評(píng)價(jià)白蛋白相關(guān)藥物動(dòng)物模型的研究進(jìn)展

資崯，寧麗，周小青，唐成程

（廣東省醫(yī)學(xué)大動(dòng)物模型重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，華南生物醫(yī)藥大動(dòng)物模型研究院，生物科技與大健康學(xué)院，五邑大學(xué)，廣東江門 529000）

人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）是血漿中含量最豐富的蛋白質(zhì)，占血漿蛋白總量的40%，與脂肪酸、激素和化學(xué)藥物在內(nèi)的多種物質(zhì)進(jìn)行可逆結(jié)合，調(diào)節(jié)這些物質(zhì)在體內(nèi)的運(yùn)輸，因此也是一種天然的運(yùn)輸載體［1］。 白蛋白體內(nèi)半衰期為19 d［2-4］，遠(yuǎn)高于除免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）以外的其他血漿蛋白，F(xiàn)cRn 受體（neonatal Fc receptor ，F(xiàn)cRn）是白蛋白半衰期的主要調(diào)節(jié)因子［5-8］。 FcRn 受體最初發(fā)現(xiàn)于腸道，功能主要為新生幼體提供被動(dòng)免疫。 隨后發(fā)現(xiàn)FcRn 是血液中IgG 和白蛋白的特異性受體，幾乎表達(dá)在所有細(xì)胞表面［9-11］。 FcRn 與白蛋白的結(jié)合具有pH 依賴性，弱酸性環(huán)境下結(jié)合，中性或堿性條件下解離［12-13］。血管內(nèi)皮細(xì)胞是FcRn 介導(dǎo)白蛋白再循環(huán)的主要場(chǎng)所，包含白蛋白的細(xì)胞外液被血管內(nèi)皮細(xì)胞非特異性胞飲后，白蛋白與含有FcRn 的酸化內(nèi)體結(jié)合形成復(fù)合物，隨后該復(fù)合物被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜表面，暴露于血液中，由于血液中pH 值為微堿性，復(fù)合物解離，白蛋白再次被釋放至血液循環(huán)。 而在酸化內(nèi)體中未能與FcRn 相結(jié)合的蛋白則會(huì)被運(yùn)送至溶酶體中降解［7］。

由于在血漿中含量豐富、結(jié)合位點(diǎn)多、半衰期長(zhǎng)、不會(huì)產(chǎn)生免疫原性等諸多優(yōu)勢(shì)使得白蛋白被廣泛應(yīng)用于藥物載體研究，以延長(zhǎng)藥物的半衰期，改善藥物的藥代動(dòng)力學(xué)特征［14-15］。 目前基于白蛋白的藥物研發(fā)主要有兩種：（1）重組白蛋白藥物：重組白蛋白藥物又包括兩類，一類是通過共價(jià)鍵作用針對(duì)白蛋白的氨基酸進(jìn)行修飾，如目前正處于三期臨床實(shí)驗(yàn)用于治療癌癥和關(guān)節(jié)炎疾病的人血清白蛋白偶聯(lián)甲氨蝶呤（ methotrexate-human serum albumin，MTX-HSA）［16］；另一類是通過基因融合技術(shù)［17］將治療性多肽或者蛋白與白蛋白融合，這些治療性多肽或者蛋白包括凝血因子［18］、干擾素［19］等。（2）白蛋白結(jié)合藥物，即將藥物進(jìn)行脂肪酸化或親白蛋白有機(jī)小分子修飾后，藥物通過脂肪酸或有機(jī)小分子與內(nèi)源性白蛋白結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，如已經(jīng)上市的用于治療糖尿病的藥物 Levemir［20］和Victoza［21-22］，用于治療癌癥的Abraxane［23］等。

