D-泛酸鈣在黃羽肉雞中的耐受性評價

呂雨杰 葛超悅* 黃國東 趙德勝 吳瀲池 胡兆瑩 羅鑫宇 劉 兵 余東游**

(1.浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,杭州 310058;2.浙江大學(xué)海南研究院,三亞 572025; 3.浙江新和成股份有限公司,紹興 312500;4.黑龍江新和成生物科技有限公司,綏化 152000)

泛酸,俗稱維生素B5,是動物生長過程中不可或缺的一種B族維生素。泛酸是構(gòu)成輔酶A和酰基載體蛋白的成分,并通過它們在代謝中發(fā)揮作用,參與體內(nèi)碳水化合物、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)代謝[1],促進(jìn)機(jī)體對各種營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用。不過,泛酸由于易受酸堿、溫度和濕度影響,所以在實(shí)際生產(chǎn)中常應(yīng)用其衍生物——泛酸鈣添加在家禽飼糧中[2]。D-泛酸鈣是泛酸鈣的手性碳原子的多種形式之一,且僅D-泛酸鈣具有豐富的生物學(xué)活性[3],被主要用于飼料添加劑、食品添加劑和醫(yī)藥行業(yè)等。

研究表明,飼糧中缺乏泛酸鈣會導(dǎo)致家禽出現(xiàn)食欲不振、羽毛生長不良、生長遲緩和生產(chǎn)性能下降等癥狀[4]。在五龍鵝飼糧中添加D-泛酸鈣可顯著改善五龍鵝的生長性能、屠宰性能、脂質(zhì)代謝和抗氧化功能[5]。種雞飼糧中添加50～150 mg/kg的D-泛酸鈣可顯著提高其產(chǎn)蛋率、蛋品質(zhì)和種蛋受精率[6]。本團(tuán)隊前期研究發(fā)現(xiàn),飼糧中添加D-泛酸鈣可提高黃羽肉雞生長性能、肉品質(zhì)、抗氧化能力和免疫能力,且肉雞玉米-豆粕型飼糧中D-泛酸鈣的推薦添加量為15～25 mg/kg[7]。但實(shí)際生產(chǎn)中為最大限度提高畜禽生產(chǎn)性能,往往會過量添加D-泛酸鈣。然而,目前關(guān)于D-泛酸鈣對肉雞的飼用安全性評價尚未見報道。

為此,本試驗(yàn)以1日齡黃羽肉仔雞為研究對象,參照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部《飼料和飼料添加劑畜禽靶動物耐受性評價試驗(yàn)指南(試行)》要求,研究高劑量D-泛酸鈣對肉雞生長性能、血常規(guī)指標(biāo)、血清生化指標(biāo)、器官指數(shù)和組織病理學(xué)的影響,以評價肉雞對D-泛酸鈣的耐受性,為D-泛酸鈣在肉雞生產(chǎn)中的安全應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物及設(shè)計

本團(tuán)隊前期試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),肉雞玉米-豆粕型飼糧中D-泛酸鈣的推薦添加量為15～25 mg/kg[7]。本研究中,將25 mg/kg視為D-泛酸鈣的最高推薦劑量,即有效劑量。根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部《飼料和飼料添加劑畜禽靶動物耐受性評價試驗(yàn)指南(試行)》中的有關(guān)規(guī)定,試驗(yàn)設(shè)置4個組,分別為不添加D-泛酸鈣的對照組(G0組)、有效劑量組(G25組)、5倍有效劑量組(G125組)和10倍有效劑量組(G250組),即D-泛酸鈣的添加水平分別為0、25、125和250 mg/kg(以維生素B5計,本底維生素B5含量:前期8.0 mg/kg,后期6.0 mg/kg)。試驗(yàn)采用單因素完全隨機(jī)設(shè)計,選擇遺傳背景相同、同一批次、發(fā)育正常的1日齡健康黃羽肉公雞(梅黃1號)640羽,隨機(jī)分為4個組,每組8個重復(fù),每個重復(fù)20羽(連續(xù)2籠為1個重復(fù))。試驗(yàn)期70 d,分為1～35日齡(前期)和36～70日齡(后期)2個階段。

