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    罕見地貧分析和檢測(cè)研究進(jìn)展

    2023-12-12 14:15:09陳華葉胡俊杰
    分子診斷與治療雜志 2023年10期
    關(guān)鍵詞:珠蛋白表型探針

    陳華葉 胡俊杰

    珠蛋白生成障礙性貧血(以下簡(jiǎn)稱地貧)是全球分布范圍最廣、累積人群最多的一種單基因隱性遺傳病,據(jù)報(bào)道全球已檢測(cè)出地貧缺失和突變類型超過350 種,我國(guó)境內(nèi)也檢測(cè)出超過90種[1-3]。基因檢測(cè)技術(shù)是實(shí)現(xiàn)地貧精準(zhǔn)檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn),國(guó)內(nèi)常用的地貧基因檢測(cè)試劑盒一般僅針對(duì)中國(guó)人群中常見的23 種地貧基因型進(jìn)行檢測(cè),而罕見地貧基因攜帶者一般表現(xiàn)正?;蚓哂胁煌潭鹊呢氀劝Y狀,在臨床檢測(cè)中較難發(fā)現(xiàn)。本文將介紹目前罕見地貧基因檢測(cè)的常用方法,并對(duì)相關(guān)罕見型地貧的分析檢測(cè)進(jìn)行經(jīng)驗(yàn)總結(jié),以期為地貧高發(fā)地區(qū)的臨床檢測(cè)工作提供參考依據(jù)。

    1 罕見地貧基因常用檢測(cè)技術(shù)

    目前報(bào)道中常用的幾種檢測(cè)技術(shù)包括:基因測(cè)序技術(shù)、跨越斷裂點(diǎn)法(gap polymerase chain reaction,Gap-PCR)、多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)等。

    1.1 基因測(cè)序技術(shù)

    1.2 Gap-PCR 法

    Gap-PCR 法是一種操作簡(jiǎn)單且對(duì)設(shè)備要求低的檢測(cè)方法,使用時(shí)根據(jù)不同罕見缺失型地貧基因特點(diǎn),在其缺失片段兩端設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物,若發(fā)生該片段缺失,則兩端引物相互靠近形成有效擴(kuò)增。經(jīng)PCR 擴(kuò)增后可形成特定大小的核酸片段,再通過瓊脂糖凝膠電泳,根據(jù)電泳片段大小來判斷對(duì)應(yīng)的基因型。Gap-PCR 法可以對(duì)--THAL、HKαα、中國(guó)型Gγ+(Aγδβ)0 和SEA-HPFH 在內(nèi)的多種缺失型地貧進(jìn)行檢測(cè),實(shí)驗(yàn)條件一般的實(shí)驗(yàn)室也可開展,但需要人工進(jìn)行結(jié)果判讀,因此要求檢測(cè)者具有專業(yè)的判斷能力。

    1.3 MLPA 技術(shù)

    MLPA 技術(shù)是一種多重PCR 分析法,可以檢測(cè)罕見缺失型α 和β 地貧基因。該法檢測(cè)過程中單次反應(yīng)可利用多達(dá)40 個(gè)探針來評(píng)估每個(gè)DNA序列的相對(duì)拷貝數(shù)。每個(gè)探針對(duì)不同的DNA 序列具有特異性(針對(duì)目的基因的外顯子序列),主要由兩個(gè)半探針(5′和3′半探針)組成,并包含靶標(biāo)特異性序列和通用引物序列。反應(yīng)時(shí)兩個(gè)半探針能夠識(shí)別連續(xù)的靶標(biāo)特異性序列,并且只有在完全匹配且沒有單個(gè)缺口的情況下,雜交后才能將兩個(gè)半探針連接并擴(kuò)增。此外一個(gè)或兩個(gè)半探針包含填充序列,該填充序列用于在電泳過程中區(qū)分探針自身的長(zhǎng)度,分辨擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。MLPA 反應(yīng)的關(guān)鍵點(diǎn)是PCR 不會(huì)擴(kuò)增靶序列,但會(huì)擴(kuò)增連接的探針,通過對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的分析,從而得出目的片段異常的結(jié)果[8]。

    2 罕見地貧的表現(xiàn)型分析和檢測(cè)

