斑馬魚模型在神經(jīng)退行性疾病研究中的應(yīng)用進展

劉延英

（青島黃海學(xué)院醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教研室，山東青島 266427）

斑馬魚（zebrafish，Danio rerio）是原產(chǎn)于印度東部、巴基斯坦、尼泊爾等地的一種熱帶淡水硬骨魚，屬于輻鰭亞綱（Actinopterygii）、鯉科（Cyprinidae）、短擔(dān)尼魚屬（Danio），因其體側(cè)有類似斑馬樣條紋而得名。 斑馬魚成魚體長一般約為3 ～5 cm，壽命約為2 ～3 年。 19 世紀(jì)70 年代，美國俄勒岡大學(xué)著名遺傳學(xué)家George Streisinger 研究小組對斑馬魚進行了系統(tǒng)研究，為斑馬魚日后能夠成為一種模式動物奠定了基礎(chǔ)。 后來，隨著斑馬魚基因突變體篩選成功、測序技術(shù)和相關(guān)遺傳操作技術(shù)的發(fā)展，斑馬魚以其獨特的優(yōu)勢成為一種能夠?qū)⑴咛W(xué)、遺傳學(xué)和分子生物學(xué)有機結(jié)合在一起的模式動物被用于神經(jīng)發(fā)育、遺傳學(xué)和毒理學(xué)等相關(guān)研究領(lǐng)域。 由于斑馬魚的基因序列、信號傳導(dǎo)通路與人類保持高度相似性，被用于某些疾病模型制備及藥物篩選、器官發(fā)育與再生、生物安全等方面的研究［1-2］。 研究表明，斑馬魚神經(jīng)系統(tǒng)的基本解剖結(jié)構(gòu)、包含的細胞群和化學(xué)成分與人類神經(jīng)系統(tǒng)在整體上相似且在進化上保守［3］，已成為研究人類神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病機制的理想模式動物。 本文就近年來，斑馬魚作為模式動物用于神經(jīng)退行性疾病以及與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病的研究進行綜述。

1 斑馬魚

斑馬魚的生物學(xué)特性及特點包括：（1）體外發(fā)育、胚胎透明和強大的器官再生能力。 隨著活體成像技術(shù)和遺傳學(xué)操作技術(shù)的發(fā)展，斑馬魚已為研究器官發(fā)育和再生及某些疾病的發(fā)病機制和病理過程提供了理想的操作平臺。 （2）極強的繁殖能力、成熟周期短和廉價的飼養(yǎng)成本等特點使斑馬魚在用于大規(guī)模遺傳篩選、化合物篩選和小分子化合物的高通量篩選時優(yōu)于小鼠等其他哺乳類動物。 （3）與細胞培養(yǎng)時忽略內(nèi)環(huán)境的影響不同，斑馬魚在被用于藥物篩選時能夠提供活的生物有機體整體的毒理信息，增加了獲得信息的可靠性。 此外，在斑馬魚早期胚胎中，其血腦屏障的不完整性有利于藥物進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，為研究人員進行大規(guī)模藥物篩選提供了一個既經(jīng)濟又有效的篩選工具［4］。 總之，與其他脊椎模式動物相比，斑馬魚的上述優(yōu)勢，使其成為研究疾病發(fā)病機制的可靠動物模型，在人類某些疾病尤其是神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機制等研究中經(jīng)常應(yīng)用。

2 斑馬魚與神經(jīng)退行性疾病

中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的神經(jīng)退行性疾病主要有阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓舞蹈癥等。 此外，由運動神經(jīng)元損傷導(dǎo)致的運動系統(tǒng)疾病包括脊髓性肌萎縮、遺傳性痙攣性截癱和肌萎縮性側(cè)索硬化癥等患者最終也發(fā)生神經(jīng)退行性病變。 神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機制至今不明。 為了明確此類疾病的發(fā)病機制，研究者以不同類型的模式動物開展了大量研究。 斑馬魚因具有上述不同于其他模式動物的特點，在神經(jīng)退行性疾病模型的選擇上，備受研究者青睞。 已被廣泛用于阿爾茨海默病等多種常見的神經(jīng)退行性疾病的研究（圖1）。

圖1 斑馬魚模型用于神經(jīng)退行性疾病的研究Figure 1 Zebrafish models used in the study of neurodegenerative diseases

2.1 阿爾茨海默病

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是一種起病隱匿、進行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾?。?］。 在疾病早期，患者僅表現(xiàn)為老年性健忘，隨著病情的進展，患者逐漸出現(xiàn)認知能力損害、人格與性情改變等精神癥狀，最終死亡。 盡管AD 的發(fā)病機制不明確，但是，現(xiàn)已證明AD 的發(fā)病與某些蛋白編碼基因的改變密切相關(guān)［6］。 這些蛋白包括淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP），早老素1（presenilin 1，PSEN1）、早老素2（presenilin 2，PSEN2）、Tau 蛋白和載脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）等。