1.2 飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)試驗(yàn)在浙江大學(xué)飼料科學(xué)研究所試驗(yàn)基地密閉式雞舍中進(jìn)行,試驗(yàn)雞采用4層立體籠養(yǎng),每個重復(fù)為上下連續(xù)2籠,每籠10只,單籠尺寸為120 cm×80 cm×60 cm,同一組各重復(fù)均勻分布于雞舍。雞舍內(nèi)溫度、濕度、光照和衛(wèi)生學(xué)指標(biāo)符合《商品肉雞生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程》(GB/T 19664—2005)。采用整舍育雛,暖風(fēng)爐水暖控溫,最初進(jìn)雛時舍溫為32 ℃,以后每周降低2 ℃至26 ℃為止,相對濕度保持在50%～60%,試驗(yàn)前7 d采用每天24 h光照,之后逐步降到每天16 h光照,自然通風(fēng)結(jié)合縱向負(fù)壓通風(fēng)。手工喂料,粉料飼喂,自由采食,通過乳頭式飲水器自由飲水。每周帶雞消毒1次,常規(guī)防疫和免疫。

1.3 試驗(yàn)飼糧

試驗(yàn)選用玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧,參照NRC(1994)和《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 33—2004)中黃羽肉雞營養(yǎng)推薦量,并根據(jù)《中國飼料成分及營養(yǎng)價值表(2020年第31版)》配制,基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。配制飼糧時,以D-泛酸鈣適量替代預(yù)混料中的沸石粉;添加的D-泛酸鈣為白色固體粉末,將不同梯度劑量的粉末添加劑借助混料機(jī)均勻拌到固定重量的飼料中,實(shí)現(xiàn)不同D-泛酸鈣水平設(shè)置。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) %

1.4 測定指標(biāo)及方法

1.4.1 飼糧營養(yǎng)成分測定

飼糧中D-泛酸鈣(維生素B5)含量參照GB/T 7299—2006《飼料添加劑D-泛酸鈣》方法測定,粗蛋白質(zhì)含量參照GB/T 6432—2018《飼料中粗蛋白的測定 凱氏定氮法》方法測定,氨基酸含量參照GB/T 18246—2000《飼料中氨基酸的測定》方法測定,鈣含量參照GB/T 6436—2018《飼料中鈣的測定》方法測定,總磷含量按照GB/T 6437—2018《飼料中總磷的測定 分光光度法》方法測定。

1.4.2 生長性能測定

分別于肉雞1、35和70日齡,以重復(fù)為單位對空腹12 h肉雞進(jìn)行稱重,計算平均日增重(ADG);分別于肉雞35和70日齡,以重復(fù)為單位統(tǒng)計階段耗料量,計算平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。

1.4.3 臨床觀察

試驗(yàn)開始后,每天檢查飼槽,根據(jù)需要添加飼料。每天至少對雞群檢查3次,觀察試驗(yàn)動物臨床表現(xiàn)、采食和飲水情況,發(fā)現(xiàn)打蔫雞只,及時淘汰;試驗(yàn)中如出現(xiàn)不明原因的死亡則進(jìn)行尸檢,高倍劑量組的雞只死亡,都要進(jìn)行尸檢,如死亡原因不明,則進(jìn)行組織學(xué)分析。剔除死雞并記錄死亡與發(fā)病的原因及其時間。

1.4.4 血液指標(biāo)測定

分別于肉雞35和70日齡,從每個重復(fù)中隨機(jī)選取1只雞,翅靜脈采血5 mL。血液樣品中,1 mL置于含乙二胺四乙酸(EDTA)的抗凝管中,在采血現(xiàn)場至于冷藏箱中保存,采血完畢后立即送檢,進(jìn)行血常規(guī)指標(biāo)檢測,采用全自動分析儀(Sysmex microcell counter CL-180,美國)測定。

