基于OPG/RANK/RANKL 信號通路探討鐵筷子對CIA 大鼠骨破壞的防護(hù)作用

單文婷，王瀟，楊曉龍，艾飛，劉楊，魏鑫，劉霞

（貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴陽 550025）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）屬于一種慢性進(jìn)行自身免疫性疾?。?］，其病理特點(diǎn)包括慢性炎癥浸潤、血管翳形成、進(jìn)行性骨侵蝕、骨丟失和關(guān)節(jié)破壞，在疾病晚期可導(dǎo)致多臟器的并發(fā)癥［2］，且RA 女性的發(fā)病率高于男性，致殘率約占全球人口的1% ～2%［3］。 目前臨床上用于治療RA 主要以抗風(fēng)濕病藥物、糖皮質(zhì)激素及生物制劑為主，如甲氨蝶呤、腫瘤壞死因子（TNF）α 抑制劑、白細(xì)胞介素（IL-6）抑制劑、羥氯喹、甲潑尼龍［4］，這些藥物對于RA 的關(guān)節(jié)改善有限，而臟器的不良反應(yīng)較多且價(jià)格昂貴，因此需要找到在治療RA 方面更具有臨床意義和研究價(jià)值的藥物。

中醫(yī)認(rèn)為RA 引起骨破壞的發(fā)生與發(fā)展屬于氣滯血瘀證范疇，而活血化瘀、理氣止痛類藥物在該類疾病的臨床應(yīng)用中可取得較好療效［5］。 苗藥鐵筷子（helleborus thibetanusfranch）又名黑毛七、小桃兒七、九龍丹、見春花、九朵云、九蓮燈，為臘梅科臘梅（ Chimonanthus） 屬植物臘梅（ chimonanthus praecox L. Link）及山臘梅（chimonanthusitens Oliv）的干燥根［6］。 藥用部位為植物干燥的根部，性溫味辛，具有理氣止痛、活血化瘀的功效［7］，是苗族人民常用于治療RA、跌打損傷、瘡瘍腫毒的傳統(tǒng)用藥。目前臨床研究和實(shí)驗(yàn)研究均已證明鐵筷子醇提物能夠顯著改善血管翳異常增生以及骨關(guān)節(jié)的生理特性和功能異常［8］，但目前對其作用機(jī)制的認(rèn)識還不夠深入。

骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG）是腫瘤壞死因子受體（tumor necrotic factor receptor，TNFR）之一，通過與核因子κB 受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）競爭性結(jié)合RANK（NF-κB 受體激活子），阻斷RANK 與其配體結(jié)合，抑制破骨細(xì)胞的活化和成熟，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡［9］。 由此，OPG/RANKL/RANK 信號通路構(gòu)成新的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，不僅調(diào)控破骨細(xì)胞的激活和骨重建，還在骨破壞相關(guān)疾病中起至關(guān)重要的作用。研究表明，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎組織中破骨細(xì)胞數(shù)量與活性明顯增加，提示活化的破骨細(xì)胞參與RA 的骨破壞。 可見抑制破骨細(xì)胞的活化可能是治療該疾病的關(guān)鍵。 基于此，本研究采用膠原和不完全弗氏佐劑復(fù)制CIA 大鼠模型［10］，通過觀察鐵筷子對CIA 大鼠的治療效果及OPG/RANK/RANKL 信號通路關(guān)鍵因子的檢測，以探討鐵筷子對模型大鼠骨組織的防護(hù)機(jī)制，為鐵筷子治療RA 奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

60 只5 周齡SPF 級Wistar 雌性健康大鼠，體重110 ～150 g，由斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司提供【SCXK（京）2019-0010】。 本研究于室內(nèi)溫度21～25℃，相對濕度40% ～50%，每日光照時(shí)間5 h環(huán)境進(jìn)行，飼養(yǎng)于貴州中醫(yī)藥大學(xué)動物研究實(shí)驗(yàn)中心【SYXK（黔）2021-0005】，通過貴州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會的批準(zhǔn)（20220108）。

