延胡索總生物堿對慢性癲癇大鼠皮層NLRP3/caspase-1/GSDMD介導的細胞焦亡的影響*

齊雅芝， 唐婭， 李君， 曹睿， 翟燕玲， 韓玉生△， 徐強△

（1黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2黑龍江中醫(yī)藥大學佳木斯學院，黑龍江 佳木斯 154007）

癲癇作為臨床常見的慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，是由于大腦中間歇性的高同步化異常神經(jīng)元放電，導致患者長期反復的癲癇發(fā)作，并且伴有認知功能和行為障礙。臨床上約有30%的患者對抗癲癇藥物（anti-seizures drug， ASDs）產(chǎn)生耐藥性，而且部分患者經(jīng)過ASDs治療后并未起到有效緩解的作用。研究顯示神經(jīng)炎癥在癲癇發(fā)生與發(fā)展中起到越來越重要的作用［1］，炎癥反應可以引起神經(jīng)元異常放電，從而破壞神經(jīng)連接導致神經(jīng)元損傷和膠質(zhì)細胞增生［2］。新近研究顯示在癲癇的病理過程中神經(jīng)細胞發(fā)生焦亡，同時引起促炎細胞因子分泌增加，進一步激活神經(jīng)炎癥反應［3］。經(jīng)典細胞焦亡途徑為炎癥小體激活pro-caspase-1為caspase-1，caspase-1可以促進細胞因子的成熟，并且能通過切割消皮素D（gasdermin D，GSDMD），使成熟的細胞因子由GSDMD N端形成的蛋白孔釋放，協(xié)同作用下導致神經(jīng)炎癥的發(fā)生并驅(qū)動神經(jīng)細胞焦亡［4］。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domainlike receptor protein 3， NLRP3）是在癲癇的發(fā)病過程中起到重要作用的炎癥小體，由NLRP3、含caspase募集結(jié)構(gòu)域的凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain， ASC）和磷酸化的caspase-1前體組成。研究顯示NLRP3炎癥小體的激活可以促進促炎細胞因子的分泌，從而導致神經(jīng)炎癥的發(fā)生［5］，而NLRP3/caspase-1/GSDMD通路蛋白的轉(zhuǎn)錄和表達可通過核因子κB（nuclear factor-κB， NF-κB）通路來激活［6］。

延胡索為罌粟科植物的干燥根莖，其性辛、苦和溫，歸心、肝和脾經(jīng)，具有活血散瘀、理氣止痛的功效，臨床上主要用于治療心血管疾病、炎癥和睡眠障礙等，且安全性良好［7］。延胡索總生物堿（total alkaloids ofRhizoma Corydalis， TAC）是從中藥延胡索提取分離的活性成分，黃連堿、巴馬汀和表小檗堿是其中的重要組成部分［8-9］，均有一定的抗炎作用［10-11］。研究表明，表小檗堿可通過調(diào)控CD39-NLRP3-GSDMD焦亡路徑減輕膿毒癥肺損傷［12］；鹽酸巴馬汀也可通過抑制NLRP3炎癥小體所誘導的炎癥通路，對脊髓神經(jīng)細胞起到保護作用［13］。本實驗采用戊四氮（pentetrazol， PTZ）建立慢性癲癇大鼠模型，研究延胡索總生物堿對慢性癲癇大鼠的治療作用，進一步探討其對NLRP3/caspase-1/GSDMD介導的細胞焦亡的影響及可能機制。

材料和方法

1 動物

SPF級8周齡雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量（250±10） g，由遼寧長生生物技術股份有限公司提供，動物許可證號為SCXK（遼）2020-0001。大鼠飼養(yǎng)溫度20~24 ℃，濕度50%~60%，常規(guī)飼養(yǎng)于標準環(huán)境1周，自由飲食飲水。

