重癥齲患兒唾液TRPA1、NLRP3 的表達(dá)水平及臨床意義

李姣 郭戰(zhàn)坤 魏鵬 李雪莉 李燕

齲齒是兒童常見的口腔疾病，表現(xiàn)為牙體組織進(jìn)行性破壞并產(chǎn)生齲洞。齲齒的發(fā)生和進(jìn)展是多因素共同作用的結(jié)果，不及時(shí)干預(yù)會(huì)導(dǎo)致侵蝕范圍擴(kuò)大、多個(gè)牙齒多個(gè)牙面同時(shí)受累，最終形成重癥齲。重癥齲嚴(yán)重影響患兒的學(xué)習(xí)和生活，也增加遠(yuǎn)期牙齦炎、牙髓炎等疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)［1-2］。因此，深入研究重癥齲的相關(guān)生物學(xué)因素，對(duì)早期識(shí)別疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)、及時(shí)進(jìn)行干預(yù)具有重要意義。相關(guān)的基礎(chǔ)研究結(jié)果顯示，瞬時(shí)電位受體離子通道（transient receptor potential，TRP）家族中的TRPA1 以及Nod樣受體（Nod like receptor，NLR）家族中的NLRP3參與齲齒的進(jìn)展［3-4］。為深入認(rèn)識(shí)TRPA1、NLRP3在重癥齲中的作用，本研究對(duì)重癥齲患兒唾液TRPA1、NLRP3 的表達(dá)水平及臨床意義進(jìn)行分析。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2021 年1 月至2022 年6 月期間在保定市婦幼保健院接受治療的142 例齲齒患兒作為研究對(duì)象，納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合齲齒診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］；②年齡3～7 歲；③未接受過齲齒相關(guān)治療；④留取唾液標(biāo)本；⑤臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并全身性疾病或先天性疾病；②佩戴牙齒矯正器的兒童；③不能配合本研究。根據(jù)齲齒嚴(yán)重程度［5］將142 例齲齒患兒分為重癥組（n=46）和非重癥組（n=96）。另取同期體檢的70 名無齲齒健康兒童作為對(duì)照組（n=70）。三組間一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，取得受試兒童監(jiān)護(hù)人知情同意。

表1 三組一般資料比較（）Table 1 Comparison of general information among the three groups（）

表1 三組一般資料比較（）Table 1 Comparison of general information among the three groups（）

1.2 齲齒嚴(yán)重程度評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

評(píng)價(jià)口腔中發(fā)生齲病的牙數(shù)或者牙面數(shù)，計(jì)算齲失補(bǔ)指數(shù)（decayed-mising-filled teeth，DMFT）［5］=齲壞牙+失牙數(shù)+因齲填 充牙齒，DMFT=0 為無齲 齒、DMFT＜4 為非重 癥齲齒、DMFT≥4 為重癥齲齒。

1.3 唾液樣本收集及檢測(cè)

收集唾液前所有受試者進(jìn)行漱口、清潔口腔，而后將唾液約100 μL 收集于干燥無菌的試管內(nèi)，常溫下按照速度3 500 r/min、半徑10 cm 離心20 min，取上清液用于TRPA1 和NLRP3 檢測(cè)。采用放射免疫法檢測(cè)TRPA1 和NLRP3 的蛋白表達(dá)水平，所有實(shí)驗(yàn)均由同一名人員按照放射免疫法試劑盒（型號(hào)F00014、F00042，上海西唐生物科技公司）說明書完成。

1.4 齲齒患兒臨床資料收集

根據(jù)齲齒患兒的病歷信息收集以下資料：年齡、性別、吃甜食頻率、開始刷牙時(shí)間、每天刷牙次數(shù)、使用含氟牙膏、家長(zhǎng)監(jiān)督刷牙，吃甜食頻率分為＜2 次/天和≥2 次/天，開始刷牙年齡分為＜3 歲和≥3 歲，每天刷牙頻率分為＜2 次和≥2 次，使用含氟牙膏和家長(zhǎng)監(jiān)督刷牙均分為否或是。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以（）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析、兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)；采用Pearson 檢驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)性分析；采用受試者工作特性曲線（ROC）分析唾液TRPA1、NLRP3 對(duì)重癥齲的診斷價(jià)值；采用多因素logistic 逐步回歸分析重癥齲的影響因素。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組唾液TRPA1、NLRP3 表達(dá)水平比較

