混合譜系激酶結構域樣蛋白非壞死性凋亡功能的研究進展*

沈鉞， 陳東良， 陸遠富， 李夏

（遵義醫(yī)科大學基礎藥理教育部重點實驗室暨特色民族藥教育部國際合作聯(lián)合實驗室，貴州 遵義 563000）

壞死性凋亡（necroptosis）是Degterev等［1］于2005年命名的一種細胞程序性死亡形式。細胞凋亡受阻時，壞死性凋亡作為一種備用途徑確保細胞死亡的進展［2］。不同于凋亡對胱天蛋白酶（caspase）活性的依賴，壞死性凋亡的發(fā)生依賴于混合譜系激酶結構域樣蛋白（mixed lineage kinase domain-like protein，MLKL）的磷酸化。MLKL屬于蛋白激酶超家族，是一種不具有激酶功能的假激酶，作為終末專屬效應蛋白在壞死過程中發(fā)揮作用［3-4］。壞死性凋亡啟動后，MLKL與受體相互作用蛋白激酶1（receptor-interacting protein kinase 1， RIPK1）和RIPK3共同形成壞死體，并被RIPK3磷酸化，磷酸化的MLKL同源寡聚后易位至質(zhì)膜并破壞其完整性以誘導細胞壞死性凋亡［5］。與非免疫原性的凋亡不同，壞死性凋亡可導致細胞內(nèi)成分外泄從而引起強烈的炎癥反應［1，6］，參與缺血性再灌注損傷［7］、腎小管間質(zhì)纖維化［8］和肝臟疾?。?］等多種炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展。

MLKL是唯一可以有效執(zhí)行壞死性凋亡的分子［3-4］，一度被視作壞死性凋亡相關疾病的治療靶標。但越來越多的研究證實MLKL在非壞死性凋亡事件中同樣發(fā)揮重要作用，以MLKL為靶點抑制壞死性凋亡的同時也可擾亂其介導的其他功能。因此，本綜述將從MLKL的壞死性凋亡相關功能出發(fā)，梳理MLKL在自噬、內(nèi)體轉運等非壞死性凋亡功能方面的研究進展，探析MLKL發(fā)揮不同功能的機制，為MLKL的深入研究及相關疾病干預策略的合理制定提供啟示。

1 MLKL的壞死性凋亡相關功能

MLKL結構特點決定了其介導的壞死性凋亡激酶級聯(lián)反應的發(fā)生。N末端的四螺旋束（four-helix bundle， 4HB）和C末端的假激酶結構域（pseudokinase domain， PsKD）為MLKL的功能結構域，兩者由兩個α螺旋組成的支撐結構域連接［10］。4HB結構中的疏水部分可與質(zhì)膜的磷脂雙分子層發(fā)生相互作用，實現(xiàn)與質(zhì)膜的結合，此疏水特性是決定MLKL膜定位及膜結合能力的關鍵［11-12］。因此，4HB也被稱為壞死性凋亡的“劊子手”結構域。PsKD在調(diào)控MLKL釋放4HB中發(fā)揮分子開關作用，即調(diào)控MLKL在活化構象和非活化構象之間的切換［10］。支撐螺旋則充當信號傳遞器，將PsKD的磷酸化事件傳遞給4HB結構域［13］，最終推動4HB結構域與質(zhì)膜結合，從而介導壞死性凋亡的發(fā)生［14］。

MLKL磷酸化介導壞死性凋亡發(fā)生的分子機制依賴于RIPK3。RIPK3可磷酸化小鼠MLKL的第345位絲氨酸（Ser345）、Ser347和第349位蘇氨酸（Thr349）［5］或人類MLKL的Ser357和Thr358［12］，誘導PsKD構象發(fā)生變化并解除4HB結構域的自抑制［15-16］?；罨蟮腗LKL在受體酪氨酸激酶TAM（Tyro3， Axl and Mer）的進一步作用下發(fā)生寡聚，寡聚體向質(zhì)膜轉移［11，17］。MLKL的4HB結構域中帶正電荷的殘基區(qū)域嵌入質(zhì)膜帶負電荷的磷脂酰肌醇磷酸鹽或心磷脂［18］，形成孔道［19］。這些孔道允許胞外離子內(nèi)流導致細胞腫脹和膜溶解，最終造成細胞壞死性凋亡［20］。