另4 mL血樣置于促凝管中,在室溫中放置30 min后,2 000×g離心15 min制備血清,血清儲存在-80 ℃冰箱中,采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒(產(chǎn)品編號分別為:C009-2-1、C010-2-1、A059-2-2、A028-2-1、C013-2-1、C012-2-1、H183和C019-1-1),按照試劑盒說明書的方法測定血清谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)活性以及總蛋白(TPRO)、白蛋白(ALB)、葡萄糖(GLU)、總膽紅素(TBILI)、尿酸(UA)和肌酐(CRE)含量,并采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定血清維生素B5含量。

1.4.5 屠宰取樣和器官指數(shù)測定

于肉雞70日齡,每個重復(fù)隨機(jī)選取1只雞,頸動脈放血致死,剖檢取心臟、肝臟、脾臟、腎臟、肺臟和胰臟等器官稱重,并計算器官指數(shù),計算公式為:

器官指數(shù)(g/kg)=器官鮮重(g)/宰前活重(kg)。

1.4.6 組織病理學(xué)檢查

在心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟的固定部位取樣,并迅速放入4%多聚甲醛中進(jìn)行固定。將固定好的標(biāo)本經(jīng)水洗、脫水及透明等步驟處理后,再用石蠟包埋,冷卻凝固后,制作厚度為5 μm的連續(xù)切片,并進(jìn)行蘇木精-伊紅染色及樹脂封片。采用光學(xué)顯微鏡觀察心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟組織病理學(xué)形態(tài)變化,并用圖像采集系統(tǒng)采集相應(yīng)組織圖像。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 21.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,并采用LSD檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較,試驗(yàn)結(jié)果用平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤表示,P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧添加D-泛酸鈣對肉雞生長性能的影響

試驗(yàn)期間無肉雞死亡。由表2可知,試驗(yàn)前期(1～35日齡)和全期(1～70日齡),飼糧添加25～250 mg/kgD-泛酸鈣均不同程度地提高了肉雞ADG,降低了F/G。其中,1～35日齡,與對照組相比,飼糧添加25 mg/kgD-泛酸鈣顯著提高ADG(P<0.05),顯著降低F/G(P<0.05);1～70日齡,與對照組相比,飼糧添加25和125 mg/kgD-泛酸鈣顯著提高ADG(P<0.05),飼糧添加125 mg/kgD-泛酸鈣顯著降低F/G(P<0.05)。此外,36～70日齡,各組間肉雞ADG、ADFI和F/G均無顯著差異(P>0.05)。與對照組相比,G250組肉雞試驗(yàn)前期(1～35日齡)、后期(36～70日齡)和全期(1～70日齡)ADG、ADFI和F/G均無顯著差異(P>0.05),這表明飼糧添加250 mg/kgD-泛酸鈣未對肉雞生長性能產(chǎn)生不良影響。

表2 飼糧添加D-泛酸鈣對肉雞生長性能的影響Table 2 Effects of dietary D-calcium pantothenate on growth performance of broilers

2.2 飼糧添加D-泛酸鈣對肉雞血常規(guī)指標(biāo)的影響

由表3可知,35和70日齡時,各組間肉雞血液白細(xì)胞(WBC)數(shù)量、紅細(xì)胞(RBC)數(shù)量、血紅蛋白(HGB)含量、紅細(xì)胞壓積(HCT)和血小板(PLT)數(shù)量均無顯著性差異(P>0.05),表明飼糧添加25～250 mg/kgD-泛酸鈣未對肉雞血常規(guī)指標(biāo)產(chǎn)生不良影響。

表3 飼糧添加D-泛酸鈣對肉雞血常規(guī)指標(biāo)的影響Table 3 Effects of dietary D-calcium pantothenate on blood routine indices of broilers