2 主要試劑

TAC由黑龍江中醫(yī)藥大學實驗實訓中心提供，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學田明教授鑒定純度為85%；PTZ（酷爾化學科技有限公司，批號：GT633714）；TUNEL檢測試劑盒（Roche，批號：10768100）；NF-κB p65、NLRP3和pro-caspase-1多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司，貨號：BA0610、BA3677和BM4291）；抗GSDMD-N抗體（北京安諾倫生物科技有限公司，貨號：DF13758）；抗caspase-1 p20、GSDMD、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）、白細胞介素18（interleukin-18， IL-18）、IL-1β和β-actin兔多克隆抗體及山羊抗兔HRP標記IgG（北京博奧森生物技術有限公司，貨號：bs-10743R、bs-14287R、bs-10802R、bs-0529R、bs-0812R、bs-0061R和bs-0296GHRP）；TRIpure Reagent、SuperM-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNase inhibitor和2×Power Taq PCR Master Mix（北京百泰克生物技術有限公司，貨號：RP1001、PR6502、RP5602和PR1702）；SYBR Green qPCR Master Mix（北京索萊寶科技有限公司，貨號：SY1020）。

3 主要儀器

DNM-9602型酶標儀（北京普朗新技術有限公司）；正置熒光顯微鏡FR-4A（上海光學儀器廠）；YD-1508B型組織切片機（浙江金華益迪醫(yī)療設備廠）；MoticBA400顯微攝影成像系統(tǒng)（Motic）；iCEN-24R型臺式高速冷凍離心機（杭州奧盛儀器有限公司）；Tanon EPS-300型電泳儀、Tanon VE-186電泳槽、Tanon VE-180B轉(zhuǎn)膜槽和Tanon-4600凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；Exicycler 96熒光定量PCR儀（BIONEER）。

4 主要方法

4.1 模型制備及評價 24只大鼠適應性飼養(yǎng)7 d后進行編號、稱重，模型組大鼠每天腹腔注射PTZ溶液（35 mg/kg），連用28 d［14］。注射完畢后將大鼠迅速置于透明盒子中觀察。本研究通過監(jiān)測各組大鼠最后一次給藥后癲癇發(fā)作的持續(xù)時間和強度，根據(jù)Racine評分標準判斷大鼠的癲癇發(fā)作等級［15］：0級，無發(fā)作反應；Ⅰ級，出現(xiàn)咀嚼、節(jié)律性面部抽搐等癥狀；Ⅱ級，出現(xiàn)咀嚼、頭部點頭癥狀并伴隨更嚴重的面部肌肉抽搐；Ⅲ級，出現(xiàn)單側(cè)前肢陣攣但不伴隨直立；Ⅳ級，出現(xiàn)雙側(cè)前肢陣攣伴隨直立；Ⅴ級，出現(xiàn)周身強直性陣攣、直立或跌倒；Ⅵ級，死亡。以大鼠在28 d內(nèi)至少出現(xiàn)3次嚴重程度不低于Ⅳ級的連續(xù)癲癇發(fā)作為造模成功的標準，成功造模18只。

4.2 分組及給藥方法 將模型制備成功的18只大鼠隨機分為模型（model）組、低劑量TAC（low-dose TAC， TAC-L）組和高劑量TAC（high-dose TAC， TACH）組，另設正常（normal）組，每組6只。參照參考文獻［16］，TAC低、高劑量組大鼠分別灌胃給予劑量為7和14 mg/kg的TAC溶液，每日1次，連續(xù)給藥14 d，正常組和模型組每天灌胃給予等體積的生理鹽水。

4.3 全面強直陣攣發(fā)作（generalized tonic-clonic seizures， GTCS）和極小陣攣發(fā)作（minimal clonic seizures， MCS）潛伏期 每次PTZ腹腔注射后，參照文獻［17］及Racine分級標準，觀察各組大鼠GTCS潛伏期和MCS潛伏期。

4.4 HE染色觀察病理學變化 取各組大鼠腦組織經(jīng)4%多聚甲醛固定24 h，常規(guī)脫水、透明、浸蠟和石蠟包埋后切片，進行HE染色。在顯微鏡下觀察各組大鼠顳葉皮層腦組織的病理學變化。

4.5 TUNEL法觀察細胞凋亡 根據(jù)TUNEL檢測試劑盒說明進行操作，在光鏡下觀察大腦皮層區(qū)神經(jīng)元凋亡情況，每組大鼠取6張不連續(xù)切片進行檢測，計算每張切片3個不同視野中的神經(jīng)細胞凋亡百分比，取其平均值進行統(tǒng)計分析。

