不同干預(yù)因素建立小鼠動脈粥樣硬化模型的研究進(jìn)展

白旭峰王姝雯曹清雨劉亞麗胡慧明

（1. 江西中醫(yī)藥大學(xué)，南昌 330004；2. 南昌醫(yī)學(xué)院，南昌 330052；3. 江西省中醫(yī)藥管理局抗炎類中藥藥效與質(zhì)量評價重點研究室，南昌 330052；4. 江西省衛(wèi)生健康藥效與安全性評價重點實驗室，南昌 330052）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是心腦血管疾病的潛在危險因素，是全球死亡和發(fā)病的主要原因［1］。 AS 被認(rèn)為是由多種因素引起的，包括遺傳和環(huán)境因素，其特征是動脈腔硬化和狹窄，因在動脈內(nèi)壁上形成了稱為斑塊的脂肪沉積物［2］。 人類AS的起始機(jī)制雖未被完全闡明，但從AS 病變標(biāo)本和動物模型角度來看，AS 已被定義為一種慢性炎癥性疾病，涉及內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、脂質(zhì)浸潤、巨噬細(xì)胞募集和血管平滑肌細(xì)胞遷移［3］。

研究表明，高水平的血漿低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL-C）是AS 最主要的危險因素之一［4］。 LDL-C 傾向于積聚在動脈壁的內(nèi)皮下空間，通過逐步氧化過程，產(chǎn)生最小修飾的低密度脂蛋白（minimally modified low density lipoprotein，mm-LDL），其中只有脂質(zhì)成分被氧化，然后是完全氧化的低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）［5］。 ox-LDL 通過氧化低密度脂蛋白受體-1（oxidized low-density lipoprotein receptor-1，LOX-1）

作用于內(nèi)皮細(xì)胞，從而誘發(fā)內(nèi)皮功能障礙，細(xì)胞表面粘附分子過表達(dá)，包括血管細(xì)胞粘附分子1（vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1）、細(xì)胞內(nèi)粘附分子 1 （ intracellular adhesion molecule 1，ICAM-1） 和內(nèi)皮白細(xì)胞粘附分子（endothelial leukocyte adhesion molecule，E-selectin），最終誘導(dǎo)動脈壁的炎癥反應(yīng)［6］。 炎癥反應(yīng)促使循環(huán)單核細(xì)胞附著在受損的內(nèi)皮上，將單核細(xì)胞遷移到脈管系統(tǒng)內(nèi)皮下基質(zhì)下方的內(nèi)膜層，浸潤的單核細(xì)胞進(jìn)一步分化為巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞通過清道夫受體識別和攝取ox-LDL 形成泡沫細(xì)胞，這種泡沫細(xì)胞內(nèi)皮下的積聚也被稱為“脂肪條紋形成”，這就是AS 形成的早期階段［7-8］。 炎癥反應(yīng)還能促進(jìn)循環(huán)單核細(xì)胞和T 細(xì)胞的募集，刺激血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）從血管壁內(nèi)側(cè)層遷移到內(nèi)膜層，表現(xiàn)出異常高的增殖并分泌細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，在AS 晚期形成纖維帽以穩(wěn)定脆弱的斑塊［9-10］。在AS 晚期，隨著斑塊的進(jìn)化，泡沫細(xì)胞和VSMC 發(fā)生死亡，細(xì)胞外脂質(zhì)從垂死或死細(xì)胞的碎片中積聚并積累脂蛋白，在許多斑塊中形成脂質(zhì)核心。 纖維帽通常在脂質(zhì)核心上方形成，由于合成減少和細(xì)胞外基質(zhì)大分子（如膠原蛋白）的分解增加，使得這種纖維帽變薄，形成薄帽AS［11］。 這種高風(fēng)險脆弱斑塊的纖維帽一旦破裂，疊加的血栓形成可能會阻塞動脈腔并破壞血流，最終導(dǎo)致心肌梗死、中風(fēng)或猝死，這也是AS 發(fā)病率和死亡率最高的原因之一［12］。