1.1.2 藥物

鐵筷子購于貴陽市烏當(dāng)區(qū)三江鎮(zhèn)農(nóng)場，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室進(jìn)行初步鑒定，鐵筷子為山臘梅科臘梅屬植物臘梅的根莖。 購來的鐵筷子用水清洗棄其雜質(zhì)后，進(jìn)行曬干，將其打成粗粉。 稱取粉碎后鐵筷子1000 g，7 倍量甲醇回流提取2 次，每次3 h，甲醇熱回流提取蒸干，將混合的濾液過濾以獲得總提取物，減壓濃縮后在水浴鍋將提取物平鋪于托盤蒸干濃縮得浸膏，將其放入4℃冰箱保存，動物給藥時(shí)用25%乙醇溶解以達(dá)到所需生藥濃度，以0.25、0.50、1.00 g/kg 作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的藥物濃度，記為低劑量組、中劑量組、高劑量組。

1.1.3 主要試劑與儀器

甲氨蝶呤（上海上藥信誼藥廠有限公司，197220704）；牛Ⅱ型骨膠原蛋白（美國chondrex 公司，20022）、不完全弗氏佐劑（美國chondrex 公司，7002 ）； Molpure?Cell/Tissue Total RNA Kit（YEASEN 公司，19221ES50）；PrimeScriptRTreagent Kit（寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，RR047A）、TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）（寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，RR820A）；蘇木素染液（武漢塞維爾生物科技有限公司，G1004）；伊紅染液（合肥博美生物科技有限責(zé)任公司，YE2080）；TRAP 染色試劑盒（德國Sigma-Aldrich，387A-1KT）；預(yù)染蛋白Marker（abclonalRM，19001）、RANKL（abclonal，A2550）、βactin（abclonal，AC033）、OPG（abclonal，A12997）、RANK（abclonal，A2100）、HRP Goat Anti-Mouse IgG（ H ＋ L） （ abclonal，AS003）； TNF-α （ boster，BA0131）； BMP-2 （proteintech，66383-1-Ig）； Goat Anti-Rabbit IgG （H ＋L） HRP（Affinity，S0001）。 實(shí)時(shí)熒光定量（qRT-PCR）儀（四川西隴科學(xué)有限公司）；轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)（2016 德國徠卡）；組織包埋機(jī)（常州郊區(qū)中威電子儀器）；JY-SCZ4 ＋型垂直電泳槽（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及實(shí)驗(yàn)干預(yù)

隨機(jī)將大鼠分為正常組（Control）、模型組（Model）、陽性藥物組（MTX）、低劑量組、中劑量組和高劑量組，共6 組，每組10 只。 用戊巴比妥鈉（50mg/kg）對正常組以外的剩余大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉后，進(jìn)行第1 次免疫（Day 0）：在每只大鼠的尾根部3 cm 的位置進(jìn)行皮下注射0.2 mL 的牛Ⅱ型膠原蛋白乳劑；在1 次免疫后7 d 進(jìn)行2 次免疫：在大鼠的尾根部3 cm 的位置用0.4 mL 牛Ⅱ型膠原蛋白乳劑以加強(qiáng)免疫刺激。 膠原蛋白乳劑的配制：將等體積的2 mg/mL 牛Ⅱ型膠原溶液與1 mg/mL 不完全弗氏佐劑混合在冰浴狀態(tài)下用勻漿器攪拌均勻，使其充分混合乳化，待牛Ⅱ型膠原蛋白乳液完全乳化后（乳化條件為：乳液滴水面成球狀，不分散），置于冰上待用，以避免膠原蛋白的變性和失活。 CIA 模型構(gòu)建成功后（模型成功標(biāo)準(zhǔn)：用游標(biāo)卡尺法測定造模大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹≥6 mm），于一次免疫第14天，正常組與模型組分別灌胃10 mL/（kg·d）濃度0.9%生理鹽水；陽性藥物組給予MTX，每周3 次，均按照實(shí)時(shí)體重計(jì)算給藥量；低劑量組、中劑量組和高劑量組大鼠，0.25、0.50、1.00 g/kg 濃度鐵筷子每天1 次，連續(xù)灌胃給藥25 d。

1.2.2 形態(tài)指標(biāo)檢測及取材

末次給藥后，禁食禁飲1 d，用戊巴比妥鈉（50mg/kg）腹腔注射全麻基礎(chǔ)下斷頸處死大鼠，于冰上取左踝關(guān)節(jié)骨組織，做好標(biāo)記，放入-80℃冰箱中保存。 取右踝關(guān)節(jié)骨組織，多聚甲醛固定一部分骨組織，做石蠟切片。 將包埋好的石蠟切成6 μm 厚的石蠟切片備用。 于冰上取骨組織并置入配制好10% EDTA 脫鈣溶液中1 個(gè)月。 PBS 緩沖液沖洗3次，將1 mL 蛋白提取液添加到試管中，骨組織蛋白液超聲勻漿化，離心，取上清，以備測定。