4.6 免疫組化（immunohistochemictry， IHC）檢測各組大鼠皮層組織中NF-κB p65、NLRP3、GSDMD-N和caspase-1 p20的蛋白表達 采用PV兩步法進行檢測，石蠟切片常規(guī)脫蠟水化后微波修復；滅活內(nèi)源性酶，PBS清洗；滴加Ⅰ抗（NLRP3和GSDMD-N抗體，1∶125；NF-κB p65和caspase-1 p20抗體，1∶100），4 ℃孵育過夜；經(jīng)PBS清洗后滴加Ⅱ抗，37 ℃孵育30 min；DAB顯色、蘇木素復染色；脫水透明后封片。每組選取6例進行檢測，采用Motic3000顯微攝影成像系統(tǒng)200倍鏡下采集圖像，每張切片隨機選取3個不同視野，使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件進行分析，以平均積分吸光度（integral absorbance，IA）代表蛋白表達水平。

4.7 IHC檢測各組大鼠皮層IL-1β、IL-18和TNF-α水平 同4.6操作，檢測各組大鼠皮層區(qū)IL-1β、IL-18和TNF-α水平。

4.8 Western blot檢測各組大鼠顳葉皮層NF-κB p65、NLRP3、GSDMD、GSDMD-N、pro-caspase-1和caspase-1 p20蛋白表達 取皮層腦組織樣本稱重后于冰上研磨，用RIPA細胞裂解液裂解，冷凍離心機離心后取上清液，BCA蛋白定量法進行定量，金屬浴變性后備用。蛋白樣品制備成功后電泳分離，恒流200 mA轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，脫脂奶粉封閉2 h后分別在兔抗NLRP3、NF-κB p65、pro-caspase-1、caspase-1 p20、GSDMD和GSDMD-N（均1∶1 000）中4 ℃孵育過夜。加入山羊抗兔HRP標記IgG（1∶2 000）在室溫孵育1 h，然后進行ECL化學發(fā)光顯影，所使用內(nèi)參照為β-actin。應用ImageJ軟件對各組條帶進行定量分析，計算目的蛋白對應條帶灰度值與內(nèi)參照條帶灰度值的比值，確定目的蛋白的表達水平。

4.9 RT-qPCR檢測各組大鼠皮層NLRP3、GSDMD和caspase-1的mRNA表達 取新鮮皮層組織，提取總RNA，使用NanoDrop 2000紫外分光光度計測定各樣本中RNA的濃度。將上述所得到的RNA樣本進行反轉(zhuǎn)錄以得到對應的cDNA。使用SYBR Green Master Mix進行PCR擴增，反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)40次。以β-actin作為內(nèi)參照，結(jié)果采用2-ΔΔCt分析相對表達量。上海生工合成引物序列如表1所示。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1. The sequences of the primers for RT-qPCR

5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計學分析。正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1 TAC對PTZ致癇大鼠GTCS和MCS潛伏期的影響

在實驗過程中，正常組未出現(xiàn)癲癇發(fā)作癥狀；與模型組相比，TAC各治療組GTCS潛伏期和MCS潛伏期顯著延長（P<0.01），見表2。

表2 各組大鼠GTCS和MCS潛伏期比較Table 2. Comparison of GTCS and MCS latency of rats in each group （Mean±SD. n=6）

