小鼠支氣管肺泡灌洗術(shù)研究進展

吳志豪，楊露銀，任維，周雅楠，王紅，雷云，于紅*，楊思進*

（1. 西南醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川瀘州 646000；2. 西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，四川瀘州 646000）

支氣管肺泡灌洗術(shù)（bronchoalveolar lavage，BAL）在呼吸系統(tǒng)疾病中發(fā)揮著重要作用。 醫(yī)務(wù)人員可以借助這項技術(shù)了解患者肺部的炎癥水平、細胞類型等信息，以便更準(zhǔn)確地對呼吸系統(tǒng)疾病進行診斷和治療［1］。 同時，這項技術(shù)也可以用于評估藥物的療效［2］、探索疾病的發(fā)病機制等［3］，為呼吸系統(tǒng)疾病的治療提供更好地指導(dǎo)。 目前，已有多項指南提出了臨床患者支氣管肺泡灌洗標(biāo)準(zhǔn)操作方法［4-5］，還包括支氣管肺泡灌洗液的規(guī)范化檢測流程等，這為臨床操作提供了有益指導(dǎo)。

小鼠作為肺部疾病研究常用的模型動物，被廣泛運用于肺部感染［6］、肺纖維化［7］、哮喘［8］等疾病的研究中。 由于缺乏統(tǒng)一的小鼠支氣管肺泡灌洗標(biāo)準(zhǔn)流程，研究者在實驗小鼠支氣管肺泡灌洗液的取樣和檢測方法上存在較大差別，不同的取樣和處理方法可能會對后續(xù)的檢測結(jié)果產(chǎn)生影響，這不僅限制了支氣管肺泡灌洗術(shù)在領(lǐng)域內(nèi)的推廣和應(yīng)用，還可能導(dǎo)致實驗結(jié)果間缺乏可比性及可重復(fù)性。因此，建立一套規(guī)范并易于推廣的支氣管肺泡灌洗流程就顯得尤為重要。 本文系統(tǒng)地總結(jié)了國內(nèi)外研究中小鼠支氣管肺泡灌洗的操作方法，以期能為研究者運用并建立規(guī)范的小鼠支氣管肺泡灌洗流程提供參考和指導(dǎo)。

1 麻醉

為了獲得一份高質(zhì)量的小鼠支氣管肺泡灌洗液，研究者通常需要對實驗小鼠進行適當(dāng)?shù)穆樽?。常用的全身性麻醉藥物從給藥途徑上大致分為兩類：注射類麻醉藥和吸入性麻醉藥。 注射類麻醉藥物主要包括戊巴比妥鈉、三溴乙醇、氯胺酮及甲苯噻嗪等，而吸入性麻醉藥主要包括異氟烷、七氟烷等［9］。 小鼠常用的麻醉劑及其劑量、特點等相關(guān)信息匯總見表1。

表1 小鼠常用麻醉劑匯總Table 1 Common anesthetics for mice

由于支氣管肺泡灌洗會對小鼠造成較大的損傷，并且為了確保插管被正確放置在氣管內(nèi)，多數(shù)研究者選擇將實驗小鼠安樂死后再進行解剖和灌洗。 戊巴比妥鈉是最常見的安樂死制劑。 在使用戊巴比妥鈉對小鼠進行安樂死時，聯(lián)合使用局部麻醉藥和抗驚厥藥以幫助動物緩解疼痛是有必要的。同時，為了確保小鼠氣管及肺部的完整并順利完成后續(xù)的灌洗操作，一般不采用頸椎脫臼法和斷頭法處理小鼠。

對非臨終小鼠進行支氣管肺泡灌洗存在以下困難和挑戰(zhàn)：（1）盡管灌洗方法在不斷改進，但灌洗液總會殘留一部分在肺內(nèi)，導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)急性肺損傷等并發(fā)癥［11］；（2）研究者需要謹(jǐn)慎選擇麻醉藥物，應(yīng)盡可能選擇對小鼠呼吸、循環(huán)系統(tǒng)影響較小的藥物，此外，對實驗小鼠進行多次支氣管肺泡灌洗時，研究者還應(yīng)當(dāng)注意麻醉劑可能會影響肺泡灌洗液中細胞總數(shù)或總蛋白水平［11］；（3）在手術(shù)操作和術(shù)后恢復(fù)過程中，研究者都需要注意對小鼠進行保溫及生命體征監(jiān)測，以確保其存活。