1.2.3 一般情況的觀察

大鼠體重、進(jìn)食量、行為狀態(tài)、毛發(fā)等一般狀況。 用游標(biāo)卡尺分別在7、14、20、26、32、38 d 測量大鼠雙側(cè)后肢腫脹程度。

1.2.4 Micro-CT 檢測

造模成功后RA 大鼠取材，對各組大鼠關(guān)節(jié)損傷進(jìn)行Micro-CT 檢測，掃描脛骨和踝關(guān)節(jié)骨組織獲取骨體積分?jǐn)?shù)（bone volume/tissuevolume，BV/TV）、骨密度（bone mineral density，BMD）及骨表面體積比（bone surface area/bone volume，BS/BV）。

1.2.5 踝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)觀察（HE 染色）

4%多聚甲醛將大鼠踝關(guān)節(jié)骨組織固定48 h后，將組織取出放入配制好的10% EDTA 脫鈣溶液中1 個(gè)月。 脫鈣組織置于75%乙醇脫水30 h、85%乙醇脫水4 h、95%乙醇脫水8 h、100%乙醇脫水2 h、 100%乙醇脫水1 h，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各45 min 進(jìn)行透明處理后進(jìn)行石蠟包埋，石蠟切片（厚為4 μm），用常規(guī)脫蠟至水，將各標(biāo)本的蠟塊各取5 張切片，再于蘇木精-伊紅（HE）染色下用光學(xué)顯微鏡觀察，收集圖像并進(jìn)行分析。

1.2.6 踝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)觀察（TRAP 染色）

石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，切片于純水洗5 min后，吸水紙吸干。 置于盛有純水的濕盒中，用純水37℃孵育2 h。 倒去組織上純水后，切片重新放入濕盒，加現(xiàn)配好的trap 工作液完全覆蓋于切片組織上，放于37℃烤箱避光染色20 ～30 min。 傾去染液，水洗玻片，用抗酒石酸酸性磷酸酶浸染1 ～2 min（破骨細(xì)胞呈酒紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色）水洗；切片經(jīng)3 次無水乙醇，每次5 min，放入二甲苯2 次，每次5 min。待染色切片透明后，滴加中性樹膠封片劑密封切片，切片干燥后在顯微鏡下對其進(jìn)行觀察，并進(jìn)行圖像采集和分析。

1.2.7 qRT-PCR 技術(shù)測定踝關(guān)節(jié)組織中OPG、RANK、RANKL、TNF-α、BMP-2 基因表達(dá)

從-80℃超低溫冰箱取出凍存的踝關(guān)節(jié)骨組織，液氮下研磨成粉，按TRIzol 試劑盒說明提取總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作獲取cDNA，以β-actin 作為內(nèi)參。 引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計(jì)并合成，序列如表1 所示。 RT-qPCR 擴(kuò)增體系為20 μL；Template（DNA）2 μL，上下游引物各0.8 μL，加無菌蒸餾水6.4 μL。 反應(yīng)條件：42℃預(yù)變性2 min；擴(kuò)增反應(yīng)：95℃反應(yīng)35 s，55℃反應(yīng)30 s，72℃反應(yīng)30 s，收集熒光信號，共45 個(gè)循環(huán)；熔點(diǎn)曲線55 ～95℃，擴(kuò)增反應(yīng)在QuantStudio 多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀上進(jìn)行。采用2-ΔΔCt方法，比較各組OPG、RANKL、RANK、BMP-2、TNF-αmRNA 相對表達(dá)水平。

