體外產(chǎn)氣法評價(jià)菌酶協(xié)同發(fā)酵對花棒瘤胃發(fā)酵特性的影響

楊雙鳴 馬煜斌 田 梅 沈 艷 趙曉清 王笠年 王文倩 茍 妍 徐曉鋒*

(1.寧夏大學(xué)動物科技學(xué)院,銀川 750021;2.寧夏大學(xué)林業(yè)與草業(yè)學(xué)院,銀川 750021;3.額爾克哈什哈蘇木綜合保障和技術(shù)推廣中心,阿拉善左旗 750316)

隨著國內(nèi)市場對粗飼料的需求增多,優(yōu)質(zhì)粗飼料供應(yīng)短缺問題愈發(fā)嚴(yán)重[1],尋找新的非常規(guī)飼料資源已成為畜牧業(yè)的主要研究內(nèi)容,以減少對常規(guī)飼料的依賴?；ò?Hedysarumscoparium),別名細(xì)枝巖黃耆,為荒漠地區(qū)豆科大灌木[2],其纖維木質(zhì)化程度較高,適口性較差,導(dǎo)致花棒直接飼喂效果較差,但有研究表明花棒的相對飼用價(jià)值和有機(jī)物消化率較高[3],是一種具有潛在飼用價(jià)值的非常規(guī)粗飼料資源,可是目前將花棒用于飼料利用和營養(yǎng)價(jià)值研究還不夠充分。

微生物發(fā)酵技術(shù)是把植物原料按比例添加1種或多種有益微生物菌劑,在密閉和適宜的條件下,通過有益微生物的繁殖與發(fā)酵作用,把原料分解成蛋白質(zhì)、多糖等大分子物質(zhì),生成有機(jī)酸、小肽和維生素等有益代謝物[4],同時(shí)能有效降低飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子水平,提高飼料利用率[5]。體外產(chǎn)氣法具有簡便易行、重復(fù)性好、容易標(biāo)準(zhǔn)化操作等優(yōu)點(diǎn)[6],目前大多采用體外產(chǎn)氣法來研究飼料的營養(yǎng)價(jià)值。因此,本研究通過體外產(chǎn)氣法探究菌酶協(xié)同發(fā)酵對花棒瘤胃發(fā)酵特性的影響,旨在為花棒的開發(fā)利用及其家畜飼養(yǎng)中應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料選取內(nèi)蒙古自治區(qū)阿拉善盟阿拉善左旗額爾克哈什哈蘇木于5月進(jìn)行全株刈割的花棒,對所采花棒立即機(jī)械揉絲粉碎,混合均勻,后用作微貯試驗(yàn)材料。添加劑:糖蜜、地衣芽孢桿菌(由山東某生物工程有限公司提供,活菌數(shù)為1×1011CFU/g)、乳酸桿菌(由山東某生物工程有限公司提供,活菌數(shù)為1×1010CFU/g)、纖維素酶(由北京某科技有限公司提供,活性為5×104U/g)。

1.2 瘤胃液供體動物及飼養(yǎng)管理

選取1頭健康、裝有永久性瘤胃瘺管的中國荷斯坦奶牛為瘤胃液供體動物,奶牛飼糧精粗比為30∶70(風(fēng)干基礎(chǔ)),基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) %

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和樣品制備

試驗(yàn)采用完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì),共分為4組,對照組(CK組)不添加任何菌酶劑,J組添加5×106U/g植物乳桿菌和1×106U/g地衣芽孢桿菌,M組添加50 U/g纖維素酶,JM組添加5×106U/g植物乳桿菌、1×106U/g地衣芽孢桿菌和50 U/g纖維素酶,各組均添加5%的糖蜜輔助發(fā)酵,每組3個(gè)重復(fù)。

將揉絲過的花棒切為2～3 cm,混合均勻,加入蒸餾水使水分含量在60%左右,將相應(yīng)添加劑與花棒攪拌均勻裝入微貯袋(45 cm×26 cm),每袋300 g,每組設(shè)置3個(gè)重復(fù),最后用真空封口機(jī)封口,置室內(nèi)25 ℃左右避光保存,分別在微貯的第7、14、30、60天取樣。微貯花棒樣品經(jīng)過65 ℃干燥48 h制成風(fēng)干樣,粉碎過1 mm篩,密封保存?zhèn)溆?經(jīng)測定,各組微貯花棒營養(yǎng)成分見表2。