2 MLKL的非壞死性凋亡相關功能

隨著研究的深入，MLKL的非壞死凋亡相關功能也逐漸在多種病理生理事件中顯現(xiàn)。MLKL的非壞死性凋亡作用與壞死性凋亡并無直接關系，兩者可伴隨也可不伴隨發(fā)生。

2.1 MLKL磷酸化調(diào)節(jié)自噬 自噬是細胞利用溶酶體降解和回收內(nèi)部成分的機制［21］。壞死性凋亡過程中常伴有自噬通量的改變。Ogasawara等［22］的研究顯示，RIPK3可與自噬體標志蛋白——微管相關蛋白1輕鏈3-II（microtubule-associated protein 1 light chain 3-II， LC3-II）競爭SQSTM1/p62蛋白復合物（簡稱P62），形成RIPK3-p62復合體。此種結合隔離了LC3-II與p62的相互作用，阻礙自噬體在溶酶體中降解，最終造成自噬通量的抑制［22］。也有研究表明，觸發(fā)RIPK1/RIPK3依賴性壞死性凋亡伴有自噬增強，而這一自噬促進作用與細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase， ERK）的激活有關［23-24］。此外，MLKL可獨立于壞死性凋亡調(diào)節(jié)自噬。Wu等［25］觀察到，在棕櫚酸（palmitic acid， PA）刺激下，MLKL磷酸化后與自噬體發(fā)生共定位，進而導致自噬體與溶酶體的融合受到阻礙，抑制自噬。并且，該研究還證實了自噬抑制劑氯喹和亮肽素對自噬的抑制作用依賴于MLKL的表達，Mlkl的敲除可導致這兩種自噬抑制劑的作用無法發(fā)揮。然而，也有研究指出，MLKL磷酸化能促進轉運必需內(nèi)體分選復合物（endosomal sorting complex required for transport， ESCRT）介導的膜切割過程中自噬體內(nèi)外膜的分離，使自噬體與溶酶體的融合和隨后的物質(zhì)降解增強，從而增加自噬通量［26］。上述研究中MLKL在調(diào)節(jié)自噬方面表現(xiàn)出的雙向調(diào)控作用可能與實驗細胞類型及刺激手段的不同有關，但具體的調(diào)控機制仍需進一步研究。

2.2 MLKL磷酸化調(diào)節(jié)內(nèi)體轉運 哺乳動物細胞內(nèi)存在著復雜多樣的內(nèi)吞途徑，內(nèi)體轉運在細胞生物合成途徑中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用［27］。研究顯示，在細胞穩(wěn)態(tài)條件下MLKL可獨立于RIPK3活性而參與內(nèi)體運輸過程的調(diào)節(jié)。磷酸化的MLKL能進一步增強含有磷酸化MLKL的細胞外囊泡的產(chǎn)生與釋放，從而降低胞內(nèi)磷酸化MLKL水平，限制其介導的質(zhì)膜滲透和壞死性凋亡的發(fā)生［28］。Gong等［29］的研究表明，MLKL利用囊泡向胞外釋放磷酸化MLKL的能力與ESCRT-III有關。ESCRT-III作為MLKL磷酸化后的下游途徑，介導了含有受損質(zhì)膜的“氣泡”的形成，這一過程有助于維持質(zhì)膜完整性以延緩細胞死亡。MLKL磷酸化后促使囊泡向胞外釋放磷酸化MLKL的機制為細胞產(chǎn)生相對更多的炎癥細胞因子和趨化因子創(chuàng)造了額外的時間窗口，有利于機體對壞死細胞的識別和清理［29-30］。