迄今為止，不同的實驗室用斑馬魚模式動物開展了上述與AD 發(fā)病密切相關(guān)基因的研究，并取得了一些研究成果。 在斑馬魚體內(nèi)存在appa和appb兩種基因。Appa基因突變的斑馬魚表現(xiàn)為朊病毒依賴的驚厥反應(yīng)性增強［7］。Appa和appb的基因敲除導(dǎo)致反常的室管膜纖毛和小腦室的形成［8］。 通過原位雜交證明兩種淀粉樣蛋白前體蛋白分別與不同的神經(jīng)細胞外黏附分子結(jié)合，為脊椎動物感覺回路的形成奠定了基礎(chǔ)［9］。 此外，納米藥物在斑馬魚體內(nèi)對Aβ 毒性抑制作用的發(fā)現(xiàn)，為AD 的治療提供了新思路［10］。 近期研究證明，在含有高度磷酸化Tau 蛋白的斑馬魚模型中，Surfen 和oxalyl surfen 可以降低Tau 的磷酸化和減少神經(jīng)元的丟失［11］。 另外，利用斑馬魚模型探討藥物通過血腦屏障通透性及對Tau 蛋白聚集影響的研究，對AD 治療藥物的靶向傳遞和提高療效具有意義［12］。 最近，Kiper等［13］對利用斑馬魚基因模型研究AD 的病理進展進行了詳細歸納和總結(jié)。

在斑馬魚體內(nèi)，psen1 突變對機體的影響與年齡相關(guān)。 例如，在年齡為7 d 的斑馬魚，psen1 基因突變可影響機體內(nèi)的氧化磷酸化、細胞外基質(zhì)和鐵離子穩(wěn)態(tài)等［14］；而在成年斑馬魚（年齡：6 ～24 月）psen1 基因突變雖然改變了斑馬魚對低氧的反應(yīng)［15］，但是其腦血管結(jié)構(gòu)并未發(fā)生變化［16］。Psen2是斑馬魚體內(nèi)的另外一種psen基因。 據(jù)報道，在正常的成年斑馬魚中，psen2 基因是黑色素性皮膚色素沉著所必需的［17］。Psen2 基因敲除的斑馬魚幼魚表現(xiàn)為對刺激的過度運動反應(yīng)和自噬作用的增強［18］。將人類PSEN2 基因（K115fs）表達在斑馬魚體內(nèi)，斑馬魚的大腦則快速衰老［19］。

斑馬魚除了作為上述基因模式動物研究AD 的發(fā)病機制，也被用于研究其他因素對AD 發(fā)病的影響。 例如，以岡田酸（okadaic acid）誘導(dǎo)的AD 斑馬魚模型發(fā)現(xiàn)了鑭硫烯酮亞胺-5-乙酯（lanthionine ketimine-5-ethyl ester）的神經(jīng)保護作用［20］。 上述研究從不同的角度對AD 的發(fā)病機制進行了探討，證明了斑馬魚用于AD 研究的可靠性和可行性。

2.2 帕金森病

帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是一種常見的進行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。 PD 的發(fā)生是由于中腦黑質(zhì)-紋狀體多巴胺能神經(jīng)元通路的破壞，引起多巴胺能神經(jīng)元的大量死亡，導(dǎo)致多巴胺的合成和分泌減少所致。 現(xiàn)已證明與PD 的發(fā)生密切相關(guān)的基因包括SNCA（α-synuclein）、DJ-1、PRKN（parkin）、PINK1（PTEN-induced kinase 1）和LRRK2（leucine-rich repeat kinase 2）［21］等。 據(jù)報道，在胚胎期，將突變A30P 或A53T 的α-synuclein mRNA 注射入斑馬魚體內(nèi)能夠?qū)е掠佐~體內(nèi)嗅覺纖毛的數(shù)量減少和長度縮短［22］。 某些基因敲除或缺失導(dǎo)致斑馬魚出現(xiàn)一些類似PD 的病理改變。Pink1 基因敲除阻礙了多巴胺能神經(jīng)元的再生［23］；敲除park7（dj-1）基因影響氧化磷酸化過程尤其是對腦轉(zhuǎn)錄組中鐵反應(yīng)元件（iron responsive element，IRE）基因表達的影響，引起線粒體功能失常［24］；缺失parkin基因引起線粒體功能障礙和多巴胺能神經(jīng)元丟失［25］等。 關(guān)于lrrk2 基因的作用，至今備受爭議。 有報道稱lrrk2 基因敲除導(dǎo)致斑馬魚胚胎發(fā)育畸形，酪氨酸羥化酶陽性神經(jīng)元數(shù)目的減少［26］。 后來，Ren等［27］在相同的實驗條件下，未能重復(fù)出此實驗結(jié)果。 因此，關(guān)于lrrk2 在斑馬魚中的作用需要進一步研究與探討。