2.3 飼糧添加D-泛酸鈣對肉雞血清生化指標(biāo)的影響

由表4可知,各組間肉雞35和70日齡血清ALT、AST、ALP活性以及TPRO、ALB、GLU、TBILI、UA和CRE含量均無顯著差異(P>0.05),表明飼糧添加25～250 mg/kgD-泛酸鈣未對肉雞血清生化指標(biāo)產(chǎn)生不良影響。

表4 飼糧添加D-泛酸鈣對肉雞血清生化指標(biāo)的影響Table 4 Effects of dietary D-calcium pantothenate on serum biochemical indices of broilers

2.4 飼糧添加D-泛酸鈣對肉雞血清維生素B5含量的影響

由表5可知,與對照組相比,飼糧添加25～250 mg/kgD-泛酸鈣顯著提高肉雞70日齡血清維生素B5含量(P<0.05),而對35日齡血清維生素B5含量無顯著影響(P>0.05)。

表5 飼糧添加D-泛酸鈣對肉雞血清維生素B5含量的影響Table 5 Effects of dietary D-calcium pantothenate on serum vitamin B5 content of broilers ng/mL

2.5 飼糧添加D-泛酸鈣對肉雞器官指數(shù)的影響

由表6可知,各組間肉雞70日齡心臟指數(shù)、肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)、肺臟指數(shù)、腎臟指數(shù)和胰臟指數(shù)均無顯著差異(P>0.05),表明飼糧添加25～250 mg/kgD-泛酸鈣未對肉雞器官指數(shù)產(chǎn)生不良影響。

表6 飼糧添加D-泛酸鈣對肉雞器官指數(shù)的影響Table 6 Effects of dietary D-calcium pantothenate on organ indices of broilers g/kg

2.6 飼糧添加D-泛酸鈣對肉雞組織病理學(xué)的影響

如圖1所示,各組肉雞心肌纖維排列整齊,結(jié)構(gòu)清楚;如圖2所示,肝細(xì)胞未出現(xiàn)明顯的病理變化,輪廓清晰,結(jié)構(gòu)完好,胞核大小均一;如圖3所示,脾臟結(jié)構(gòu)清楚,皮髓分界清楚,脾小體清晰可見;如圖4所示,肺臟組織肺泡腔可見,未見明顯肺泡隔增厚;如圖5所示,腎臟組織結(jié)構(gòu)清晰,腎小球上皮細(xì)胞未出現(xiàn)炎癥或變性。結(jié)果提示,飼糧添加25～250 mg/kgD-泛酸鈣未對肉雞器官組織產(chǎn)生不良影響。

圖1 飼糧添加D-泛酸鈣對肉雞心臟組織結(jié)構(gòu)的影響Fig.1 Effects of D-calcium pantothenate on heart tissue structure of broilers (100×)

圖2 飼糧添加D-泛酸鈣對肉雞肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響Fig.2 Effects of D-calcium pantothenate on liver tissue structure of broilers (400×)

圖3 飼糧添加D-泛酸鈣對肉雞脾臟組織結(jié)構(gòu)的影響Fig.3 Effects of D-calcium pantothenate on spleen tissue structure of broilers (100×)

圖4 飼糧添加D-泛酸鈣對肉雞肺臟組織結(jié)構(gòu)的影響Fig.4 Effects of D-calcium pantothenate on lung tissue structure of broilers (400×)

圖5 飼糧添加D-泛酸鈣對肉雞腎臟組織結(jié)構(gòu)的影響Fig.5 Effects of D-calcium pantothenate on kidney tissue structure of broilers (400×)