表1 實(shí)時(shí)定量熒光PCR 引物Table 1 Real-time quantitative fluorescent PCR primers

1.2.8 Western Blot 技術(shù)檢測踝關(guān)節(jié)組織中OPG、RANK、RANKL、TNF-α、BMP-2 蛋白表達(dá)

在-80℃下，將保存的骨組織放入含有2%SDS裂解液的Ep 管中，試管內(nèi)加入鋼珠，用勻漿裝置研磨，室溫放置20 min，在室溫下以10 000 r/min 離心30 min。 取上清液，用BCA 蛋白定量試劑盒對蛋白進(jìn)行定量，并對其總濃度進(jìn)行測定，各實(shí)驗(yàn)組取50 μL，在95℃條件下變性15 min，取30 μg 蛋白樣品，用10% SDS-PAGE 電泳分離1 h，之后將樣品轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，在室溫下，用5%脫脂奶粉將PVDF膜封閉1 ～2 h，TBST 洗膜3 次，并在4℃時(shí)加入針對靶蛋白OPG（1 ∶2000）、RANK （1 ∶2000）、 RANKL（1 ∶2000）、TNF-α（1 ∶2000）、BMP-2（1 ∶2000）、 β-actin（1 ∶50000）的一抗孵育過夜，將膜用TBST 洗滌3 次后，與辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔二抗體IgG 稀釋緩沖劑（1 ∶5000）在室溫孵育2 ～3 h，采用ECL 熒光顯像技術(shù)，以β-actin 的表達(dá)量作為內(nèi)參，應(yīng)用Image J 軟件進(jìn)行條帶灰度值分析，并以正常組結(jié)果為1，對各組蛋白表達(dá)結(jié)果進(jìn)行歸一化處理。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)果用平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 26.0 和GraphPad Prism 6 統(tǒng)計(jì)軟件展開數(shù)據(jù)分析。 兩組樣本間的比較采用t檢驗(yàn)；以單因子方差分析/重復(fù)計(jì)量方差分析（ANOVA）進(jìn)行多組之間的比較，以P＜0.05 為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般狀況及足腫脹度的影響

藥物鐵筷子有毒性，將總提取物以0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、16.00 g/kg 的濃度梯度進(jìn)行動物急性毒性檢測，發(fā)現(xiàn)1.00 g/kg 以上濃度可致大鼠死亡，在急性毒性濃度梯度進(jìn)行動物檢測時(shí)發(fā)現(xiàn)1.00 g/kg 以上大鼠出現(xiàn)毒性反應(yīng)，將1.00 g/kg記為安全范圍。 故選擇低劑量組（0.25 g/kg）、中劑量組（0.50 g/kg）、高劑量組（1.00 g/kg）。

一次免疫的第7 天記錄測量足腫脹度、關(guān)節(jié)炎指數(shù)、體重（表2），各組大鼠體重增長率變化情況（圖1A）、足底厚度改變情況（見圖1B，1C）。 正常組大鼠發(fā)育良好、被毛致密光亮，日?；顒蛹笆场⑺?dāng)z入量均正常；與正常組相比，模型組大鼠在二次免疫后，被毛變黃無光澤，精神躁動不安，食、水?dāng)z入量減少，后肢沉重呈拖行狀態(tài)、四肢明顯腫脹，體重下降（P＜0.05）；與模型組相比，陽性藥物組與高劑量組大鼠一般狀況、體重（P＜0.05）、足腫脹度（P＜0.05）均顯著改善。

圖1 鐵筷子對RA 大鼠體重和足腫脹度的影響（±s，n ＝10）Figure 1 Effect of helleborus thibetanus franch on body mass，foot and plantar swelling in rats with RA（±s，n ＝10）

表2 給藥結(jié)束時(shí)各組小鼠的體重、足趾腫脹度測定結(jié)果（±s，n ＝10）Table 2 Results of body mass and toe swelling of mice in each group at the end of drug administration were measured（±s，n ＝10）

表2 給藥結(jié)束時(shí)各組小鼠的體重、足趾腫脹度測定結(jié)果（±s，n ＝10）Table 2 Results of body mass and toe swelling of mice in each group at the end of drug administration were measured（±s，n ＝10）

注：與正常組相比，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05。 （下圖/表同）Note. Compared with normal group，aP ＜0.05. Compared with model group，bP ＜0.05. （The same in the following figures and tables）

組別Groups左足趾腫脹度（mm）Swelling of left toe（mm）右足趾腫脹度（mm）Swelling of right toe（mm）關(guān)節(jié)炎評分（分）Arthritis score（score）體重（g）Wight（g）正常組Normal group2.24 ± 0.212.23 ± 0.190233.37 ± 3.75模型組Model group5.33 ± 0.83a5.32 ± 0.87a7.30 ± 1.57a194.08 ± 1.52a陽性藥物組Positive drug group4.21 ± 0.54b4.87 ± 0.865.00 ± 2.08b192.94 ± 4.20低劑量組Low dose group4.83 ± 1.034.78 ± 0.915.67 ± 1.91b203.49 ± 5.06中劑量組Medium dose group4.41 ± 1.024.67 ± 1.155.33 ± 2.07b200.96 ± 3.72高劑量組High dose group3.75 ± 0.76b3.80 ± 0.73b5.03 ± 2.26b208.46 ± 3.07b