1.4 瘤胃發(fā)酵培養(yǎng)液制備

于晨飼后2 h,通過瘺管裝置在奶牛瘤胃的不同位置采集瘤胃液,將采集到的瘤胃液充分混合后用4層紗布過濾處理,立刻放入通有二氧化碳的保溫瓶(39 ℃熱水預(yù)熱)中帶回實(shí)驗(yàn)室。人工瘤胃液參考Menke等[7]的方法配制,將配制好的混合緩沖液與置于39 ℃水浴鍋中,并迅速將制備好的瘤胃液按比例(緩沖液:瘤胃液配比為2∶1)加入即可得到瘤胃發(fā)酵培養(yǎng)液。

1.5 瘤胃體外發(fā)酵試驗(yàn)

以微貯的花棒作為體外發(fā)酵底物,進(jìn)行模擬體外瘤胃發(fā)酵。試驗(yàn)分批次進(jìn)行,共分為4組(CK組、J組、M組、JM組),每組6個(gè)重復(fù),同時(shí)設(shè)置空白組(6個(gè)重復(fù)),用以校正產(chǎn)氣量(空白組只添加人工瘤胃培養(yǎng)液,無飼料),培養(yǎng)管為100 mL玻璃注射器,最小刻度為1 mL,注射器前端安裝乳膠管,用乳膠管夾子進(jìn)行封閉。分別準(zhǔn)確稱取約200 mg樣品于培養(yǎng)管內(nèi),向各培養(yǎng)管內(nèi)加入約30 mL混合培養(yǎng)液,倒置于已充分預(yù)熱(39 ℃)的水浴搖床內(nèi)。記錄培養(yǎng)管活塞的初始刻度值(mL),啟動水浴搖床開始培養(yǎng),進(jìn)行72 h體外瘤胃培養(yǎng)。

1.6 測定指標(biāo)及方法

總產(chǎn)氣量測定:分別記錄培養(yǎng)3、6、9、12、24、36、48、72 h時(shí)各培養(yǎng)管的刻度值(mL)。某時(shí)間點(diǎn)實(shí)際產(chǎn)氣量等于該時(shí)間點(diǎn)活塞位置讀數(shù)減去該培養(yǎng)管初始讀數(shù)。

產(chǎn)氣參數(shù)的計(jì)算根據(jù)?rskov等[8]動態(tài)發(fā)酵參數(shù)模型公式:

GP=a+b(1-exp-ct)。

式中:GP為t時(shí)間點(diǎn)累積產(chǎn)氣量(mL);t為發(fā)酵開始中某一時(shí)間(h);a為快速產(chǎn)氣量(mL);b為慢速產(chǎn)氣量(mL);c為產(chǎn)氣速度(%/h)。

根據(jù)非線性最小二乘法原理,將不同時(shí)間點(diǎn)的體外產(chǎn)氣量代入,可計(jì)算出快速產(chǎn)氣量、慢速產(chǎn)氣量、產(chǎn)氣速度等產(chǎn)氣動力參數(shù)。

pH:培養(yǎng)液發(fā)酵結(jié)束后,迅速用冰水混合物冷凝發(fā)酵液,將pH計(jì)探頭插入培養(yǎng)液中,待穩(wěn)定后記錄數(shù)值。

采用比色法[9]測定氨態(tài)氮(NH3-N)濃度,采用考馬斯亮藍(lán)法[10]測定微生物蛋白(MCP)濃度,采用日本島津GC-2030氣相色譜儀[11]測定乙酸、丙酸和丁酸等揮發(fā)性脂肪酸(VFA)濃度。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2019軟件進(jìn)行記錄整理,以SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件中的ANOVA程序進(jìn)行單因素方差分析,并采用Duncan氏法進(jìn)行各組間的多重比較,以P<0.05表示差異顯著,試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌酶協(xié)同發(fā)酵對花棒體外產(chǎn)氣參數(shù)的影響