2 灌洗方式

小鼠支氣管肺泡灌洗常用的操作方式包括在體灌洗和離體灌洗。 離體灌洗是將動物支氣管及肺部完整解剖分離后在體外進行灌洗，其優(yōu)點是灌洗回收率相對較高，但可能會對灌洗液中的細胞活性產(chǎn)生影響。 此外，離體灌洗的解剖過程耗時較長，要求研究者具有豐富的解剖經(jīng)驗，在過程中還需要注意避免手術(shù)器械刺傷肺葉等情況。

在體灌洗是多數(shù)研究者選用的灌洗方式，根據(jù)操作方式不同又可進一步分為氣管切開灌洗和氣管插管灌洗。 氣管切開灌洗是目前的主流灌洗方式［12-13］，主要包括麻醉小鼠、暴露小鼠氣管并半剪開、導(dǎo)管插入氣管后尼龍繩固定、灌洗等步驟。Luckow 等［14］提出，氣管切開灌洗操作步驟復(fù)雜、耗時較長，操作者在實驗前需要經(jīng)過大量培訓(xùn)；而經(jīng)口氣管插管只需要使用導(dǎo)管從口咽插入氣管即可開始灌洗，相對氣管切開更為簡便、花費時間較短，并且經(jīng)口氣管插管獲得的灌洗液中細胞數(shù)量更多。值得注意的是，經(jīng)口氣管插管雖然較氣管切開相對簡便，但經(jīng)口氣管插管仍需要暴露小鼠肺部及氣管，以確保插管正確進入并保持在合適的位置，并且小鼠氣管插管存在一定難度，反復(fù)插管失敗可能會導(dǎo)致小鼠咽喉部出現(xiàn)傷口，血液混入灌洗液中造成污染。 在體灌洗的兩種方法都有各自的優(yōu)缺點，研究者可以結(jié)合自身操作經(jīng)驗并進行預(yù)實驗以確定操作方式。 最后，不論選擇哪種方法，研究者都應(yīng)仔細操作，避免破壞小鼠氣管及肺部的完整性，導(dǎo)致灌洗液漏出或污染。

3 灌洗裝置

目前，商業(yè)化的小鼠支氣管肺泡灌洗裝置尚未普及，研究者在進行實驗時往往需要自行組裝實驗所需的操作設(shè)備，這些設(shè)備雖然更貼合實驗者的個人習(xí)慣，但存在一定的缺陷。 研究者組裝所用的部分裝置或工具，可能在其他國家或地區(qū)難以購買到，這會導(dǎo)致部分經(jīng)過改良的灌洗裝置難以在其他國家或地區(qū)推廣和應(yīng)用。 因此，實驗者在組裝和改進灌洗裝置時，應(yīng)考慮到設(shè)備在其他國家或地區(qū)是否可獲得并且易于組裝。

灌洗設(shè)備主要依據(jù)實驗者采用氣管切開還是氣管插管灌洗而組裝，下面將分別論述不同灌洗方式所采用的基本裝置組成。

氣管切開灌洗：氣管切開灌洗所用裝置主要包括注液部分（注射器）、插管部分（針頭和套管）、固定部分（尼龍繩）。 注液部分由注射器構(gòu)成，小鼠肺泡灌洗通常選擇1 mL 注射器。 插管部分由針頭和套管組成，套管較柔軟，單獨使用不能很好地進入小鼠氣管；注射器針頭尖銳，單獨使用可能會損傷氣管，并且也不能很好地堵塞氣管。 因此需要在注射器針頭上套入一段硅膠軟管，這樣既可以避免針頭戳傷氣管，也能起到防止灌洗液漏出的作用。 這種方法的弊端是套入的硅膠軟管需要研究者自行裁剪，而且軟管口徑與針頭口徑存在差別，可能導(dǎo)致針頭與軟管之間難以固定。 張效云等［15］將靜脈滯留針用于氣管灌洗，成功回收89%以上的肺泡灌洗液。 此外，Sun 等［13］成功使用22G 靜脈穿刺針用于支氣管肺泡灌洗。 靜脈留置針在臨床中廣泛使用，商業(yè)化產(chǎn)品豐富，可選用22G 或24G 型號的留置針進行支氣管肺泡灌洗。 靜脈留置針與穿刺針都是使用具有一定硬度的針芯引導(dǎo)軟管進入氣管，可酌情選用。