AS 動物模型是提高對AS 斑塊形成與斑塊破裂及其相關(guān)心血管事件發(fā)生認(rèn)識的重要工具。 因此，選擇合適的AS 動物模型至關(guān)重要。 理想的AS動物模型應(yīng)盡可能與人類臨床發(fā)病機(jī)理相似，并可用于醫(yī)學(xué)與藥物研究，且成本合理、重復(fù)性高。 小鼠是AS 研究中使用最廣泛的動物模型，具有繁殖性強(qiáng)、遺傳性高、轉(zhuǎn)基因的可塑性好、以及AS 病變部位形成快等優(yōu)勢［13］。 本文簡要介紹飲食、轉(zhuǎn)基因、新技術(shù)、遺傳和環(huán)境等不同干預(yù)因素對小鼠AS模型的研究進(jìn)展并進(jìn)行比較分析，以期為AS 的基礎(chǔ)研究提供新的參考和思路。

1 飲食與小鼠AS 模型

AS 是一種慢性的炎癥過程，飲食對高脂血癥促進(jìn)AS 斑塊形成的影響頗大［14］。 長期高膽固醇飲食會引起小鼠血清膽固醇（total cholesterol，TC）水平升高，其與主動脈病變的不斷加劇呈正相關(guān)［15］。 自20 世紀(jì)90 年代以來，21%脂肪結(jié)合0.15%膽固醇的西方飲食是AS 動物模型常用的飼料配方［16］。

早在20 世紀(jì)60 年代末，學(xué)者們就開始探究小鼠AS 模型建立的方法。 Vesselinovitch 等［17］通過高脂飲食、輻射誘導(dǎo)CF1 小鼠AS 病變。 但是，在高脂飲食和輻射及環(huán)境因素的共同作用下，使得這項研究個體差異極大，甚至伴隨著較高死亡率。 隨后，Thompson［18］率先采用高膽固醇高脂肪（high-fat/high-cholesterol，HFHC） 的飼料喂養(yǎng)近交系小鼠（C57BL/6）誘導(dǎo)AS，25 周后，小鼠的存活率高達(dá)100%，并且發(fā)現(xiàn)AS 模型小鼠泡沫細(xì)胞普遍出現(xiàn)在主動脈瓣區(qū)域。 從此，近交系小鼠逐漸成為AS 模型的研究基礎(chǔ)［19］。 1985 年，Paigen 等［20］以（15%脂肪＋1.25%膽固醇＋0.5%膽酸）飲食誘導(dǎo)10 種近交系C57BL/6，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠14 周后就形成高膽固醇血癥，且主動脈瓣大量細(xì)胞內(nèi)脂肪沉積，并含有大量泡沫細(xì)胞，同時病變已開始侵入下層介質(zhì)形成脂肪條紋。 以半合成高脂肪飲食誘導(dǎo)9 種近交系小鼠18 周，同樣發(fā)現(xiàn)C57BL/6 是最容易發(fā)生AS 病變的小鼠［21］。 可見，C57BL/6 小鼠是AS 模型基礎(chǔ)研究的常用研究對象。