2.2 踝關(guān)節(jié)microCT 的影響

正常組踝關(guān)節(jié)表面光滑、外形完整（圖2）。 與正常組比，模型組踝關(guān)節(jié)表面凹凸不平、外形不完整，骨組織表面出現(xiàn)啃噬樣骨質(zhì)破壞。 骨密度（BMD）和骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）均顯著下降（P＜0.05），骨表面積體積比（BS/BV）則明顯升高（P＜0.05）。 與模型組比，陽性藥物組踝關(guān)節(jié)表面光滑，外形完整。 相比BS/BV 均降低（P＜0.05）；BMD、BV/TV 升高（P＜0.05）。 與陽性藥物組相比，低、中劑量組踝關(guān)節(jié)表面較凹凸不平，外形不完整，骨組織表面出現(xiàn)啃噬樣骨質(zhì)破壞；BS/BV 降低（P＜0.05）；BMD、BV/TV 升高較明顯（P＜0.05）。 高劑量組踝關(guān)節(jié)表面光滑，外形完整。 BS/BV 明顯降低（P＜0.05），BMD、BV/TV 明顯升高（P＜0.05），高劑量組效果與陽性藥物組接近（表3）。 可見隨著鐵筷子劑量加大，BS/BV 降低更加明顯，BMD、BV/TV升高明顯，說明鐵筷子藥物作用呈量效關(guān)系。

注：白色箭頭：骨組織破壞。圖2 鐵筷子對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠骨組織Micro-CT 的影響（xˉ±s，n ＝3）Note. White arrow. Bone tissue destruction.Figure 2 Effect of helleborus thibetanus franch on Micro-CT of bone tissue in rheumatoid arthritis rats（xˉ±s，n ＝3）

表3 鐵筷子對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠骨組織Micro-CT 的影響（±s，n ＝3）Table 3 Effect of helleborus thibetanus franch on Micro-CT of bone tissue in rheumatoid arthritis rats（±s，n ＝3）

組別Groups骨量百分比（%）Bone mass percentage（%）骨表面體積（%）Bone surface volume（%）骨密度（%）Bone density （%）正常組Normal group84.07 ± 4.816.87 ± 0.280.76 ± 0.01模型組Model group59.66 ± 7.21a12.41 ± 1.90a0.59 ± 0.09a陽性藥物組Positive drug group69.71 ± 2.85b10.77 ± 0.76b0.68 ± 0.15b低劑量組Low dose group83.87 ± 7.04b8.25 ± 1.97b0.76 ± 0.07b中劑量組Medium dose group81.21 ± 9.38b7.80 ± 2.05b0.76 ± 0.10b高劑量組High dose group83.18 ± 3.55b7.10 ± 0.52b0.78 ± 0.02b

2.3 踝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)的影響（HE 染色）

正常組大鼠踝關(guān)節(jié)骨組織中的成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞均有規(guī)整排列，且結(jié)構(gòu)完整，滑膜表面光滑，沒有明顯增生，亦無炎性浸潤（見圖3）；模型組骨關(guān)節(jié)腔內(nèi)有大量的成纖維細(xì)胞和大量的炎癥細(xì)胞浸潤，滑膜表面可見“啃噬”樣病理改變，滑膜上的細(xì)胞排列不規(guī)則，關(guān)節(jié)腔增生、腫脹明顯。 低、中、高劑量組較模型組明顯減輕了滑膜的炎性細(xì)胞浸潤和增生；其中，鐵筷子高劑量組對踝關(guān)節(jié)滑膜組織和骨組織有顯著的保護(hù)作用。

注：黑色箭頭：啃噬樣骨破壞；藍(lán)色箭頭：炎癥細(xì)胞浸潤；綠色箭頭：骨關(guān)節(jié)腔滑膜組織。圖3 各組大鼠踝關(guān)節(jié)不同組織病理形態(tài)學(xué)觀察（HE 染色）（xˉ±s，n ＝3）Note. Black arrow. Gnawing bone destruction. Blue arrow. Inflammatory cell infiltration. Green arrow. Synovial tissue.Figure 3 Observations on different histopathologic morphology of ankle joints of rats in various groups（HE staining）（xˉ±s，n ＝3）