建立用于評(píng)價(jià)白蛋白相關(guān)藥物的動(dòng)物模型是白蛋白相關(guān)藥物開發(fā)與研究中的重要環(huán)節(jié)。 隨著對(duì)白蛋白認(rèn)識(shí)的深入、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)的不斷發(fā)展以及基因編輯等技術(shù)的高速進(jìn)步，用于評(píng)價(jià)白蛋白相關(guān)藥物動(dòng)物模型種類也更加全面。 本綜述概括了用于評(píng)價(jià)白蛋白相關(guān)藥物藥代動(dòng)力學(xué)的嚙齒類與非嚙齒類動(dòng)物模型，為白蛋白相關(guān)藥物進(jìn)一步研究發(fā)展提供一定參考。

1 白蛋白相關(guān)藥物嚙齒類動(dòng)物模型

嚙齒類動(dòng)物模型因其操作簡(jiǎn)便、獲得容易、繁殖周期短，具有經(jīng)濟(jì)、可重復(fù)性高等優(yōu)勢(shì)，被廣泛應(yīng)用于藥物臨床前藥效評(píng)價(jià)。 目前，白蛋白相關(guān)藥物嚙齒類動(dòng)物模型主要包括野生型鼠模型和基因修飾小鼠模型兩大類。

1.1 野生型小鼠模型

野生型（wild type，WT）小鼠（表1）具有遺傳背景明確、品系多、價(jià)格便宜等優(yōu)勢(shì)，此外，鼠與人類有大約90%的相似基因，許多生理通路在臨床上是相關(guān)的［24］，成為早期白蛋白相關(guān)藥物藥代動(dòng)力學(xué)研究的一線模型［25］。 例如，研究人員通過將錨蛋白重復(fù)結(jié) 構(gòu) 域 （ designedankyrin repeat proteins，DARPins）［26-29］與鼠白蛋白（mouse serum albumin，MSA）共價(jià)結(jié)合后注入到野生型小鼠中，使其血漿半衰期從原來的幾分鐘延長(zhǎng)到50 h 左右，而在進(jìn)一步將與白蛋白結(jié)合的DARPins 結(jié)構(gòu)域與其他DARPins 結(jié)構(gòu)域結(jié)合時(shí)，白蛋白相關(guān)藥物在小鼠的半衰期進(jìn)一步提高了48%［30-31］。 除此之外，在WT小鼠中檢測(cè)白蛋白結(jié)合多肽融合到其他蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的體內(nèi)代謝，如將鏈球菌蛋白G 結(jié)構(gòu)域（albumin-binding domain，ABD）與Herceptin 的Fab（fragment of antigen binding，F(xiàn)ab）片段、二抗或者小螺旋蛋白結(jié)合，在小鼠體內(nèi)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)血漿半衰期分別從2.1 h 延長(zhǎng)到20.9 h、5.6 h 延長(zhǎng)到47.5 h 和30 min 延長(zhǎng)到41 h［32-36］。

表1 白蛋白相關(guān)藥物評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物比較Table 1 Comparison of albumin-related drugs in laboratory animals

FcRn 是白蛋白長(zhǎng)半衰期的主要調(diào)節(jié)因子，體外研究表明小鼠FcRn（mouse FcRn，mFcRn）對(duì)MSA的結(jié)合能力比對(duì)HSA 的結(jié)合能力高25 倍［17，37］。 因此，雖然白蛋白相關(guān)藥物體內(nèi)血漿半衰期延長(zhǎng)在WT 小鼠模型中被成功模擬，但mFcRn 對(duì)于體內(nèi)MSA 的高結(jié)合力可能會(huì)使與mFcRn 結(jié)合的白蛋白相關(guān)藥物明顯減少，導(dǎo)致用野生型小鼠評(píng)價(jià)重組白蛋白藥物的半衰期所獲得的數(shù)據(jù)可能低于實(shí)際值。已經(jīng)證明，在低白蛋白患者中注射重組人白蛋白的循環(huán)半衰期相較于正?；颊咴黾恿? ～5 倍，這可能是由于患者中內(nèi)源性白蛋白對(duì)FcRn 受體的競(jìng)爭(zhēng)較少［38］，導(dǎo)致注射的重組人白蛋白與FcRn 受體的結(jié)合增加，從而導(dǎo)致其半衰期相較于正?；颊哂兴黾?。