由表3可知,隨發(fā)酵時(shí)間的增長,J組和JM組快速產(chǎn)氣量整體呈增長趨勢,J組、M組和JM組在發(fā)酵第60天的快速產(chǎn)氣量均顯著高于發(fā)酵第7、14天(P<0.05)。在發(fā)酵第14天,JM組慢速產(chǎn)氣量顯著高于對照組(P<0.05),在發(fā)酵第30、60天,J組和JM組慢速產(chǎn)氣量顯著高于對照組(P<0.05)。J組在發(fā)酵第30天的慢速產(chǎn)氣量顯著高于發(fā)酵第14天和第60天(P<0.05);M組在發(fā)酵第60天的慢速產(chǎn)氣量顯著高于發(fā)酵第14和30天(P<0.05)。

表3 菌酶協(xié)同發(fā)酵對花棒體外產(chǎn)氣參數(shù)的影響Table 3 Effects of cooperative fermentation by bacteria and enzymes on in vitro gas production parameters of Hedysarum scoparium

2.2 菌酶協(xié)同發(fā)酵對花棒體外瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

由表4可知,J組和M組在4個(gè)不同發(fā)酵時(shí)間pH均無顯著差異(P>0.05)。在發(fā)酵第14天,J組和M組pH顯著低于對照組(P<0.05)。JM組在發(fā)酵第60天的pH顯著低于發(fā)酵第7和14天(P<0.05)。

表4 菌酶協(xié)同發(fā)酵對花棒體外瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響Table 4 Effects of cooperative fermentation by bacteria and enzymes on in vitro rumen fermentation parameters of Hedysarum scoparium

在發(fā)酵第7天,M組和JM組乙酸、丙酸濃度均顯著高于對照組(P<0.05),J組、M組和JM組MCP濃度與對照組無顯著差異(P>0.05)。在發(fā)酵第14天,J組和JM組丙酸濃度顯著高于對照組(P<0.05),J組乙酸、丁酸濃度顯著高于M組(P<0.05)。在發(fā)酵第30天,JM組NH3-N濃度顯著高于J組和M組(P<0.05),J組和JM組乙酸和總揮發(fā)酸濃度顯著高于對照組(P<0.05),J組丙酸濃度顯著高于對照組(P<0.05),JM組丁酸濃度顯著高于對照組(P<0.05)。在發(fā)酵第60天,各組之間NH3-N濃度差異不顯著(P>0.05);J組MCP濃度顯著高于對照組(P<0.05),J組、M組和JM組MCP濃度無顯著差異(P>0.05);J組、M組和JM組乙酸、丙酸和總揮發(fā)酸濃度均顯著高于對照組(P<0.05)。

J組和JM組在發(fā)酵第30和60天的NH3-N濃度顯著高于發(fā)酵第7和14天(P<0.05);M組在發(fā)酵第60天的乙酸濃度顯著高于發(fā)酵第7、14和30天(P<0.05),J組和JM組在發(fā)酵第60天的乙酸濃度顯著高于發(fā)酵第7天(P<0.05);J組在發(fā)酵第14、30、60天的丙酸濃度顯著高于發(fā)酵第7天(P<0.05),M組在發(fā)酵第60天的丙酸濃度顯著高于發(fā)酵第7、14天(P<0.05),JM組在發(fā)酵第60天的丙酸濃度顯著高于發(fā)酵第30天(P<0.05)。其中JM組的乙酸、丙酸和總揮發(fā)酸濃度較高,分別為31.69、12.88和50.01mmol/L。通過以上的分析,在發(fā)酵第60天,JM組的體外瘤胃發(fā)酵效果較好。