2.4 踝關(guān)節(jié)組織（TRAP 染色）

鐵筷子低、中、高劑量組作用于RA 大鼠，破骨細(xì)胞的TRAP 染色結(jié)果，正常組破骨細(xì)胞數(shù)目明顯較少；模型組破骨細(xì)胞數(shù)目顯著增加（圖4），有明顯的骨破壞形成；與模型組相比，鐵筷子中劑量組和鐵筷子高劑量組干預(yù)下破骨細(xì)胞數(shù)量減少，大鼠骨損傷程度減輕，證明了鐵筷子可以抑制RANK 誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞的生成。

注：藍(lán)色箭頭：破骨細(xì)胞。圖4 各組大鼠踝關(guān)節(jié)破骨細(xì)胞活化情況觀察（TRAP 染色）（xˉ±s，n ＝3）Note. Blue arrow. Osteoblasts.Figure 4 Observation of osteoclast activation in the ankle joint of rats in each group（TRAP staining）（xˉ±s，n ＝3）

2.5 踝關(guān)節(jié)骨組織OPG、RANK、RANKL、TNFα、BMP-2 基因表達(dá)的影響

采用qRT-PCR 對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠踝關(guān)節(jié)骨組織中TNF-α、RANKL、RANK、OPG、BMP-2 mRNA水平進(jìn)行檢測（圖5）。 結(jié)果顯示，與正常組相比（表4），模型組大鼠踝關(guān)節(jié)骨組織OPGmRNA 表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05），TNF-α、RANKL、RANK、BMP-2 mRNA 表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，鐵筷子高劑量組大鼠踝關(guān)節(jié)骨組織OPG、BMP-2 mRNA表達(dá)升高，TNF-α、RANKL、RANK表達(dá)降低，改善效果最為明顯（P＜0.05）。 與陽性藥物組相比，鐵筷子中劑量組OPG、BMP-2 mRNA 表達(dá)升高（P＜0.05），TNF-α、RANK表達(dá)降低（P＜0.05）；鐵筷子低劑量組大鼠踝關(guān)節(jié)骨組織OPG、BMP-2 mRNA 表達(dá)升高，TNF-α表達(dá)降低，具有一定的改善作用（P＜0.05）。

注：Ⅰ：正常組；Ⅱ：模型組；Ⅲ：陽性藥物組；Ⅳ：低劑量組；Ⅴ：中劑量組；Ⅵ：高劑量組。圖5 鐵筷子對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠骨組織中OPG/RANK/RANKL 通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)水平（xˉ±s，n ＝3）Note. Ⅰ. Normal group. Ⅱ. Model group. Ⅲ. Positive drug group.Ⅳ. Low dose group. Ⅴ. Medium dose group. Ⅵ. High-dose group.Figure 5 helleborus thibetanus franch on the Western Blot expression level of OPG/RANK/RANKL pathway in bone tissue of rheumatoid arthritis rats（xˉ±s，n ＝3）

表4 鐵筷子對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠骨組織中OPG/RANK/RANKL 通路mRNA 表達(dá)水平（±s，n ＝3）Table 4 Effects of helleborus thibetanus franch on mRNA expression levels of OPG/RANK/RANKL pathway in bone tissue of rheumatoid arthritis rats（±s，n ＝3）

表4 鐵筷子對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠骨組織中OPG/RANK/RANKL 通路mRNA 表達(dá)水平（±s，n ＝3）Table 4 Effects of helleborus thibetanus franch on mRNA expression levels of OPG/RANK/RANKL pathway in bone tissue of rheumatoid arthritis rats（±s，n ＝3）

組別GroupsOPGRANKRANKLBMP-2TNF-α正常組Normal group1.00 ± 0.001.00 ± 0.001.00 ± 0.001.00 ± 0.001.00 ± 0.00模型組Model group0.27 ± 0.05a1.63 ± 0.02a2.59 ± 0.28a0.46 ± 0.07a4.46 ± 0.04a陽性藥物組Positive drug group0.76 ± 0.09b1.04 ± 0.12b1.05 ± 0.13b0.34 ± 0.01b1.02 ± 0.13b低劑量組Low dose group0.28 ± 0.011.94 ± 0.03b2.76 ± 0.050.23 ± 0.01b3.44 ± 0.06b中劑量組Medium dose group0.31 ± 0.041.60 ± 0.061.41 ± 0.05b0.29 ± 0.02b2.27 ± 0.08b高劑量組High dose group0.60 ± 0.02b0.88 ± 0.14b1.00 ± 0.04b0.31 ± 0.02b1.42 ± 0.05b