    2.1 一般罕見缺失型地貧

    2.1.1 泰國(guó)型α 地貧

    泰國(guó)型α 地貧(--THAI)是東南亞地區(qū),也是我國(guó)南方地區(qū)發(fā)現(xiàn)較多的α 珠蛋白基因大片段缺失型(缺失的長(zhǎng)度約為33.45 kb,涉及兩個(gè)α-珠蛋白基因以及ζ2 基因)地貧[9-10]。分子機(jī)制上受α-珠蛋白大片段缺失的影響,泰國(guó)型α 地貧在臨床上具有和東南亞型α 地貧相似的表現(xiàn)型,易形成中重型α 地貧。若復(fù)合-α3.7 或-α4.2 片段缺失,則產(chǎn)生類似HbH 病表型,若復(fù)合東南亞缺失型(--SEA),則可導(dǎo)致水腫胎的發(fā)生[11-12]。杜麗等[13]對(duì)三個(gè)疑似有罕見缺失型地貧或水腫胎生育史的家庭進(jìn)行家系分析以及產(chǎn)前診斷,成功檢測(cè)出三個(gè)家庭中泰國(guó)缺失型α 地貧攜帶者以及確診其中兩組家庭胎兒基因型為--THAI/αα,表明泰國(guó)缺失型α 地中海貧血的準(zhǔn)確檢測(cè)對(duì)于遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷具有重要的意義。

    疑似--THAI 型主要表現(xiàn):生育過Bart’S 水腫胎的夫婦,常規(guī)α 地貧基因檢測(cè)顯示基因型正常的一方;或生育過類似HbH 病表型的患兒,常規(guī)α 地貧基因檢測(cè)顯示一方攜帶-α3.7 或-α4.2 片段缺失,另外一方基因型正常。上述情況首選Gap-PCR 法進(jìn)行檢測(cè),若結(jié)果均排除泰國(guó)型α 地貧,則使用MLPA進(jìn)一步檢測(cè)是否存在其他罕見缺失型α 地貧。

    2.1.2 香港型α 地貧

    香港型α 地貧(HKαα)由Wang 等[14]于2005年發(fā)現(xiàn)并鑒定,其發(fā)生機(jī)制主要涉及α 珠蛋白等位基因的罕見重排,形成包含-a3.7 又包含αααanti-4.2 的交叉連接。當(dāng)-a3.7 和αααanti-4.2 片段位于同一條染色體上時(shí)即形成HKαα,而位于兩個(gè)染色體上時(shí),則形成-a3.7/αααanti-4.2。由于常規(guī)地貧基因檢測(cè)中僅檢測(cè)--SEA、-α3.7 和-α4.2 缺失,因此HKαα 和-a3.7/αααanti-4.2 可能均被誤診為-a3.7/αα。香港型α 地貧在我國(guó)華南地區(qū)檢出較多,有研究報(bào)道廣東地區(qū)人群檢測(cè)出-α3.7 陽性樣本中HKαα 發(fā)生率達(dá)2.27%,福建和廣西等地檢測(cè)出HKαα 等位基因發(fā)生率分別為 0.33% 和0.07%[15-17]。一般HKαα 的臨床癥狀表現(xiàn)較輕,但HKαα/--SEA 在臨床檢測(cè)上常被誤診為HbH 病,因此需要與-α3.7/αα 進(jìn)行鑒別診斷,避免導(dǎo)致錯(cuò)誤的產(chǎn)前診斷結(jié)論和遺傳咨詢建議。

    疑似HKαα 型主要表現(xiàn):常規(guī)地貧基因檢測(cè)中瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果一般顯示“正常帶+3.7 帶”兩條帶,其中3.7 條帶較弱;或顯示“正常帶+3.7帶+SEA 帶”三條帶,可設(shè)計(jì)特異性引物并采用Gap-PCR 法進(jìn)行驗(yàn)證。

    2.1.3 中國(guó)型Gγ+(Aγδβ)0 地貧和東南亞缺失型HPFH 地貧

    (2) 設(shè)置4個(gè)處理:0(CK)、100 μmol/ L 褪黑素(MT)、280 μmol/L硝基苯酚(NP)、280 μmol/ L 硝基苯酚 + 100 μmol/L褪黑素(NP + MT)。不同實(shí)驗(yàn)組各處理6株水稻幼苗,分別處理5 d后測(cè)定水稻幼苗生理指標(biāo)。褪黑素濃度基于預(yù)實(shí)驗(yàn)確定,處理前用無水乙醇助溶MT或NP(對(duì)照組加等量無水乙醇),然后加蒸餾水配制成實(shí)驗(yàn)所需濃度。