3 討 論

3.1 菌酶協(xié)同發(fā)酵對花棒體外產(chǎn)氣量的影響

產(chǎn)氣量是反芻動物瘤胃底物發(fā)酵程度的綜合指標(biāo),產(chǎn)氣量與瘤胃細(xì)菌的活性呈正相關(guān),飼料中可發(fā)酵的有機(jī)物含量越多,產(chǎn)氣量越高。袁玖等[12]通過體外研究發(fā)現(xiàn),飼料體外發(fā)酵快速產(chǎn)氣量為負(fù)值,說明飼料可能存在產(chǎn)氣滯后效應(yīng)。本試驗(yàn)中,J組和JM組在發(fā)酵第7天和14天時(shí)快速產(chǎn)氣量都存在產(chǎn)氣滯后效應(yīng);有研究表明,快速產(chǎn)氣量與粗蛋白質(zhì)含量呈正相關(guān)[13],隨著花棒微貯發(fā)酵時(shí)間增長,粗蛋白質(zhì)含量有明顯改善,各組發(fā)酵第60天時(shí)快速產(chǎn)氣量也顯著高于發(fā)酵第7天,而慢速產(chǎn)氣量隨發(fā)酵時(shí)間增長而沒有顯著變化,J組和JM組在微貯第60天的慢速產(chǎn)氣量均顯著高于對照組,可能是瘤胃中琥珀酸、丙酸代謝途徑增強(qiáng),導(dǎo)致丙酸和二氧化碳產(chǎn)量上升,引起瘤胃空間體積的變化[14],說明添加地衣芽孢桿菌和植物乳桿菌具有提高花棒微貯體外瘤胃消化率的潛力。任亞瓊等[15]研究發(fā)現(xiàn),添加植物乳桿菌和地衣芽孢桿菌的微貯玉米秸稈在瘤胃發(fā)酵48 h產(chǎn)氣量最高,說明發(fā)酵過程中地衣芽孢桿菌、植物乳桿菌協(xié)同效果較好,充分發(fā)酵底物。本試驗(yàn)中,添加纖維素酶的M組在發(fā)酵第60天的產(chǎn)氣量高于對照組,體外產(chǎn)氣量與瘤胃干物質(zhì)降解率呈正相關(guān)[16],產(chǎn)氣量越高,干物質(zhì)降解率越高。曾輝等[17]研究表明,纖維素酶能夠打破植物飼料的細(xì)胞壁,植物中纖維降解,提高纖維素的比表面積,使細(xì)胞壁對瘤胃微生物的抗性減弱,提高飼料與瘤胃中的消化酶的接觸面積,從而使飼料更容易被消化,提高瘤胃降解率,產(chǎn)氣量升高。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長,各組的產(chǎn)氣量也逐漸增加。Sun等[18]用纖維素酶或乳酸桿菌處理玉米青貯秸稈及其組分的體外產(chǎn)氣參數(shù),包括最大產(chǎn)氣率、產(chǎn)氣速率和滯后時(shí)間均得到了改善。

3.2 菌酶協(xié)同發(fā)酵對花棒體外瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

pH是瘤胃主要的發(fā)酵參數(shù)之一,瘤胃pH正常范圍在6.0～7.0[19],主要受瘤胃上皮對揮發(fā)酸的吸收、飼料外流速率和唾液分泌量的影響[20]。同時(shí)植物乳桿菌接種確保了有足夠數(shù)量的產(chǎn)酸細(xì)菌,從而導(dǎo)致pH迅速降低,這將有助于減少不良發(fā)酵,減少蛋白質(zhì)水解。此外,添加纖維素酶導(dǎo)致了微貯中更多的乳酸生產(chǎn)。本試驗(yàn)中pH為6.66～6.83,各組的瘤胃發(fā)酵pH均在正常范圍內(nèi),說明各組的體外發(fā)酵比較平穩(wěn),不會對瘤胃pH造成影響[21],對維持瘤胃內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)有積極影響。

NH3-N是蛋白質(zhì)類有機(jī)物在瘤胃中消化代謝的中間產(chǎn)物,其含量是反映瘤胃發(fā)酵底物中蛋白質(zhì)降解程度的重要指標(biāo)之一[22]。瘤胃微生物不僅可以利用NH3-N合成MCP,也可以分解飼料中蛋白質(zhì)生成NH3-N,在瘤胃微生物區(qū)系中,大部分微生物將NH3-N作為唯一氮源[23]。瘤胃中NH3-N濃度受采食量、微生物的利用效率、營養(yǎng)物質(zhì)消化率和瘤胃生態(tài)的影響。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),瘤胃中NH3-N濃度與飼糧中粗蛋白質(zhì)含量和蛋白質(zhì)降解速度呈正相關(guān)[24]。本試驗(yàn)中,JM組和M組在微貯發(fā)酵第60天的NH3-N濃度均高于對照組,推測添加復(fù)合菌和纖維素酶促進(jìn)了體外發(fā)酵瘤胃微生物對微貯發(fā)酵底物中含氮化合物的分解,使NH3-N濃度升高。