2.3 MLKL核易位調(diào)節(jié)細胞死亡和基因表達 除易位到質(zhì)膜，MLKL磷酸化后還能易位至細胞核發(fā)揮不同的調(diào)控功能［31］。研究表明，在壞死性凋亡期間，RIPK3和MLKL在細胞核和細胞質(zhì)之間持續(xù)穿梭。當核輸出受到抑制時，RIPK3和MLKL在細胞核中大量積累，在此過程中，胞質(zhì)中MLKL寡聚體組裝受阻，減少了細胞的壞死性凋亡［32］。該研究提示壞死性凋亡信號成分的核易位是調(diào)節(jié)細胞壞死性凋亡的機制之一。MLKL也被證實能以先天免疫傳感器ZDNA結合蛋白1（Z-DNA binding protein 1， ZBP1）/RIPK3依賴的方式活化并發(fā)生核易位，核內(nèi)MLKL破壞核膜觸發(fā)一種由核內(nèi)到核外的死亡途徑［33］。此外，Dai等［34］指出，MLKL可與RNA結合基序蛋白6（RNA binding motif protein 6， RBM6）相互作用而形成MLKL-RBM6復合物，該復合物入核后通過增加mRNA穩(wěn)定性促進細胞間黏附分子1（intercellular adhesion molecule-1， ICAM-1）、血管細胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecule-1， VCAM-1）和E-選擇素在內(nèi)皮細胞中的表達?？傊琈LKL在細胞核的功能不僅涉及調(diào)節(jié)細胞死亡機制，還能影響細胞基因的表達。

2.4 MLKL線粒體易位調(diào)節(jié)活性氧（reactive oxygen species， ROS）生成 線粒體ROS增加是細胞發(fā)生壞死性凋亡時伴有的常見現(xiàn)象，這被證實與MLKL的線粒體易位有關［35-36］。Srivastava等［37］的研究證明，慢性腎病中的持續(xù)炎癥會誘導RIPK3-MLKL復合物易位至線粒體，導致ROS增多并激活絲氨酸-蘇氨酸激酶和鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II，促進α-平滑肌肌動蛋白、膠原蛋白等的表達，加速疾病進展。也有研究顯示，抑制MLKL向線粒體易位有助于恢復酒精所致的肝細胞線粒體功能障礙［38］。敲減Mlkl可降低細胞內(nèi)ROS水平并在一定程度上減少ROS誘導的細胞死亡［39-40］。以上研究結果表明，MLKL的線粒體易位可能是壞死性凋亡期間線粒體功能障礙的關鍵誘發(fā)者。但是，在一項有關MLKL在人類血小板中作用的研究中，Ekhlak等［41］觀察到抑制MLKL不僅顯著延緩凝血酶誘導的血小板止血反應，還造成血小板線粒體跨膜電位被破壞、質(zhì)子泄漏增加和ROS升高，MLKL展現(xiàn)出了穩(wěn)定血小板線粒體功能的作用。上述研究提示，不同研究條件下MLKL對線粒體功能的影響不同，需根據(jù)不同的實驗條件進一步探討其對線粒體具體功能的影響。

2.5 MLKL影響巨噬細胞功能 巨噬細胞是傳統(tǒng)的先天免疫細胞，在清除病原體和維持組織穩(wěn)態(tài)方面起著至關重要的作用［42-43］。MLKL對巨噬細胞功能具有顯著影響，當Mlkl基因敲除或MLKL活性受到抑制時，髓系巨噬細胞吞噬大腸桿菌生物顆粒的能力會被削弱［44］，由此表明MLKL在維持巨噬細胞的吞噬功能中發(fā)揮重要作用。并且，在與巨噬細胞脂質(zhì)代謝相關的機制中，敲減Mlkl會導致動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)及外周巨噬細胞脂質(zhì)運輸異常，造成巨噬細胞中脂質(zhì)蓄積以及向泡沫細胞轉變的增加［45］。另外，MLKL也參與巨噬細胞的表型轉化。Mlkl缺失可推動缺血皮層中小膠質(zhì)細胞從M1型向M2型的轉化，進而起到神經(jīng)保護作用［46］。這些研究結果揭示了MLKL在巨噬細胞中的多重積極作用。