mFcRn 對(duì)于MSA 及HSA 結(jié)合力的高差異性，使得WT 小鼠模型用于評(píng)價(jià)白蛋白相關(guān)藥物受到質(zhì)疑，為此科學(xué)家開發(fā)了一系列的基因修飾動(dòng)物模型用于白蛋白相關(guān)藥物的藥代動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)。

1.2 基因修飾小鼠模型

基因修飾小鼠模型是指通過基因編輯對(duì)小鼠特定基因進(jìn)行改造而獲得表達(dá)目的基因的小鼠，該類模型廣泛應(yīng)用于各類藥物臨床前研究。 目前用于評(píng)估白蛋白相關(guān)藥物藥代動(dòng)力學(xué)的基因修飾小鼠包括以下3 類：（1）人FcRn（humanFcRn，hFcRn）單基因修飾（hFcRn＋/＋）小鼠；（2）hFcRn、小鼠白蛋白基因（mousealbumin，mAlb） 敲除雙基因修飾（hFcRn＋/＋，mAlb-/-） 小鼠；（3）hFcRn、人白蛋白（humanalbumin，hAlb） 雙基因修飾（hFcRn＋/＋，hAlb＋/＋）小鼠。

1.2.1hFcRn單基因修飾（hFcRn＋/＋）小鼠

已有研究表明mFcRn 對(duì)MSA 及HSA 的結(jié)合能力存在明顯差異，為了更好地模擬白蛋白與FcRn之間的相互作用，科研工作者構(gòu)建了hFcRn＋/＋小鼠模型，主要包括Tg276 和Tg32［39-40］。 這兩類小鼠都是通過在mFcRn第一外顯子處插入Neomycin 破壞小鼠內(nèi)源性mFcRn的完整表達(dá)。 并且用hFcRn替換小鼠mFcRn基因。 Tg276 小鼠在CAG 啟動(dòng)子的控制下表達(dá)hFcRn基因cDNA，而Tg32 小鼠則在hFcRn啟動(dòng)子的控制下表達(dá)含有完整hFcRn基因組DNA 序列［41］。 HSA 的血漿半衰期對(duì)比于WT 小鼠62.4 ± 2.4 h，在Tg32 的血漿半衰期為139.2 ±12 h［42-44］，與HSA 在人類中的血漿半衰期更加接近，說明該模型相較于WT 小鼠能夠很好地模擬HSA 在人體中的代謝情況。 Tg32 小鼠高FcRn 親和力白蛋白變體（K573P）的血漿半衰期與WT 小鼠相比，從30.6 h 延長(zhǎng)到了95.2 h［43］；具有3 種氨基酸取代的白蛋白突變體QMP（E505Q/T527 M/K573P）Tg32 小鼠中的血漿半衰期（4.8 d）比WT HSA 在該小鼠模型中（2 d）的兩倍還多［12］。 在hFcRn＋/＋Tg276 小鼠中，也觀察到了相似的結(jié)果。 Schmidt等［42］采用另外兩種對(duì)FcRn 具有高親和力的白蛋白突變體：HSA5（V547A）和HSA7（V547A/E505 G）于Tg276 小鼠中檢測(cè)相應(yīng)的血漿半衰期，發(fā)現(xiàn)這兩種HSA 突變體的半衰期分別為46.2 h 和44.9 h，相較于WT HSA 的半衰期（29.2 ～31.4 h）均延長(zhǎng)了1.5倍左右。 以上結(jié)果表明hFcRn＋/＋小鼠能更好地模擬對(duì)hFcRn 具有較高親和力的HSA 變體在人體內(nèi)的代謝情況。 除此之外，hFcRn＋/＋小鼠對(duì)比于WT小鼠也能夠更好地模擬重組白蛋白物在人體內(nèi)的藥代動(dòng)力。 例如，Lombardi 等［45］利用QMP 與凝血因子Ⅶ結(jié)合，并在Tg32 小鼠中檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)對(duì)比于與HSA 結(jié)合的凝血因子Ⅶ（2 d），其顯著延長(zhǎng)了血漿半衰期（7 d）。