2 基因敲除小鼠AS 模型

2.1 經(jīng)典ApoE-/-、LDLR-/-AS 模型

載脂蛋白E（ApoE）是一種雙域抗AS 脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白，作為低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL） 受體的配體，可以介導(dǎo)含載脂蛋白 B（apolipoprotein B，ApoB）的致AS 脂蛋白的清除，包括極低密度脂蛋白（very low density lipoprotein，VLDL）、 中密度脂蛋白 （ intermediate-density lipoprotein，IDL） 的受體，從而降低血漿脂質(zhì)水平［22-23］。 Plump 等［24］基于C57BJ/6 菌株制備了ApoE-/-小鼠模型。 該模型身體健康，在外形上與C57BJ/6 小鼠并無差異。 采用普通飲食分別喂養(yǎng)ApoE-/-和C57BJ/6 小鼠16 周后，ApoE-/-小鼠的LDL、TC 水平較C57BJ/6 小鼠升高數(shù)倍，同時ApoE-/-小鼠主動脈血管伴隨脂質(zhì)沉積［25］。 這表明在沒有環(huán)境刺激的情況下，ApoE 的缺乏能引起脂蛋白代謝的巨大變化。 研究發(fā)現(xiàn)，ApoE-/-小鼠在正常飲食下，10 周后出現(xiàn)了動脈僵硬，15 周后TC 水平提高了50%，20 周后斑塊出現(xiàn)在胸主動脈及其主要的分叉節(jié)點處；而在西方飲食下則會加快ApoE-/-小鼠AS 病變的進(jìn)程，如大量膠原沉積、主動脈僵硬程度成倍增加、 鈣化嚴(yán)重，40 周后主動脈完全受損［26-27］。

低密度脂蛋白受體敲除（LDLR-/-）小鼠是另一種常用的AS 研究的動物模型。 LDLR 是一種膜受體，可介導(dǎo)含有載脂蛋白ApoB100 或ApoE 的血漿脂蛋白的肝清除率，從而維持血漿LDL 的水平［28］。1994 年，Ishibashi 等［29］率先建立了LDLR-/-小鼠模型，與ApoE-/-小鼠不同，LDLR-/-小鼠不會在普通飲食的基礎(chǔ)上發(fā)生AS 病變，但TC 水平通常保持在250 mg/dl 左右［30-31］。 而采用西方飲食（21%的脂肪、0.15%的膽固醇）喂養(yǎng)LDLR-/-小鼠12 周后，小鼠血漿TC、甘油三脂（triglyceride，TG）、LDL-C 的水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于普通飲食喂養(yǎng)的LDLR-/-小鼠，并且其主動脈根部有大量脂質(zhì)沉積［32］。

2.2 復(fù)雜ApoE-/-、LDLR-/-AS 病變模型

研究表明，采用高脂飼料喂養(yǎng)ApoE-/-與LDLR-/-雙敲除小鼠（dKO），結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠溶栓活性因素減少，增加了AS 的進(jìn)展；采用普通飼料喂養(yǎng)ApoE-/-與LDLR-/-受體雙敲除小鼠，其AS 的形成或病變比單敲除ApoE-/-小鼠更明顯，說明ApoE-/-與LDLR-/-受體雙敲除小鼠比ApoE-/-單敲除小鼠更易形成AS［33-34］。 亦有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，IL-19/LDLR dKO 小鼠和LDLR-/-小鼠高脂飼料共同喂養(yǎng)14 周后，IL-19/LDLR dKO 小鼠巨噬細(xì)胞和VSMC 的炎癥因子表達(dá)增加，油紅O 染色發(fā)現(xiàn)IL-19/LDLR dKO小鼠主動脈根部病變的面積是LDLR-/-小鼠的2倍，這表明在LDLR-/-的基礎(chǔ)上缺乏IL-19 更易形成或加重AS 的病變［35］。 ApoE-/-小鼠與含有原纖維蛋白-（Fbn1）基因的突變（C1039G ＋/-）的小鼠雜交，成為ApoEFbn1-/-C1039G＋/-小鼠，其中原纖維蛋白-1 的Fbn1 基因突變導(dǎo)致馬凡綜合征（MFS），突變的FBN1 蛋白可能導(dǎo)致彈性結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，從而擾亂TGF-β 信號通路，導(dǎo)致主動脈表型受累更嚴(yán)重，主動脈根部直徑更大，擴(kuò)張速度更快，死亡和夾層風(fēng)險往往增加［36-39］，同時加劇了ApoE-/-小鼠AS 高度不穩(wěn)定斑塊表型形成。 在西方飲食的影響下，ApoEFbn1-/-C1039G＋/-小鼠核心擴(kuò)大，纖維帽薄，膠原纖維大量損失，在頭臂動脈、升主動脈均發(fā)生了斑塊破裂，表現(xiàn)出臨床終末期AS 患者的許多特征。隨著西方飲食的飼養(yǎng)周期延長，ApoEFbn1-/-C1039G＋/-小鼠不可避免地出現(xiàn)了1/5 的死亡［39］。 Wang等［40］研究發(fā)現(xiàn)，將Fbn1-/-C1039G＋/-小鼠與LDLR-/-小鼠雜交以獲得AS 易感斑塊的新模型，相較于ApoEFbn1-/-C1039G＋/-小鼠在整個高脂肪飲食喂養(yǎng)期間，所有小鼠都處于良好狀態(tài)，并且沒有記錄到神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥或急性心血管事件，避免了在ApoE-/-小鼠中觀察到的高死亡率問題。 但是LDLRFbn1-/-C1039G＋/-實驗研究僅使用少量小鼠用于斑塊染色實驗，缺乏有力的證據(jù)。