2 TAC對PTZ致癇大鼠皮層病理形態(tài)學的影響

正常組大鼠顳葉皮層腦組織結(jié)構(gòu)清晰，組織無水腫，神經(jīng)細胞排列規(guī)整，胞質(zhì)胞核染色均勻，核仁清晰，未見充血和炎癥細胞浸潤；與正常組相比較，模型組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)疏松，神經(jīng)細胞形態(tài)不規(guī)則，核固縮明顯增多，細胞腫脹深染，小膠質(zhì)細胞和炎癥細胞明顯增多，毛細血管充血擴張；與模型組相比，各TAC組大鼠皮層上述病變均有不同程度減輕，表現(xiàn)為腦組織結(jié)構(gòu)較緊密，染色較均勻，細胞核固縮數(shù)量減少，炎癥細胞和小膠質(zhì)細胞數(shù)量減少，毛細血管充血減輕，高劑量組病變減輕更為顯著，見圖1。

Figure 1. HE staining was used to detect neuronal damage in the cortex of rats in each group （HE staining， scale bar=50 μm）.圖1 TAC減輕癲癇大鼠皮層區(qū)神經(jīng)細胞損傷

3 TAC對PTZ致癇大鼠皮層神經(jīng)細胞凋亡的影響

TUNEL染色結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組大鼠皮層中神經(jīng)細胞凋亡數(shù)量顯著增多（P<0.01）；與模型組相比，TAC低劑量組和高劑量組大鼠皮層中神經(jīng)細胞凋亡數(shù)量顯著減少（P<0.01），見圖2。

4 TAC對PTZ致癇大鼠皮層NF-κB p65、NLRP3、caspase-1 p20和GSDMD-N蛋白表達的影響

IHC結(jié)果顯示，正常組大鼠顳葉皮層區(qū)NF-κB p65、NLRP3、caspase-1 p20和GSDMD-N蛋白表達較低；與正常組相比，模型組大鼠上述各蛋白表達水平顯著升高（P<0.01），陽性細胞呈棕黃色；與模型組相比，TAC各治療組顳葉皮層區(qū)各蛋白表達水平顯著降低（P<0.01），見圖3。

5 TAC對PTZ致癇大鼠皮層IL-1β、IL-18和TNF-α蛋白表達的影響

IHC檢測結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組大鼠皮層中IL-1β、IL-18和TNF-α蛋白表達均顯著升高（P<0.05）；與模型組相比，TAC各治療組大鼠皮層中IL-1β、IL-18和TNF-α蛋白表達均顯著降低（P<0.01），見圖4。

Figure 4. The positive expression of IL-18， IL-1β and TNF-α in the cortex was detected by immunohistochemical staining （scale bar=50 μm）. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs normal group； ##P<0.01 vs model group.圖4 TAC降低癲癇大鼠皮層IL-18、IL-1β和TNF-α蛋白陽性表達

6 TAC對PTZ致癇大鼠皮層NF-κB p65、NLRP3、pro-caspase-1、caspase-1 p20、GSDMD和GSDMDN蛋白表達的影響

Western blot結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組NF-κB p65、NLRP3、pro-caspase-1、caspase-1 p20、GSDMD和GSDMD-N蛋白表達水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）；而TAC治療組上述蛋白表達水平顯著低于模型組（P<0.01），見圖5。

Figure 5. Protein expression of NF-κB， NLRP3， Pro-caspase-1， caspase-1， GSDMD and GSDMD-N in the cortex of rats in each group detected by Western blot. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs normal group； ##P<0.01 vs model group.圖5 TAC降低癲癇大鼠皮層NF-κB、NLRP3、Pro-caspase-1、caspase-1、GSDMD和GSDMD-N蛋白表達

7 TAC對PTZ致癇大鼠皮層NLRP3、caspase-1和GSDMD mRNA表達的影響

RT-qPCR結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠皮層中NLRP3、caspase-1和GSDMD的mRNA表達水平顯著提高（P<0.01）；與模型組比較，TAC各治療組皮層NLRP3、caspase-1和GSDMD的mRNA表達水平顯著降低（P<0.01），見圖6。

Figure 6. Relative mRNA expression of NLRP3， caspase-1 and GSDMD in the cortex of rats in each group detected by RT-qPCR.Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs normal group； ##P<0.01 vs model group.圖6 TAC降低癲癇大鼠皮層NLRP3、caspase-1和GSDMD的mRNA表達

