有關(guān)，有望成為病情進(jìn)展及預(yù)后預(yù)測(cè)標(biāo)志物。