盡管hFcRn＋/＋小鼠增強(qiáng)了其對(duì)HSA 的結(jié)合能力，能夠更好地模擬包括HSA 變體及重組白蛋白藥物在人體內(nèi)的代謝，但是已有研究表明MSA 對(duì)hFcRn 的結(jié)合力是HSA 的5 倍［25，37，43］。 因此，hFcRn＋/＋小鼠中內(nèi)源性MSA 會(huì)與HSA 競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合hFcRn，從而影響白蛋白藥物藥代動(dòng)力學(xué)評(píng)估［17］。

1.2.2hFcRn、mAlb雙基因修飾（hFcRn＋/＋，mAlb-/-）小鼠

為了克服內(nèi)源性MSA 與HSA 競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合hFcRn 對(duì)白蛋白藥物藥代動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)帶來的負(fù)面影響，Roopenian 等［44］通過TALEN 技術(shù)在FcRn人源化（Tg32）小鼠的基礎(chǔ)上進(jìn)一步構(gòu)建缺乏自身白蛋白表達(dá)的品系（Tg32-Alb-/-），即在Tg32 小鼠的基礎(chǔ)上敲除小鼠內(nèi)源性MSA基因4 號(hào)外顯子2bp，使其過早形成終止密碼子來實(shí)現(xiàn)自身白蛋白表達(dá)的缺陷，該小鼠模型排除了內(nèi)源性MSA 的影響，更加適合用于評(píng)估HSA 藥代動(dòng)力學(xué)。 借助該小鼠模型發(fā)現(xiàn)HSA 的血漿半衰期為24 d，與在人體中的半衰期（19 d）相當(dāng)。 因此，認(rèn)為這種hFcRn＋/＋、mAlb-/-（Tg32-Alb-/-）小鼠模型是一種能夠很好地模擬人體評(píng)估白蛋白藥物藥代動(dòng)力學(xué)的嚙齒類動(dòng)物模型，這也說明了hFcRn 的存在和缺乏競(jìng)爭(zhēng)的內(nèi)源性MSA 競(jìng)爭(zhēng)可有效地保護(hù)WT HSA，防止被降解。

雖然hFcRn＋/＋、mAlb-/-小鼠模型能夠使HSA的血漿半衰期延長(zhǎng)至與在人體中相當(dāng)，且在白蛋白藥物評(píng)估中發(fā)揮著巨大作用，但是給白蛋白藥物后，外源性白蛋白與內(nèi)源性HSA 會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合FcRn 受體，而hFcRn＋/＋、mAlb-/-小鼠不能正常模擬內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)，致使該類模型用于白蛋白藥物評(píng)價(jià)受到質(zhì)疑。