2.6 踝關(guān)節(jié)骨組織OPG、RANK、RANKL、TNFα、BMP-2 蛋白表達(dá)的影響

與正常組相比（表5），模型組大鼠踝關(guān)節(jié)骨組織中TNF-α、RANKL、RANK蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），OPG、BMP-2 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，陽性藥物組、鐵筷子中、高劑量組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中TNF-α、RANKL、RANK蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），OPG、BMP-2 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），而鐵筷子低劑量組與陽性藥物組比較差異無顯著性（P＞0.05）。

表5 鐵筷子對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠骨組織中OPG/RANK/RANKL 通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)水平（±s，n ＝3）Table 5 Expression levels of key proteins of OPG/RANK/RANKL pathway in the bone group of rheumatoid arthritis rats by helleborus thibetanus franch（±s，n ＝3）

表5 鐵筷子對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠骨組織中OPG/RANK/RANKL 通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)水平（±s，n ＝3）Table 5 Expression levels of key proteins of OPG/RANK/RANKL pathway in the bone group of rheumatoid arthritis rats by helleborus thibetanus franch（±s，n ＝3）

組別GroupsOPGRANKRANKLBMP-2TNF-α正常組Normal group1.25 ± 0.130.24 ± 0.020.50 ± 0.090.64 ± 0.040.11 ± 0.01模型組Model group0.44 ± 0.05a0.56 ± 0.05a0.78 ± 0.07a0.19 ± 0.02a0.59 ± 0.04a陽性藥物組Positive drug group1.06 ± 0.11b0.40 ± 0.03b0.64 ± 0.060.56 ± 0.03b0.28 ± 0.01b低劑量組Low dose group0.69 ± 0.050.51 ± 0.030.73 ± 0.060.31 ± 0.03b0.47 ± 0.03b中劑量組Medium dose group0.91 ± 0.08b0.43 ± 0.03b0.64 ± 0.050.40 ± 0.03b0.41 ± 0.02b高劑量組High dose group1.03 ± 0.08b0.41 ± 0.04b0.61 ± 0.07b0.52 ± 0.04b0.34 ± 0.02b

3 討論

RA 是一種以關(guān)節(jié)腔內(nèi)滑膜異常增生、血管翳組織增多，骨破壞為病理特征的對稱性慢性自身免疫疾?。?1］。 其基本病理機(jī)制是滑膜組織炎癥過程中滑膜細(xì)胞增生，伴有血管翳形成，軟骨和骨受損，最后導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能喪失［12］。 病理變化可能是由滑膜細(xì)胞損傷、滑膜組織浸潤過程中炎癥細(xì)胞釋放的促炎細(xì)胞因子、趨化因子等因素共同作用引起的［13］。 有研究報(bào)道，炎癥因子在RA 的發(fā)展中起著重要作用［14］。 RA 發(fā)病初期患者會感到關(guān)節(jié)腫脹、屈伸不利、晨僵產(chǎn)生疼痛、關(guān)節(jié)變形、嚴(yán)重會導(dǎo)致殘疾并伴隨全身性并發(fā)癥、臟腑功能的紊亂［15］。盡管RA 在臨床治療中取得一定的進(jìn)展，如利用生物制劑、激酶抑制劑、MTX 等進(jìn)行治療，但上述藥物均存在因眾多不良反應(yīng)，總體療效仍不理想，因此尋找副作用小且療效確切的抗RA 藥物十分重要。

在RA 的模型中，CIA 模型被研究得最為廣泛，與人類RA 在形態(tài)學(xué)上有許多相似之處，包括血管翳的形成、滑膜炎和軟骨的模式以及骨侵蝕［16］。 因此，本研究采用抗體牛Ⅱ型膠原和不完全弗氏佐劑配成膠原蛋白乳劑誘導(dǎo)RA 大鼠模型，模型組大鼠出現(xiàn)食欲不振、體重減輕、足爪腫脹度升高等典型癥狀，提示RA 大鼠模型的成功建立。