    中國(guó)人群中最普遍的β 珠蛋白基因簇缺失主要包括中國(guó)型Gγ+(Aγδβ)0 地貧和東南亞缺失型HPFH 地貧(SEA-HPFH)[18]。中國(guó)型Gγ+(Aγδβ)0地貧的β 珠蛋白基因的缺失范圍約為78.9 kb,包括部分Aγ 球蛋白基因,所有δ 和β 球蛋白基因以及在β 球蛋白基因下游很遠(yuǎn)的具有調(diào)控功能的DNA 序列[19]。中國(guó)型Gγ+(Aγδβ)0 地貧攜帶者一般臨床癥狀較輕,血液學(xué)檢查呈小細(xì)胞低色素性貧血表型,并伴有A γ、G γ 珠蛋白基因的高表達(dá)以及HbF 異常升高等特征。國(guó)內(nèi)報(bào)道中如韋媛等[20]研究得出廣西地區(qū)中國(guó)型Gγ+(Aγδβ)0 地貧攜帶率為0.07%,陳劍虹等[21]報(bào)道廣東惠州地區(qū)中國(guó)型Gγ+(Aγδβ)0 地貧攜帶率為0.14%。由于中國(guó)型Gγ+(Aγδβ)0 地貧雜合子攜帶者與其他類型β 地貧攜帶者結(jié)合時(shí)可能會(huì)生出中重型地貧患兒,因此有必要對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)家庭進(jìn)行產(chǎn)前診斷。

    東南亞缺失型HPFH 地貧中β 珠蛋白的缺失長(zhǎng)度約為27 kb,范圍包括β 珠蛋白基因簇的β 基因及其3-HS-1 區(qū)域[22]。有研究將SEA-HPFH 地貧和中國(guó)型Gγ+(Aγδβ)0 地貧進(jìn)行比較,結(jié)果顯示兩者M(jìn)CV、MCH、HbA2 和HbF 的表達(dá)水平均存在顯著差異[23]。前者的相關(guān)血液學(xué)參數(shù)處于正常范圍或臨界水平,相對(duì)于后者表現(xiàn)出更輕的臨床癥狀,但HbF 具有更高的表達(dá)水平。此外SEA-HPFH合并其他β 地貧基因時(shí),臨床主要表現(xiàn)為輕度或中度貧血,與中國(guó)型Gγ+(Aγδβ)0 地貧有所區(qū)別[24]。盡管如此,血液學(xué)的差異仍不足以明確區(qū)分SEA-HPFH 地貧和中國(guó)型Gγ+(Aγδβ)0 地貧,需要通過基因檢測(cè)進(jìn)行鑒別。所以對(duì)于中國(guó)南方地貧高發(fā)地區(qū)人群,若發(fā)現(xiàn)HbF 水平明顯增高的病例,在進(jìn)行常見地貧基因檢測(cè)外,有必要進(jìn)行SEA-HPFH地貧和中國(guó)型Gγ+(Aγδβ)0 地貧基因檢測(cè)。

    疑似Gγ+(Aγδβ)0 型和SEA-HPFH 型主要表現(xiàn):血細(xì)胞分析為小細(xì)胞低色素貧血,血紅蛋白電泳結(jié)果顯示HbF 異常增高,但常規(guī)β 地貧基因檢測(cè)結(jié)果顯示為正常型;或生育過β 重型地貧患兒,常規(guī)β 地貧基因檢測(cè)顯示基因型正常的一方。首選Gap-PCR 法進(jìn)行檢測(cè),若檢測(cè)結(jié)果均排除中國(guó)型Gγ+(Aγδβ)0 地貧和東南亞缺失型HPFH 地貧,則使用MLPA 進(jìn)一步檢測(cè)是否存在其他罕見缺失型β 地貧。