3 討 論

3.1 飼糧添加D-泛酸鈣對肉雞生長性能的影響

D-泛酸鈣即維生素B5,存在于大多數(shù)食物中,參與多數(shù)代謝反應(yīng),特別是脂肪和碳水化合物代謝等能量生成反應(yīng),被認(rèn)為是輔酶A的前體,而在蛋白質(zhì)代謝中發(fā)揮功能較少[8]。有研究證實(shí),在玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧中添加泛酸可緩解鴨生長性能和胸肉產(chǎn)量降低等不良狀況[9];飼糧中添加適宜水平的泛酸可提高飼料利用率,從而有效改善五龍鵝的生長性能[10];并隨著泛酸添加水平的提高,其能夠顯著提高肉仔雞粗蛋白質(zhì)和粗脂肪的代謝率,顯著提升肉雞的增重速度[11]。本研究中,梅黃1號肉雞生長速度與前人報道該品種的生長速度[12]基本一致,即飼糧添加不同水平D-泛酸鈣后肉雞生長性能水平能基本達(dá)到該品種肉雞各日齡段的平均生長性能。本試驗(yàn)中,1～35日齡,飼糧添加25 mg/kgD-泛酸鈣顯著提高了肉雞ADG,顯著降低了F/G,與前述研究一致。此外,1～70日齡,飼糧添加25和125 mg/kgD-泛酸鈣均顯著提高了肉雞ADG,且飼糧添加125 mg/kgD-泛酸鈣顯著降低了F/G。總體而言,在肉雞飼糧中添加10倍最大推薦劑量D-泛酸鈣對試驗(yàn)前期、后期和全期肉雞生長性能均無負(fù)面影響,這表明飼糧添加250 mg/kgD-泛酸鈣具有一定的安全性。

3.2 飼糧添加D-泛酸鈣對肉雞血液指標(biāo)的影響

血清生化指標(biāo)能在一定程度上反映家禽的營養(yǎng)代謝和健康狀況[13]。血清中的ALT和AST主要分布在肝細(xì)胞血漿中,當(dāng)肝細(xì)胞受損時釋放到血液中,是肝臟健康的重要標(biāo)志[14],TBILI也是檢測肝臟功能的重要指標(biāo),血清TBILI含量升高意味著肝臟受損[15]。血清TPRO和ALB含量可以反映飼糧蛋白質(zhì)的代謝狀況[16],同時,血清UA含量也能在一定程度上反映機(jī)體蛋白質(zhì)的代謝表現(xiàn)[17]。ALP是一種普遍存在的酶,可以催化磷酸單酯的水解,用來作為骨骼發(fā)育的通用指標(biāo)[18]。當(dāng)泛酸缺乏時,會導(dǎo)致北京白鴨的葡萄糖吸收異常,表現(xiàn)為腸道葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(GLUT2)的表達(dá)降低,從而導(dǎo)致低血糖,這可能是因?yàn)榉核崾瞧咸烟禽d體系統(tǒng)的一部分[19]。在本試驗(yàn)中,在肉雞飼糧中添加不同水平的D-泛酸鈣,測定肉雞35和70日齡血清各種生化指標(biāo)未有顯著的變化,說明飼糧添加25～250 mg/kgD-泛酸鈣對肉雞肝臟、腎臟等器官和肌肉以及蛋白質(zhì)和脂類代謝等均無不良影響。

血常規(guī)指標(biāo)通常用于確定動物機(jī)體的健康狀況,以此來了解環(huán)境、營養(yǎng)和病理應(yīng)激的程度,而其中營養(yǎng)水平對HCT、HGB含量和RBC數(shù)量等血常規(guī)指標(biāo)有顯著影響[20]。WBC是反映動物機(jī)體炎癥的指標(biāo)之一[21];RBC是血液中含量最多的血細(xì)胞,可以與HGB含量、HCT共同反映動物運(yùn)輸氧氣(O2)和二氧化碳(CO2)的能力,對機(jī)體產(chǎn)生的酸、堿物質(zhì)起緩沖作用[22]。PLT是動物血液中重要成分之一,其在止血、傷口愈合、炎癥反應(yīng)、血栓形成及器官移植排斥等生理和病理過程中有重要作用[23]。有研究表明,泛酸可促進(jìn)谷胱甘肽和輔酶A的合成,清除自由基保護(hù)細(xì)胞免受過氧化損傷以及通過促進(jìn)磷脂合成來修復(fù)細(xì)胞損傷[24]。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),飼糧添加25～250 mg/kgD-泛酸鈣對肉雞血常規(guī)各指標(biāo)均無顯著影響,表明飼糧添加D-泛酸鈣對動物的健康狀況并未產(chǎn)生不利影響。