1.2.3hFcRn、hAlb雙基因修飾（hFcRn＋/＋，hAlb＋/＋）小鼠

雖然hFcRn＋/＋小鼠模型及hFcRn＋/＋、mAlb-/-小鼠可以模擬hFcRn 對(duì)HSA 的結(jié)合能力，但是hFcRn＋/＋小鼠MSA 對(duì)hFcRn 的親和力遠(yuǎn)高于HSA對(duì)hFcRn 的親和力［25］，使內(nèi)源性MSA 比HSA 更易結(jié)合hFcRn 受體［17］，hFcRn＋/＋、mAlb-/-小鼠缺乏內(nèi)源性白蛋白與外源性白蛋白競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合hFcRn 受體。 為了更加真實(shí)地模擬人體內(nèi)白蛋白藥物及HSA 與hFcRn 受體的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，Viuff 等［25］于2016年建立了第一個(gè)由內(nèi)源性啟動(dòng)子控制并且同時(shí)攜帶hFcRn和HSA基因（hFcRn＋/＋，hAlb＋/＋）的雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型，通過將hFcRncDNA 定點(diǎn)插入到鼠mFcRn基因的2 號(hào)外顯子處，同時(shí)將編碼HSA的cDNA 序列定點(diǎn)插入小鼠MSA基因1 號(hào)外顯子處，因此，hFcRn和HSA的表達(dá)都受到小鼠對(duì)應(yīng)基因內(nèi)源性啟動(dòng)子的控制。 該小鼠模型的血清HSA 濃度為17 mg/mL，而另外30 種血清成分的水平與野生型小鼠相當(dāng)，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)來源于該基因修飾小鼠的血清白蛋白（501.9 ± 101.2 nmol/L）、來源于人的血清白蛋白（641.1 ± 89.7 nmol/L）和天然序列的重組人血清白蛋白（797.9 ± 155.0 nmol/L）對(duì)hFcRn 有著相似的結(jié)合能力。 進(jìn)一步采用hFcRn＋/＋，hAlb＋/＋小鼠進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)與FcRn具有低結(jié)合能力的低結(jié)合蛋白（low binding protein，LB）血清半衰期為29 ± 3 h，高結(jié)合蛋白（high binding protein ，HB）的半衰期為80 ± 18 h，重組白蛋白半衰期為57 ± 13 h［45］，當(dāng)中LB 的血漿半衰期最短，HB 的血漿半衰期最長(zhǎng)。

該模型同時(shí)克服了FcRn 和白蛋白結(jié)合存在物種差異及外源性與內(nèi)源性白蛋白與FcRn 結(jié)合存在競(jìng)爭(zhēng)這兩個(gè)難題，能更好地模擬人類生理?xiàng)l件，是白蛋白關(guān)聯(lián)藥物的藥代動(dòng)力學(xué)研究中較好的模型。

2 白蛋白相關(guān)藥物非嚙齒類動(dòng)物模型

嚙齒類動(dòng)物雖然在藥物藥代動(dòng)力學(xué)臨床前研究中發(fā)揮著巨大作用，為白蛋白藥物臨床前研究提供了良好模型，但是嚙齒類動(dòng)物在生理特征上與人類之間差異較大，與之相對(duì)應(yīng)的非嚙齒類動(dòng)物具有與人類更加接近的生理特征，可以更好地反映藥物在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特征。 目前，用于研究白蛋白相關(guān)藥物的非嚙齒類動(dòng)物主要為食蟹猴、犬儒猴、獼猴等非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物（nonhuman primates，NHPs）。

NHPs（食蟹猴、犬儒猴、獼猴等）在生理、病理等多方面與人類高度相似，其遺傳物質(zhì)最高可以與人類達(dá)到98.5%的同源性［46-47］，因此，NHPs 能夠更好地模擬人類體內(nèi)代謝條件，有望促進(jìn)各種HSA 藥物藥代動(dòng)力學(xué)研究進(jìn)展。

在食蟹猴中，HSA 的半衰期為131 ～169 h ，而食蟹猴白蛋白在食蟹猴中的血漿半衰期為144 h［2，42-43］，說明HSA 在食蟹猴體內(nèi)有著與食蟹猴白蛋白相似的競(jìng)爭(zhēng)力。 例如，Steiner 等［30］將DARPins結(jié)構(gòu)域與白蛋白結(jié)合，使其在食蟹猴中的血漿半衰期相較于在WT 小鼠中（3.42 d）延長(zhǎng)至20.7 d，這與類比到人體中的50.3 d 更加接近，另一項(xiàng)報(bào)道中通過將凝血因子Ⅷ（FⅧ）與人白蛋白融合后靜脈注射到犬儒猴中，發(fā)現(xiàn)重組FⅧ的半衰期達(dá)到56.1 ～66.1 h，比未重組的FⅧ增加2.6 ～5.0 倍［48］。