氣管插管灌洗：氣管插管灌洗所用裝置主要包括注液部分（注射器）、插管部分（插管針）。 注液部分同樣選用1 mL 注射器，而插管針則可使用小鼠直頭灌胃針或直型橄欖尖插管［14］。 氣管插管法雖然沒有使用尼龍繩固定，但插管的鈍端可堵住小鼠聲門部，防止灌洗液倒流。

氣管切開法適用于對臨終小鼠進行支氣管肺泡灌洗，而氣管插管灌洗雖然也需要暴露氣管部分，但完整地保留了小鼠氣管，因此更適合于非臨終小鼠的支氣管肺泡灌洗。

4 灌洗液

一份高質(zhì)量的灌洗液可以提高后續(xù)結(jié)果的準(zhǔn)確性及可靠性，而灌洗液的種類、保存方法和處理方式等條件則是影響灌洗液質(zhì)量的重要因素。

灌洗液通常為中性、等滲的液體，常用的灌洗液包括生理鹽水、磷酸鹽緩沖液（PBS）以及平衡鹽溶液，其中生理鹽水和磷酸鹽緩沖液因為其生理特性更受國內(nèi)外研究者喜愛［16-17］。 對于灌洗液的溫度設(shè)置，研究者們通常將灌洗液預(yù)冷后使用［18］，但并沒有解釋其原因。 一般而言，以細胞收集、培養(yǎng)為目的的研究，可以將灌洗液保持在37℃左右，這樣做可能減少灌洗過程中對組織和細胞的刺激，如小鼠肺泡巨噬細胞的分離和培養(yǎng)，研究者多選擇將灌洗液加熱后使用［19-20］。 另外值得參考的是，37℃預(yù)熱的生理鹽水在臨床支氣管肺泡灌洗中更為常用［5］；如果研究目的是對灌洗液中的細胞進行計數(shù)、分類以及檢測上清中炎癥因子，那么將灌洗液預(yù)冷并將其低溫保存則是更好的選擇。 因此，灌洗液的選擇及溫度控制需要依據(jù)實驗?zāi)康倪M行選取和設(shè)定。 相比于不含添加劑的生理鹽水或者PBS，復(fù)合型灌洗液通常具有提高酶和細胞活力等優(yōu)勢。常用的添加劑包括胎牛血清（FBS）［21］、乙二胺四乙酸（EDTA）［19］等，胎牛血清可以提高灌洗液中細胞的活性，而EDTA 可以螯合鈣、鎂等金屬離子，加速細胞的脫離，便于灌洗時盡可能多地采集到肺內(nèi)的細胞。 研究表明，復(fù)合PBS 灌洗液（37℃，2 mmol/L EDTA 和0.5% FBS）在灌洗中能收獲更多數(shù)量的細胞［19］。 此外，如果灌洗液中含有較多紅細胞，可以加入紅細胞裂解液以降低紅細胞對后續(xù)結(jié)果的影響。 總的來說，根據(jù)實驗?zāi)康膩磉x擇合適的添加劑將有助于獲得更高質(zhì)量的灌洗液，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

對于灌洗液的保存裝置，大多數(shù)研究者選擇將灌洗液收集后置于塑料離心管中，并沒有特別強調(diào)離心管的種類。 一般而言，用于生化檢測和細胞因子分析的液體可以保存在普通離心管中，而用于病原學(xué)分析則應(yīng)使用無菌容器收集［22］，尤其在細胞分析時最好選用硅化玻璃容器或者無細胞粘附的塑料容器［10］，盡可能地減少細胞損失。

在獲得肺泡灌洗液后，研究者需要及時對灌洗液進行處理，可以將灌洗液試管置于冰上或冷藏，將灌洗液離心后分為細胞成分及上清液分別保存，以供后續(xù)檢測。 細胞成分可以通過總細胞或白細胞計數(shù)進行分析。 不同方式獲得的灌洗液中，其細胞總數(shù)可能存在差異，但不同細胞群的比例是相對固定的。 傳統(tǒng)的細胞計數(shù)法主要通過將細胞重懸后制成細胞涂片，利用瑞氏染液進行染色，再由研究者在顯微鏡下進行計數(shù)并進一步判斷出中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、巨噬細胞等細胞類型。 這種方法目前正受到許多研究者的質(zhì)疑，因為細胞的計數(shù)和分類可能因為人為錯誤而影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。相比而言，基于流式細胞術(shù)的細胞計數(shù)和分類法正成為一種更快速、更準(zhǔn)確的檢測方法。