PD 的發(fā)生除了和上述基因因素有關(guān)，與環(huán)境因素也密切相關(guān)［28］。 這些因素包括1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP ）、 6-羥基多巴胺（ 6-hydroxydopamine，6-OHDA）、魚藤酮（rotenone）、百草枯（paraquat）和其他重金屬離子如鐵和鋅等。 近期，利用MPTP 誘導(dǎo)的斑馬魚PD 模型，研究者們分別探討了銀杏內(nèi)酯B（Ginkgolide B）［29］和前花青素（procyanidins）［30］的作用；以6-OHDA 誘導(dǎo)的斑馬魚PD 模型，不同的實驗室分別研究了酪氨酸磷酸酶1B［31］和巖藻黃素的作用［32］；以魚藤酮誘導(dǎo)的斑馬魚PD 模型被用于探究益生菌的作用［33］；以百草枯制備的斑馬魚PD 模型則被用于研究了黏附分子L1激動劑模擬物的作用［34］等。 近期的一篇綜述對各種神經(jīng)毒素分別誘導(dǎo)斑馬魚胚胎或幼魚成為PD 模型的神經(jīng)行為功能進行了系統(tǒng)分析和比較，這將對研究者如何選擇合適的神經(jīng)毒素誘導(dǎo)理想的PD 模型提供借鑒和參考［35］。 上述這些研究證明，環(huán)境毒素作用于斑馬魚可以成功地模擬出PD 的某些臨床癥狀和/或病理學(xué)特征，為進一步明確PD 的發(fā)病機制開辟了一條新途徑。

2.3 亨廷頓舞蹈癥

亨廷頓舞蹈癥（Huntington’s disease，HD）是一種常染色體顯性遺傳性疾病，大多數(shù)患者的臨床癥狀主要表現(xiàn)為進行性運動異常，不自主的舞蹈樣動作，伴隨智力的衰退和精神癥狀，最終患者活動能力完全喪失直至死亡。 亨廷頓舞蹈病基因同源染色體的成功克隆，使明確該疾病的病理生理學(xué)成為可能。 遺傳學(xué)檢查表明，患者位于第4 號染色體上的亨廷頓（Huntingtin，HTT）基因有不穩(wěn)定且數(shù)目大于42 的CAG 重復(fù)序列。 因為斑馬魚對亨廷頓舞蹈癥基因同源物缺失的反應(yīng)不同于小鼠［36］，所以更適合用于HD 發(fā)病機制的研究。 以往研究證明，在發(fā)育期的htt基因缺陷將導(dǎo)致斑馬魚形態(tài)學(xué)異常和中樞神經(jīng)系統(tǒng)壞死［37-38］。 最近研究顯示，htt在斑馬魚胚胎發(fā)育的早期可有可無，而在斑馬魚后期的發(fā)育中發(fā)揮重要作用［39］。 斑馬魚模型的應(yīng)用，為明確HD 的發(fā)病機制和有效防治HD 的發(fā)生及降低該病的發(fā)病率帶來希望。

2.4 肌萎縮性側(cè)索硬化癥

肌萎縮性側(cè)索硬化癥（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是一個發(fā)生在脊髓、腦干和運動皮層的運動神經(jīng)元選擇性丟失和顱腦神經(jīng)核及脊髓前角運動神經(jīng)元受損的漸進性神經(jīng)退行性疾病。 患者主要表現(xiàn)為肌肉進行性萎縮，肌張力減退和混合性癱瘓，晚期可能出現(xiàn)吞咽困難，最終因呼吸衰竭而死亡。 家族遺傳性ALS 與超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）基因SOD1 的突變有關(guān)［40］。 近期研究表明，一種合成的SOD/過氧化氫酶模擬化合物可以將SOD1G93R突變斑馬魚ALS模型的運動能力提高30%［41］。 除了SOD1 基因，其他基因如FUS（fused in sarcoma）、TARDBP和C9orf72 等也與ALS 的發(fā)病有關(guān)。 據(jù)報道，斑馬魚fus基因突變模型已經(jīng)成功構(gòu)建［42］。 斑馬魚體內(nèi)tardbp編碼的TDP-43 寡聚體的形成加速了ALS 的病理進程［43］。 最近，通過綜合遺傳分析ALS 遺傳的可能性，研究者提供了核孔缺陷與ALS 聯(lián)系起來的遺傳證據(jù)，確定神經(jīng)元剪接的改變在ALS 的重要性［44］。 關(guān)于C9orf72 基因與ALS 之間關(guān)系的研究，F(xiàn)ortier 等［45］對c9orf72 相關(guān)ALS 病理學(xué)的斑馬魚模型進行了概括總結(jié)，討論了在理解疾病的發(fā)病機制方面的價值以及在藥物研發(fā)中的潛在用途。