雖然NHPs 對(duì)比于非嚙齒類動(dòng)物與人之間有著更加接近的親緣關(guān)系，體型更大更便于監(jiān)測(cè)，但是有研究表明，食蟹猴血清白蛋白對(duì)猴FcRn 的親和力高于人血清白蛋白對(duì)猴FcRn 的親和力［25］，這在一定程度上阻礙了猴FcRn 與HSA 的結(jié)合，同時(shí)由于倫理和經(jīng)濟(jì)的限制，猴子在非臨床試驗(yàn)的廣泛應(yīng)用受到一定限制。

3 總結(jié)與展望

白蛋白作為藥物載體的主要優(yōu)勢(shì)是通過與FcRn 受體的相互作用來延長(zhǎng)藥物的血漿半衰期。動(dòng)物模型作為研究藥物藥代動(dòng)力學(xué)的重要工具是藥物研究中不可或缺的一部分，目前用于評(píng)估白蛋白相關(guān)藥物藥代動(dòng)力學(xué)的動(dòng)物模型包括嚙齒類（野生型小鼠、基因修飾小鼠模型）與非嚙齒（猴）兩大類。 由于白蛋白與FcRn 的結(jié)合存在物種差異，導(dǎo)致無論是使用野生型小鼠還是hFcRn＋/＋小鼠得到的藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)都不能很好地模擬白蛋白相關(guān)藥物在人體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)。 因?yàn)閮?nèi)源性的小鼠白蛋白也會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性地與FcRn 受體結(jié)合，為了更加真實(shí)地模擬人體內(nèi)白蛋白藥物及HSA 與hFcRn 受體的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，制備FcRn和白蛋白雙人源化的動(dòng)物模型至關(guān)重要，因此，Howard 團(tuán)隊(duì)建立了FcRn 和白蛋白雙人源化的小鼠模型，為白蛋白相關(guān)藥物研究提供了較好的小鼠模型［25］。

但小鼠與人類在生長(zhǎng)發(fā)育、生理代謝、體型大小等方面都相差較大，獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不能真實(shí)反映蛋白藥物在人體內(nèi)的代謝過程。 我國(guó)的《化學(xué)藥物非臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》要求：新藥臨床前藥代動(dòng)力學(xué)研究應(yīng)選用至少兩種動(dòng)物，包括嚙齒類和非嚙齒類。 然而，迄今為止，基于白蛋白和FcRn雙人源化的非嚙齒類動(dòng)物模型尚未建立，嚴(yán)重阻礙了白蛋白藥物研究。 雙人源化小鼠模型為白蛋白評(píng)估模型提供了新的思路，該模型在一定程度上模擬了HSA 與FcRn 在人體內(nèi)的相互作用及白蛋白相關(guān)藥物進(jìn)入人體后與源性HSA 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合FcRn 受體的生理狀態(tài)。 NHPs 與人有著極高的相似性，包括生理代謝水平等，在未來是否可以在倫理道德允許的范圍構(gòu)建HSA與FcRn雙人源化的NHPs 模型，理論上這種雙人源化NHPs 模型可以作為最理想的評(píng)價(jià)白蛋相關(guān)藥物藥代動(dòng)力學(xué)的動(dòng)物模型。

總之，對(duì)于藥物臨床前研究，動(dòng)物模型發(fā)揮著巨大作用，建立能夠更好地模擬人類生理學(xué)特征的動(dòng)物模型是任重道遠(yuǎn)的。 隨著各種實(shí)用技術(shù)的發(fā)展與檢測(cè)水平的提高，評(píng)價(jià)白蛋白相關(guān)藥物動(dòng)物模型將會(huì)更加完善，也能更真實(shí)地模擬臨床特征，推進(jìn)白蛋白藥物更進(jìn)一步的研究與發(fā)展。