三組唾液TRPA1、NLRP3 表達(dá)水平比較為：重癥組＞非重癥組＞對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 三組唾液TRPA1、NLRP3 表達(dá)水平比較［（），pg/mL］Table 2 Comparison of TRPA1 and NLRP3 expression levels in saliva of subjects among the three groups［（），pg/mL］

表2 三組唾液TRPA1、NLRP3 表達(dá)水平比較［（），pg/mL］Table 2 Comparison of TRPA1 and NLRP3 expression levels in saliva of subjects among the three groups［（），pg/mL］

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與非重癥組比較，bP＜0.05。

2.2 齲齒患兒唾液TRPA1、NLRP3 表達(dá)水平與DMFT 的相關(guān)性

重癥組齲齒患兒唾液TRPA1、NLRP3 的表達(dá)水平與DMFT 呈正相關(guān)（r=0.351、0.384，P＜0.05）；非重癥組齲齒患兒唾液TRPA1、NLRP3 的表達(dá)水平與DMFT 無明顯相關(guān)性（P＞0.05）。

2.3 唾液TRPA1、NLRP3 表達(dá)水平對(duì)重癥齲的診斷價(jià)值

以齲齒患兒是否重癥作為狀態(tài)變量繪制ROC曲線，唾液TRPA1、NLRP3 表達(dá)水平診斷重癥齲的曲線下面積分別為0.850、0.864，兩項(xiàng)指標(biāo)診斷重癥齲的截?cái)嘀捣謩e為1.41 pg/mL、2.54 pg/mL，靈敏度分別為76.09%、89.13%，特異度分別為83.33%、82.29%。見表3、圖1。

圖1 ROC 曲線Fig. 1 ROC curve

表3 唾液TRPA1、NLRP3 表達(dá)水平診斷重癥齲的ROC 曲線分析Table 3 ROC curve analysis of TRPA1 and NLRP3 expression levels in saliva for diagnosis of severe caries

2.4 發(fā)生重癥齲的單因素分析

重癥組與非重癥組患兒的年齡、性別、開始刷牙年齡、使用含氟牙膏比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；重癥組患兒吃甜食頻率≥2 次/天的比例及唾液TRPA1、NLRP3 表達(dá)水平高于非重癥組，刷牙頻率≥2 次/天、家長(zhǎng)監(jiān)督刷牙比例低于非重癥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

表4 發(fā)生重癥齲的單因素分析［（），n（%）］Table 4 Univariate analysis of severe caries［（），n（%）］

表4 發(fā)生重癥齲的單因素分析［（），n（%）］Table 4 Univariate analysis of severe caries［（），n（%）］

2.5 發(fā)生重癥齲的多因素logistic 回歸分析

以重癥齲為因變量（非重癥齲=0、重癥齲=1），以2.4 單因素分析中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素作為自變量，采用逐步發(fā)進(jìn)行多因素logistic 回歸分析，吃甜食頻率≥2 次/天、唾液TRPA1 表達(dá)水平≥1.41 pg/mL、唾液NLRP3 表達(dá)水平≥2.54 pg/mL 是發(fā)生重癥齲的危險(xiǎn)因素，刷牙頻率≥2 次/天、家長(zhǎng)監(jiān)督刷牙是發(fā)生重癥齲的保護(hù)因素（P＜0.05）。見表5。

表5 發(fā)生重癥齲的多因素logistic 回歸分析Table 5 Multivariate logistic regression analysis of severe caries

3 討論

兒童齲齒是影響兒童口腔健康的常見疾病，其是在多因素作用下出現(xiàn)乳牙牙體組織無機(jī)物脫礦、硬組織崩解并進(jìn)行性破壞而產(chǎn)生齲洞。齲齒形成后如不能及時(shí)對(duì)導(dǎo)致齲齒形成的因素進(jìn)行干預(yù)，會(huì)導(dǎo)致牙體組織破壞范圍擴(kuò)大、多個(gè)牙齒及多個(gè)牙面同時(shí)受累，進(jìn)而形成重癥齲。重癥齲的臨床危害大，不僅直接影響咀嚼功能、不利于恒牙和頜面發(fā)育，還會(huì)增加遠(yuǎn)期牙齦炎、牙髓炎的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重影響患兒身心健康［6-7］。目前，對(duì)齲齒特別是重癥齲分子生物學(xué)機(jī)制的認(rèn)識(shí)不足極大地限制了疾病的早期識(shí)別及靶向治療。