討論

癲癇是一種復雜的臨床綜合征。國際抗癲癇聯(lián)盟認為神經(jīng)元死亡是導致癲癇反復發(fā)作的易感性基礎，殘存的神經(jīng)元和增生的膠質(zhì)細胞等形成異常的神經(jīng)網(wǎng)絡，可導致癲癇的進一步發(fā)生發(fā)展［18］。神經(jīng)細胞焦亡與癲癇的發(fā)生與發(fā)展有關，在神經(jīng)細胞焦亡過程中伴隨著大量促炎細胞因子的釋放，激活炎癥小體從而引起神經(jīng)炎癥級聯(lián)反應［19］。NLRP3炎癥小體能使磷酸化的caspase-1去磷酸化而活化，導致促炎細胞因子轉(zhuǎn)變?yōu)樗鼈兊某墒煨问?，同時活化的caspase-1扣住GSDMD，并將其切割，細胞因子由GSDMD-N形成的蛋白孔釋放，進一步激活NLRP3炎癥小體［4］。GSDMD是炎性caspases的底物和焦亡的促發(fā)因子［20］，GSDMD孔N端釋放的細胞因子IL-1β和IL-18可促進焦亡［21］。而炎癥介質(zhì)的過度釋放可激活NMDA受體和Toll樣受體等特定信號傳導來參與神經(jīng)元的興奮，導致癲癇發(fā)作的持續(xù)進展［22］。

本實驗結(jié)果顯示，與正常組相比較，癲癇模型大鼠腦組織中TNF-α、IL-18和IL-1β蛋白表達均顯著增加，且NLRP3、caspase-1 p20和GSDMD蛋白及mRNA表達也顯著增加。這表明PTZ所誘導的慢性癲癇大鼠腦組織中有神經(jīng)細胞焦亡的發(fā)生，同時伴隨著大量促炎細胞因子的釋放，通過NLRP3炎癥小體的激活加劇炎癥級聯(lián)反應，從而進一步促進焦亡的發(fā)生和發(fā)展。

細胞焦亡是癲癇的重要病理機制之一，如何通過調(diào)控NLRP3炎癥小體的激活來有效地抑制細胞焦亡，是癲癇防治的關鍵。如氨基黃酮可以抑制PTZ所誘導的小鼠癲癇模型中海馬NLRP3炎癥小體的激活，并降低炎癥細胞因子水平［23］。研究表明，NF-κB可以激活NLRP3、ASC、GSDMD、caspase-1和IL-1β等焦亡信號因子而促進細胞焦亡［24-25］，阻斷NF-κB/GSDMD信號可減輕炎癥小體誘導的細胞焦亡［26］，而且NF-κB對神經(jīng)炎癥和認知功能障礙也具有一定的調(diào)節(jié)作用［27］。

TAC所包含多種生物堿成份均具有抗炎和抑制細胞焦亡的藥理作用，如黃連堿也可抑制TNF-α的產(chǎn)生［28］，延胡索提取物可通過NLRP3炎癥通路有效緩解大鼠神經(jīng)根型頸椎?。?9］。本實驗結(jié)果顯示，TAC可以顯著減少模型大鼠癲癇發(fā)作次數(shù)和強度，減輕PTZ所致的神經(jīng)元病理損傷，對癲癇大鼠具有明顯的治療作用，表明TAC可能通過阻斷NLRP3炎癥小體的激活，抑制GSDMD 及caspase-1的活化，減少IL-1β和IL-18炎癥細胞因子的釋放，從而減輕癲癇引起的神經(jīng)細胞焦亡。同時TAC還通過NF-κB信號通路，抑制腦組織中的炎癥級聯(lián)反應，進一步抑制神經(jīng)細胞焦亡的進展。但TAC是否通過調(diào)節(jié)NF-κB所介導的焦亡信號通路發(fā)揮作用仍需進一步確定。

綜上所述，TAC通過NLRP3/caspase-1/GSDMD信號通路，抑制神經(jīng)炎癥級聯(lián)反應，進一步抑制神經(jīng)細胞焦亡，從而對PTZ所誘導的慢性癲癇大鼠起到明顯的治療作用。