苗藥鐵筷子是一種具有理氣止痛、祛風(fēng)解毒作用的藥物，主治風(fēng)濕痹痛、胃痛、腹痛等常見的疼痛病癥，是苗族常用于治療風(fēng)濕痹痛、跌打損傷的藥物之一，對于消除關(guān)節(jié)腫脹，改善關(guān)節(jié)功能具有較好的療效［17］。 在此療效上，貴州許多醫(yī)藥企業(yè)還在此基礎(chǔ)上以鐵筷子為主開發(fā)了“筋骨傷噴霧”“通絡(luò)骨寧”等藥物，具有祛風(fēng)除濕、通經(jīng)活血、敗毒止痛的功效，此外，鐵筷子還是苗藥透骨香方中的主要方藥［18］。

研究證實(shí)，鐵筷子具有抗菌、抗炎癥、抗腫瘤和止痛等多方面的功能，其提取物對RA 有著較好的治療作用，能減輕關(guān)節(jié)腫脹程度、抑制血清炎癥因子TNF-α、IL-1β、PAF，還能明顯下調(diào)關(guān)節(jié)組織中HIF-1α 及VEGF、MMP-3 的表達(dá)［19-20］。

RA 局灶骨破壞主要發(fā)生在關(guān)節(jié)表面骨血管翳附著處和軟骨及骨小梁處，且破壞處組織中破骨細(xì)胞數(shù)量與活性明顯增加［21］，研究顯示破骨細(xì)胞的活化是RA 的骨質(zhì)破壞的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。 RANKL/RANK/OPG 信號通路是破骨細(xì)胞分泌的一種跨膜信號分子，在RA 發(fā)病的骨破壞過程中發(fā)揮著重要作用。RANKL、RANK 及OPG 均屬于糖蛋白，RANKL、OPG在成骨細(xì)胞中發(fā)揮重要作用，抑制破骨細(xì)胞的分化和活性。 而RANK 蛋白在破骨細(xì)胞前體細(xì)胞有高表達(dá)。 RANKL 可以通過誘導(dǎo)破骨細(xì)胞參與促進(jìn)骨質(zhì)破壞，而OPG 則可以通過抑制RANKL 與其受體RANK 的結(jié)合來阻止骨質(zhì)破壞，RA 病理過程中產(chǎn)生的多種促炎細(xì)胞因子上調(diào)該信號通路，刺激破骨細(xì)胞的活性，從而導(dǎo)致骨破壞。 因此防治RA 骨破壞的調(diào)節(jié)RANKL 和OPG 表達(dá)之間的相對平衡有助于預(yù)防和治療骨破壞。 本實(shí)驗(yàn)通過Micro-CT 檢測：在鐵筷子各治療組中，相對于低劑量組，高劑量組鐵筷子的大鼠骨量和骨密度明顯增高，骨表面體積指數(shù)顯著降低；高劑量組對RA 大鼠的關(guān)節(jié)骨質(zhì)破壞起到了保護(hù)作用［22］。 TRAP 染色結(jié)果提示：與低劑量組相比，中劑量組和高劑量組干預(yù)下TRAP 染色陽性破骨細(xì)胞數(shù)量減少，鐵筷子有效抑制了RA 大鼠關(guān)節(jié)破骨細(xì)胞的生成和活化。 進(jìn)一步檢測結(jié)果顯示：在qRT-PCR 結(jié)果中，鐵筷子不同劑量3 組對比，只有鐵筷子高劑量組OPG mRNA 相對表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05），證明鐵筷子可以有效抑制RANK的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)OPG、BMP-2 的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，其中以鐵筷子高劑量組改善效果最為明顯。 上述結(jié)果提示，鐵筷子可能通過調(diào)節(jié)OPG/RANKL/RANK 信號通路，抑制破骨細(xì)胞的生成與活化，從而對RA 大鼠的骨關(guān)節(jié)起到保護(hù)作用。

本項(xiàng)目以RANKL/RANK/OPG 系統(tǒng)為切入點(diǎn)，從防治骨質(zhì)破壞的角度，綜合運(yùn)用植物化學(xué)、藥理學(xué)以及分子生物學(xué)等研究手段，觀察鐵筷子對RA的治療作用，探索其治療機(jī)制，為充實(shí)鐵筷子治療RA 的科學(xué)內(nèi)涵提供新的思路。