上清液常用于生化及細胞因子檢測，檢測方法主要包括ELISA、活性氧檢測等。 此外，基于流式的多因子檢測法因為其高效、快速、所需樣本量少等優(yōu)點，正受到越來越多的研究者的關(guān)注。 檢測細胞因子時需要注意，多次的洗滌會稀釋細胞因子的濃度，因此檢測第一次灌洗所得灌洗液會更加合適。

若不能及時對灌洗液進行檢測，則應(yīng)將灌洗液進行保存，通常來說，細胞在灌洗液（4℃）中的保存時間應(yīng)盡可能短，而上清液則可保存在-80℃條件中直至檢測。

表2 匯總了國內(nèi)外部分研究中灌洗液的種類、處理方法等參數(shù)信息，可以看到，不同的研究之間灌洗液的處理條件存在較大差異，未來還需要更多的研究探討不同的灌洗液處理條件對后續(xù)結(jié)果的影響，并且研究者也需要在文獻中更加詳細地描述灌洗液的參數(shù)，便于其他研究者參考和借鑒。

表2 支氣管肺泡灌洗參數(shù)匯總Table 2 Summary of bronchoalveolar lavage parameters

5 灌洗部位

由于小鼠支氣管口徑較小，難以使用支氣管鏡進行操作，通常采取全肺灌洗或灌洗單側(cè)肺部以獲得灌洗液。 研究者若期望獲得更多的灌洗標(biāo)本，則需要采用全肺灌洗的方法進行操作，但這種方法的弊端是在一定程度上降低了動物組織標(biāo)本的利用度，可能會導(dǎo)致實驗動物數(shù)量增加，違反了實驗動物減量化、再利用和再循環(huán)的原則［32］。 同時還應(yīng)該注意到，灌洗的過程對肺組織有一定的損傷，一些細胞或者分泌物可能被沖刷掉，雖然有部分研究者選擇將灌洗后的肺葉用于組織學(xué)檢查［28］，但夾閉小鼠單側(cè)肺葉再進行灌洗，將未灌洗的肺葉用于組織學(xué)檢查可能是更好的選擇［26-27］，研究者應(yīng)結(jié)合疾病模型特點等，選擇病變顯著側(cè)肺葉進行灌洗。

6 灌洗量及速度

過量的灌洗液會導(dǎo)致小鼠肺內(nèi)壓力升高，可能會出現(xiàn)灌洗液從肺組織包膜滲入胸腔等情況，嚴(yán)重影響灌洗液回收。 常用的單次小鼠支氣管肺泡灌洗液量通常為0.2 ～1.0 mL。 研究表明，灌洗液產(chǎn)生的拉伸力和剪切力可能會對細胞造成一定的影響［33］，相比于1 mL 灌洗液，0.5 mL 及0.75 mL 的灌洗液收集到的細胞活性更高。

而對于灌洗液的推注速度，目前尚缺乏研究探討這一參數(shù)對結(jié)果的影響。 大部分研究者采取的是手工推注灌洗液而并非使用可調(diào)節(jié)流量速度的微量注射泵，因此難以對該參數(shù)進行量化和比較。較為公認的是，研究者在灌洗時應(yīng)略緩慢地將灌洗液注入肺部，并仔細觀察肺部膨脹程度，避免液體滲漏［10］。

7 回收率

灌洗液的回抽依賴于肺部的彈性。 相比于急性肺損傷而言，一些疾病如肺氣腫等會嚴(yán)重影響小鼠的肺部彈性，最終影響灌洗液的回收率。 雖然灌洗液的回收率似乎可以作為評估實驗操作成功與否的重要指標(biāo)，但由于不同的實驗者間灌洗的操作方法并不統(tǒng)一，而且動物疾病模型也不同，所以很難對回收率進行比較。 因此，是否可以將灌洗液的回收率作為小鼠支氣管肺泡灌洗術(shù)成功的標(biāo)準(zhǔn)之一，還需要更進一步的討論。

8 總結(jié)與結(jié)論

近年來，隨著新型冠狀病毒感染的流行，急性肺損傷、肺纖維化等疾病受到了越來越多研究者的關(guān)注。 支氣管肺泡灌洗作為呼吸疾病研究中的重要檢測手段之一，目前仍存在許多亟待解決的問題，如灌洗液采集和檢測流程的不統(tǒng)一，這些都可能會限制該技術(shù)的傳播和推廣，同時也可能導(dǎo)致部分實驗結(jié)果難以被復(fù)現(xiàn)，影響實驗的可靠性。 因此，推進小鼠支氣管肺泡灌洗術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化流程的建立便顯得十分必要。