MCP是反芻動物最主要的氮源,是瘤胃微生物通過利用各種養(yǎng)分來合成的微生物體蛋白,占進(jìn)入小腸非NH3-N的60%～80%。本試驗(yàn)中,M組和JM組在發(fā)酵第60天的MCP濃度高于對照組,由于微貯發(fā)酵提高了快速產(chǎn)氣量,使降解碳水化合物組分速率增加,為MCP的合成提供了更多發(fā)酵底物。這說明復(fù)合菌和纖維素酶處理花棒利于提高M(jìn)CP濃度;但J組NH3-N濃度較低,可能是植物乳桿菌和地衣芽孢桿菌微貯花棒的協(xié)同作用,促進(jìn)瘤胃微生物對NH3-N的利用[25],提高了MCP的合成。

揮發(fā)性脂肪酸主要是由微生物發(fā)酵碳水化合物和氨基酸產(chǎn)生,主要包括乙酸、丙酸、丁酸,可為反芻動物提供總能量的70%～80%[26],是反芻動物賴以生存的主要能量來源。乙酸和丙酸是瘤胃中濃度較高并影響瘤胃發(fā)酵類型的2種揮發(fā)性脂肪酸。乙酸是瘤胃微生物活動的主要產(chǎn)物,在反芻動物體內(nèi)主要用于合成乳脂,丙酸是肝臟糖異生的主要底物,主要用于合成體脂和乳糖,因此乙酸/丙酸可以反映能量利用的情況。本試驗(yàn)中,J組、M組和JM組在發(fā)酵第60天時(shí)乙酸、丙酸含量均顯著高于對照組,添加植物乳桿菌和纖維素酶促進(jìn)了微貯飼料中碳水化合物在瘤胃中的降解[27],而地衣芽孢桿菌可分泌纖維素酶[28],進(jìn)一步促進(jìn)對反芻動物瘤胃中的纖維物質(zhì)降解,進(jìn)而改善瘤胃發(fā)酵。J組和JM組在發(fā)酵第60天時(shí)乳酸含量較高,乳酸或丙酮酸轉(zhuǎn)化為丙酸[29]。當(dāng)乳酸在瘤胃中由乳酸利用菌進(jìn)行二次發(fā)酵時(shí),一般會產(chǎn)生丙酸,高乳酸含量微貯飼料可能提高了瘤胃發(fā)酵中丙酸產(chǎn)量[30]。李婭楠[31]研究發(fā)現(xiàn),在稻草中添加植物乳桿菌與地衣芽孢桿菌復(fù)合微貯能提高體外瘤胃發(fā)酵總揮發(fā)性脂肪酸濃度,提高了稻草的營養(yǎng)價(jià)值。本試驗(yàn)中,添加植物乳桿菌、地衣芽孢桿菌與纖維素酶在花棒微貯發(fā)酵第60天時(shí),總揮發(fā)性脂肪酸濃度較高且顯著高于對照組,說明添加植物乳桿菌、地衣芽孢桿菌與纖維素酶對體外發(fā)酵效率有協(xié)同作用,對花棒的營養(yǎng)價(jià)值有積極影響。

4 結(jié) 論

① 各組隨發(fā)酵時(shí)間的增長,快速產(chǎn)氣量逐漸增加,其中添加植物乳桿菌、地衣芽孢桿菌與纖維素酶在發(fā)酵第60天時(shí)快速產(chǎn)氣量最高。

② J組、M組和JM組在發(fā)酵第60天時(shí)的乙酸、丙酸和總揮發(fā)性脂肪酸濃度均顯著高于對照組,說明添加植物乳桿菌、地衣芽孢桿菌與纖維素酶對體外發(fā)酵效率有協(xié)同作用,對花棒的營養(yǎng)價(jià)值有積極影響。