3 MLKL發(fā)揮非壞死性凋亡功能的潛在機制

3.1 磷酸化位點 MLKL具有多個磷酸化位點，而每個位點的磷酸化都可賦予它獨特的生物學效應。表1中總結了目前已鑒定的MLKL磷酸化位點及其相應的功能特性。

表1 MLKL不同磷酸化位點所表現(xiàn)出的作用Table 1. The roles exhibited by different phosphorylation sites on MLKL

多項研究顯示，在不同的細胞類型中，MLKL磷酸化后常伴隨著易位的發(fā)生［11，16，47-48］。蛋白磷酸化修飾后的易位主要是通過調(diào)節(jié)其電荷特性［49-50］、構象或結構性質(zhì)［51-52］等來實現(xiàn)的。已有數(shù)據(jù)支持MLKL的易位與其磷酸化狀態(tài)有關。據(jù)報道，MLKL抑制劑GW806742X能夠以ATP依賴性方式與MLKL的PsKD結合，進而抑制MLKL磷酸化，阻止其向質(zhì)膜轉移［11］，這強化了MLKL易位的磷酸化依賴性特征。因此，一方面，MLKL的功能與其特定的磷酸化位點有關；另一方面，多個磷酸化位點的存在或許是MLKL易位驅動力的重要來源。

3.2 亞細胞定位 MLKL的4HB結構域主要負責與膜的連接，其活化后可與易位途中碰到的細胞器膜結合［12，47］。細胞壞死性凋亡過程中，MLKL可易位至多個亞細胞結構，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體［16］、外泌體［28，58］、細胞核［31-32］和內(nèi)體［28-29，59］等。即便在非壞死性凋亡情境下，研究者也能觀察到MLKL與多個亞細胞結構的共定位［25，44］。

MLKL的功能多樣性與其在各亞細胞結構中的共定位關系緊密。當MLKL活化并易位至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜時，可通過不干擾未折疊蛋白應答（unfolded protein response， UPR）信號傳感器與葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose-regulated protein 78， GRP78）結合的方式激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜應激信號以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)折疊的功能，這與常規(guī)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應需要GRP78從UPR傳感器中解離不同［60］。同樣，感染乙型肝炎病毒和黃曲霉毒素會上調(diào)環(huán)加氧酶2（cyclooxygenase-2， COX-2），導致RIPK3和發(fā)動蛋白相關蛋白1（dynamin-related protein 1， Drp1）表達增加，促使RIPK3-MLKL易位至線粒體并損害其功能，從而引發(fā)脂質(zhì)代謝紊亂［61］。在上述研究中，MLKL對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體功能的影響與其易位后破壞細胞器膜有關。然而，關于MLKL在溶酶體定位后的效應，目前觀點尚未達成統(tǒng)一。有研究指出，MLKL磷酸化后會易位至溶酶體并增加溶酶體膜通透性，致使溶酶體功能紊亂［62］。也有研究證實活化的MLKL與溶酶體共定位后不會對溶酶體的pH和數(shù)量產(chǎn)生明顯影響［16，63］，因此，仍需進一步研究確認MLKL影響溶酶體功能的機制。此外，MLKL與蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase， PERK）/真核翻譯起始因子2α（eukaryotic translation initiation factor 2α， eIF2α）通路之間存在相互調(diào)控。MLKL可促進PERK/eIF2α通路的激活，而該通路的激活又可加強MLKL的核易位并以一種與核膜破壞無關的方式促進細胞凋亡［64］。由此可見，特定條件下向不同細胞器的易位可能是MLKL功能多樣化的關鍵因素之一。