2.5 脊髓性肌萎縮

脊髓性肌萎縮（spinal muscular atrophy，SMA）是一種常染色體隱性遺傳的神經(jīng)退行性疾病。 患者的臨床表現(xiàn)為進行性對稱性以肢體近端為主的廣泛性弛緩性麻痹和肌肉萎縮，但其智力發(fā)育及感覺均正常。 研究證明，SMA 的發(fā)病機制與維持運動神經(jīng)元存活的蛋白（survival motor neuron，SMN）水平下降有關(guān)。 與人類擁有SMN1 和SMN2 兩個基因不同，斑馬魚只有一個smn基因。 Boyd 等［46］報道了在斑馬魚SMA 模型中，體內(nèi)生物能量狀態(tài)調(diào)控運動神經(jīng)元的敏感性和疾病病理進程。 斑馬魚SMA 模型經(jīng)熒光相關(guān)光譜學(xué)分析顯示其運動神經(jīng)元軸突中并不存在SMN 的主動轉(zhuǎn)運［47］。 在斑馬魚中，exosc9 基因的改變可以表現(xiàn)出人類脊髓性肌萎縮病的一些特征，影響RNA 外泌體，導(dǎo)致大腦半球萎縮［48］。 上述研究表明，斑馬魚SMA 模型的成功建立，為明確該病的發(fā)病機制，進行有效的預(yù)防和治療提供了新思路。

2.6 遺傳性痙攣性截癱

遺傳性痙攣性截癱 （ hereditary spastic paraplegia，HSP）是一種比較少見的家族遺傳性疾病，以常染色體顯性遺傳多見。 其病理改變主要是胸段脊髓雙側(cè)皮質(zhì)脊髓束的軸索變性和/或脫髓鞘導(dǎo)致的進行性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。 Wood 等［49］對容易引起HSP 的第4 個基因座SPG4 突變和該基因表達產(chǎn)物微管切割蛋白（spastin）的研究證明了對斑馬魚的spg4 基因敲除會導(dǎo)致明顯的運動神經(jīng)元的突觸障礙和其他類型神經(jīng)元連接性下降及廣泛的中樞神經(jīng)細胞凋亡。 這些研究成果有助于明確HSP 的發(fā)病機制。REEP1 是與HSP 發(fā)病相關(guān)的另一基因。 在斑馬魚幼魚中，reep1 基因敲除導(dǎo)致運動神經(jīng)元軸突生長緩慢，運動障礙、線粒體功能失常和氧化應(yīng)激［50］。 Naef 等［51］對斑馬魚模型在HSP研究中的應(yīng)用進行了概述。

2.7 斑馬魚模型在其他神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病研究中的應(yīng)用

斑馬魚除了用于上述常見神經(jīng)退行性疾病的研究，還用于其他與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病的研究［52-61］。這些研究進一步證明，斑馬魚是一種廣泛被認可的模式動物，助力醫(yī)學(xué)發(fā)展與進步（見表1）。

表1 斑馬魚模型用于其他神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病的研究Table 1 Application of zebrafish models in the study of other nervous system related diseases

3 結(jié)語

斑馬魚模式動物本身也存在不足和應(yīng)用局限性，如缺乏人類某些重要組織器官，給藥途徑受限制，國際尚無斑馬魚行為學(xué)檢測和分析判斷的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，檢測斑馬魚的抗體制備繁瑣且數(shù)量較少等，但是此種模式動物的建立為人類明確某些疾病，尤其是神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機制提供了新選擇和新途徑。 斑馬魚不但已經(jīng)成為研究神經(jīng)退行性疾病發(fā)病機制的一種理想的模式動物，而且在晝夜節(jié)律和學(xué)習(xí)記憶等復(fù)雜行為學(xué)研究和現(xiàn)代分子遺傳機制研究中，也初步成為一種具有潛在應(yīng)用價值的動物模型。 未來，隨著新研究技術(shù)手段的不斷發(fā)現(xiàn)和研究策略的改進與完善，斑馬魚這一模式動物的應(yīng)用將成為早日明確人類神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機制，開發(fā)和評價治療藥物的技術(shù)工具。