此外,泛酸屬于水溶性維生素,在體內(nèi)難以原形式儲存,因此血清中維生素B5的含量可以直接反映機(jī)體泛酸水平。在本試驗(yàn)中,35和70日齡時,未添加D-泛酸鈣的對照組肉雞均表現(xiàn)出最低的血清維生素B5含量,且血清維生素B5含量隨著飼糧D-泛酸鈣添加水平的提高而逐漸升高;相較于對照組,飼糧添加25～250 mg/kgD-泛酸鈣對肉雞35日齡血清維生素B5含量無顯著影響,而顯著提高70日齡血清維生素B5含量,但結(jié)合肉雞的生長性能、血常規(guī)和血清生化指標(biāo)發(fā)現(xiàn),血清維生素B5含量的升高對肉雞的生長健康并未產(chǎn)生不良影響。

3.3 飼糧添加D-泛酸鈣對肉雞器官指數(shù)和組織病理學(xué)的影響

器官指數(shù)是反映不同飼糧處理對動物機(jī)體發(fā)育和器官功能狀態(tài)影響的明顯參數(shù)[25]。特別是在健康動物中,發(fā)育成熟并良好的內(nèi)臟和免疫器官與得到改善的免疫反應(yīng)和生長性能相關(guān);免疫器官的重量越大,機(jī)體的免疫反應(yīng)就越好,其中脾臟是免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵角色[26]。從本研究結(jié)果可以看出,在肉雞飼糧中添加25～250 mg/kgD-泛酸鈣后,肉雞脾臟指數(shù)并無顯著變化,說明其免疫功能未受到不良影響,這與He等[27]關(guān)于泛酸能影響細(xì)胞因子的分泌,從而調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的研究結(jié)果一致。肝臟是脂質(zhì)代謝的場所,其重量的變化反映了代謝活動強(qiáng)度的水平[28];同時,腎臟也是動物機(jī)體重要的代謝器官,它的指數(shù)高低直接反映代謝能力[29]。本試驗(yàn)中,飼糧添加D-泛酸鈣對肉雞肝臟指數(shù)和腎臟指數(shù)均無顯著影響,這說明飼糧添加D-泛酸鈣未影響肉雞的代謝活動強(qiáng)度。除此之外,各組肉雞的其他器官指數(shù)之間均無顯著差異,這說明肉雞飼糧中添加D-泛酸鈣對肉雞器官指數(shù)無不良影響。同樣,飼糧添加D-泛酸鈣對肉雞70日齡心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟的組織形態(tài)結(jié)構(gòu)也未產(chǎn)生不良影響,各器官均未出現(xiàn)器質(zhì)性病變。這些結(jié)果與本研究中肉雞血液指標(biāo)和器官指數(shù)未發(fā)生顯著變化的結(jié)果相一致,說明飼糧添加250 mg/kgD-泛酸鈣對肉雞未產(chǎn)生不利影響。

4 結(jié) 論

① 在本試驗(yàn)條件下,飼糧添加中高劑量(125和250 mg/kg)D-泛酸鈣對肉雞生長性能、血常規(guī)指標(biāo)、血清生化指標(biāo)和器官發(fā)育均未產(chǎn)生不良影響,肉雞主要器官也均未觀測到組織病理學(xué)變化。

② 肉雞玉米-豆粕型飼糧中D-泛酸鈣最高添加水平可達(dá)到250 mg/kg,具有10倍的安全系數(shù),對肉雞飼用是安全的。