乳牙牙體礦化程度低、硬組織薄、抗酸力弱是導(dǎo)致齲齒形成的內(nèi)在因素，兒童喜食甜食、刷牙習(xí)慣不正確或效果不佳等是導(dǎo)致齲齒形成的外在因素，在兩方面因素共同作用下，致齲微生物大量繁殖、酸性代謝產(chǎn)物大量形成并最終導(dǎo)致牙體組織破壞，產(chǎn)生齲洞［8-9］。國內(nèi)外重癥齲相關(guān)的臨床研究結(jié)果顯示：吃甜食頻率高、刷牙次數(shù)不足、家長(zhǎng)口腔健康意識(shí)不足均會(huì)增加重癥齲的風(fēng)險(xiǎn)［10-12］。本研究中，吃甜食頻率≥2 次/天是發(fā)生重癥齲的危險(xiǎn)因素，而刷牙頻率≥2 次/天、家長(zhǎng)監(jiān)督刷牙是發(fā)生重癥齲的保護(hù)因素，與既往重癥齲相關(guān)因素的研究結(jié)果［10-12］基本吻合。以上研究結(jié)果主要反映重癥齲發(fā)病的外在因素，未能從內(nèi)在因素認(rèn)識(shí)重癥齲的發(fā)病。

致齲微生物大量繁殖是導(dǎo)致齲齒形成的重要生物學(xué)因素，致齲微生物能夠作為上游生物學(xué)信號(hào)引起下游信號(hào)通路活化，進(jìn)而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)激活以及免疫紊亂，最終造成牙體組織損害［13-14］。TRP 家族和NLR 家族在識(shí)別微生物、調(diào)控生物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。TRPA1 和TRPV1 是TRP 家族的重要成員，一項(xiàng)基礎(chǔ)研究［3］證實(shí)TRPA1 在齲齒形成中起促進(jìn)作用、而TRPV1 不發(fā)揮作用；NLRP1、NLRP3、NLRC4 是NLR 家族的重要成員，一項(xiàng)基礎(chǔ)研究［15］證實(shí)NLRP1、NLRC4不參與齲齒形成，另一項(xiàng)基礎(chǔ)研究證實(shí)［4］NLRP3參與齲齒形成。本研究中，重癥齲和非重癥齲患兒唾液中TRPA1 和NLRP3 的表達(dá)水平均較對(duì)照組增加且重癥齲患兒中上述表達(dá)增加更顯著，與既往相關(guān)基礎(chǔ)研究的結(jié)果一致［4，15］，提示TRPA1和NLRP3 高表達(dá)與重癥齲的發(fā)病相關(guān)。

TRPA1 為鈣離子依賴性通道，微生物感染后炎癥介質(zhì)和氧化應(yīng)激產(chǎn)物的釋放能夠刺激TRPA1 表達(dá)，進(jìn)而在牙組織、關(guān)節(jié)軟骨組織等損傷中起促進(jìn)或加重作用［16］。NLRP3 為模式識(shí)別受體，識(shí)別微生物等病原模式分子后使下游炎癥小體活化，進(jìn)而激活炎癥反應(yīng)及細(xì)胞焦亡，進(jìn)而在牙組織、心肌組織等損傷中起促進(jìn)或加重作用［17］。本研究結(jié)果提示TRPA1 和NLRP3 高表達(dá)可能通過激活炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)等方式導(dǎo)致重癥齲的進(jìn)展。進(jìn)一步通過ROC 曲線分析及影響因素分析可知：唾液中TRPA1 和NLRP3 的表達(dá)水平對(duì)重癥齲具有診斷價(jià)值，TRPA1 和NLRP3 高表達(dá)是發(fā)生重癥齲的危險(xiǎn)因素。

綜上所述，重癥齲患兒唾液中TRPA1、NLRP3表達(dá)增加，重癥齲發(fā)病可能與TRPA1、NLRP3 表達(dá)增加介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)相關(guān)，這可為今后臨床重癥齲新的防治靶點(diǎn)研發(fā)提供依據(jù)。