3.3 MLKL的非經(jīng)典激活途徑 MLKL的經(jīng)典活化途徑依賴于RIPK3。2012年，Sun等［53］首次明確了MLKL可以被RIPK3招募并磷酸化以執(zhí)行壞死性凋亡功能，同時也提出了“MLKL可不依賴于RIPK3調(diào)控信號轉導，因為它在不同細胞類型中比RIPK3更廣泛地表達”的設想。隨著MLKL非依賴RIPK3的激活方式的確認，這一設想逐步得到了證實。

Günther等［9］的研究證實，信號轉導及轉錄激活因子1（signal transducer and activator of transcription 1， STAT1）的激活可增加MLKL的蛋白水平。因此，STAT1被視作MLKL的一個重要調(diào)節(jié)因子。同時，Wu等［44］也指出，抑制STAT1可下調(diào)MLKL的磷酸化水平，而單獨抑制RIPK3僅能部分削弱MLKL的磷酸化，表明MLKL至少存在RIPK3依賴的和STAT1依賴的兩種磷酸化途徑。另外，Zhan等［26］的研究顯示，在表達RIPK3的小鼠成纖維細胞L929和不表達RIPK3的小鼠神經(jīng)母細胞瘤N2a細胞中，短期饑餓處理均可導致MLKL以依賴于鈣/鈣蛋白依賴性蛋白激酶II的方式發(fā)生磷酸化。以此種方式磷酸化的MLKL不僅不會誘導細胞的壞死性凋亡，反而能通過促進自噬體成熟來增加自噬通量，最終減緩細胞死亡。此外，磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositiol 3-kinase， PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B， PKB/AKT）也被報道能直接觸發(fā)MLKL的磷酸化并促進血小板向活性止血單位的轉化［41］。該研究顯示，抑制PI3K/AKT可明顯減少凝血酶誘導的MLKL磷酸化，而抑制RIPK3則對MLKL的磷酸化水平影響甚微，揭示了一種與RIPK3無關但依賴PI3K/AKT的MLKL磷酸化途徑。

除上述研究外，一項有關坐骨神經(jīng)損傷的研究也報道了MLKL的非RIPK3磷酸化機制。研究者觀察到MLKL在Schwann細胞軸突損傷后被誘導，并通過Ser441位點磷酸化；激活后的MLKL易位至髓鞘膜與髓磷脂結合，以破壞膜結構的方式加速髓磷脂分解，促進神經(jīng)再生［57］。該研究證實MLKL促進神經(jīng)再生的作用并不依賴于RIPK3，但這一過程中誘導MLKL磷酸化的激酶尚未可知。

MLKL存在多個非依賴于RIPK3的激活途徑。當MLKL通過這些非經(jīng)典激活途徑激活時，其所展現(xiàn)出的功能與壞死性凋亡過程中導致細胞破裂死亡的結局截然不同，這可能是MLKL多樣化功能產(chǎn)生的另一個關鍵因素。

4 總結

如上所述，MLKL的非壞死性凋亡相關功能復雜多樣，具有多個磷酸化位點、能夠與不同的亞細胞器發(fā)生共定位以及非依賴RIPK3的激活途徑的存在可能是MLKL產(chǎn)生不同功能的關鍵因素。目前，MLKL的非壞死性凋亡相關功能雖然被廣泛研究報道，但這些研究大多集中在表達水平及功能，對分子機制的研究仍不夠深入。因此，未來無論是在壞死性凋亡還是非壞死性凋亡的相關功能研究中，都應注意明確MLKL的磷酸化位點及磷酸化后可能帶來的功能轉型；同時，MLKL在細胞內(nèi)的亞定位以及與其他分子或亞細胞結構共定位后產(chǎn)生的潛在的生物效應也應被作為研究的重點；此外，還需深入挖掘除RIPK3以外的MLKL磷酸化激酶?？傊琈LKL的研究尚需廣泛探索，這是將MLKL作為疾病治療靶點的前提。