    2.2 其它罕見型地貧

    2.2.1 融合基因型

    融合基因型產(chǎn)生于珠蛋白基因重組,即同源序列發(fā)生非交叉互換,致使珠蛋白基因結(jié)構(gòu)序列增加呈多樣性改變。珠蛋白基因結(jié)構(gòu)中ζ2-珠蛋白和ψζ1-珠蛋白基因之間以及α1 珠蛋白和α2 珠蛋白基因之間同源性序列較多,兩個(gè)ζ-和兩個(gè)α基因之間易發(fā)生同源重組,進(jìn)而產(chǎn)生融合基因突變[25]。例如Huang 等[26-27]發(fā)現(xiàn)的一例地貧融合基因患者(湖南地區(qū))經(jīng)鑒定是由α 珠蛋白基因的α2段與Ψα1 段序列發(fā)生融合所致,合并--SEA 缺失時(shí)產(chǎn)生類似HbH 病的癥狀,相似病例在海南地區(qū)也有報(bào)道。

    疑似融合基因型主要表現(xiàn):攜帶者一般表現(xiàn)為靜止型地貧癥狀,血細(xì)胞分析可呈現(xiàn)小細(xì)胞低色素性貧血。當(dāng)合并--SEA 缺失時(shí)可能產(chǎn)生類似HbH 病的癥狀(嚴(yán)重時(shí)需要輸血治療),但常規(guī)地貧基因檢測(cè)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)型地貧,可用Sanger 測(cè)序法進(jìn)行序列分析。

    2.2.2 珠蛋白基因突變或缺失型

    隨著基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和推廣使用,越來越多的珠蛋白基因突變或缺失被檢測(cè)并鑒定,例如楊敏和陳揚(yáng)等[28-29]采用高通量測(cè)序技術(shù)在湖南和海南地區(qū)檢測(cè)出多種罕見地貧基因型。與融合基因產(chǎn)生機(jī)制不同,珠蛋白基因突變或缺失可發(fā)生在珠蛋白基因組上任何區(qū)域,編碼區(qū)或非編碼區(qū)的基因突變通常會(huì)導(dǎo)致不同的致病效果。除遺傳因素影響外,珠蛋白基因還有自發(fā)突變的可能,導(dǎo)致表型正常的父母,其后代因基因突變表現(xiàn)出中重型地貧,因此對(duì)罕見地貧家系研究需要更加全面。

    疑似珠蛋白基因突變或缺失型主要表現(xiàn):①排除缺鐵性貧血,血細(xì)胞分析為小細(xì)胞低色素貧血,血紅蛋白電泳結(jié)果顯示HbA2<2.5 或HbA2>3.5,但常規(guī)地貧基因檢測(cè)結(jié)果顯示為正常型;②常規(guī)地貧基因檢測(cè)結(jié)果為輕型或標(biāo)準(zhǔn)型地貧,但實(shí)際具有中間型或重型地貧表型,伴有嚴(yán)重貧血或需要輸血治療;③常規(guī)地貧基因檢測(cè)顯示父母基因型正?;蛞环秸#雠R床表型為中間型或重型地貧患兒(排除非親緣因素影響);④血細(xì)胞分析正?;虍惓?,血紅蛋白電泳出現(xiàn)異常條帶,但常規(guī)地貧基因檢測(cè)顯示為正常或輕型地貧。上述情況使用Sanger 測(cè)序進(jìn)行珠蛋白測(cè)序分析以鑒定患者最終基因型。

    3 小結(jié)與展望

    罕見地貧分析對(duì)患者現(xiàn)階段的治療和產(chǎn)前診斷都具有重要意義,在臨床診治和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)過程中,為防止罕見地貧的漏診和誤診,務(wù)必要結(jié)合具體臨床表型及生育史進(jìn)行綜合分析。收集患者相應(yīng)的臨床表型資料如常規(guī)地貧基因檢測(cè)、血細(xì)胞分析、血紅蛋白電泳、血清鐵檢測(cè)、鐵蛋白檢測(cè)時(shí),若發(fā)現(xiàn)基因型和臨床表型不相符等情況,應(yīng)高度懷疑其攜帶罕見地貧基因,并根據(jù)其表型特點(diǎn)選擇合適的檢測(cè)方法以提高罕見地貧基因的檢出效率。在未來工作中,地貧高發(fā)地區(qū)根據(jù)本地實(shí)際情況,可增加地貧基因突變檢測(cè)類型,有條件的可以為受檢者一次性提供α 和β 地貧基因的高通量測(cè)序檢測(cè)。同時(shí)盡可能建立以高通量測(cè)序技術(shù)為主導(dǎo)的地貧檢測(cè)模式,這對(duì)充分發(fā)掘地貧遺傳資源并促進(jìn)全面地貧防控具有重要作用。

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