2.3 SR-BI-/-AS 模型

清道夫受體B 類Ⅰ型（SR-BI/SCARB1）最初被發(fā)現(xiàn)是一種清除蛋白，可與一系列天然和修飾的脂蛋白結(jié)合，同時SR-BⅠ是一種高親和力高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）生理膜蛋白受體，其通過肝細(xì)胞介導(dǎo) HDL 顆粒中膽固醇酯（cholesteryl ester，CEs）的選擇性攝取［41］。 SR-BⅠ是促進(jìn)細(xì)胞和 HDL 之間游離膽固醇（free cholesterol，F(xiàn)C）的雙向通量［42］。 除肝外，SR-BⅠ在巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中大量表達(dá)［43］。 研究表明，SR-BⅠ和ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白A1（ATP binding cassette transporter A1，ABCA1）負(fù)責(zé)膽固醇從單核細(xì)胞衍生巨噬細(xì)胞向HDL 外排［44］。 采用高膽固醇飼料喂養(yǎng)SR-BⅠ敲除（SR-BⅠ-/-）小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠血漿VLDL 大小范圍內(nèi)富含F(xiàn)C 和ApoE 的HDL 顆粒顯著積累，血漿膽固醇接近1000 mg/dl，促進(jìn)了AS 的發(fā)展［45］。 因此，SR-BⅠ-/-高脂血癥背景的小鼠能促進(jìn)AS 的形成，但其更容易導(dǎo)致冠狀動脈閉塞、心肌梗死甚至死亡［46］。

2.4 載脂蛋白（Apo）E3-Leiden AS 模型

突變的ApoE 亞型ApoE3-Leiden 與人類顯性遺傳形式的β-脂蛋白血癥有關(guān)，過表達(dá)ApoE3-Leiden的轉(zhuǎn)基因小鼠極易發(fā)生飲食誘導(dǎo)的高脂血癥和AS，還能表現(xiàn)出從胸主動脈和腹主動脈的早期脂肪條紋到主動脈弓的晚期病變［47-50］。 因此，ApoE3-Leiden 轉(zhuǎn)基因小鼠也可以用作AS 的模型。 轉(zhuǎn)基因ApoE3-Leiden.CETP 小鼠是人類脂蛋白代謝的成熟模型，具有人源化的脂蛋白代謝和對AS 病變的異質(zhì)反應(yīng)，含ApoB 脂蛋白中的膽固醇更多，HDL 膽固醇水平相對較低，類似于人類，能導(dǎo)致肝對循環(huán)中富含甘油三酯的脂蛋白殘留物的攝取減少［49］。 與ApoE3-Leiden 小鼠相比，高脂飼料喂養(yǎng)19 周后，ApoE3-Leiden.CETP 小鼠體內(nèi)VLDL 和LDL 水平明顯升高，主動脈根部AS 病變面積增加，是評估AS藥物治療的成熟模型［50］。

2.5 一種MicroRNA AS 模型的新探索

MicroRNA（miRs）是一類短的非編碼RNA，與RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex，RISC）結(jié)合，并與靶mRNA 的互補(bǔ)序列（通常在3’UTR 中）結(jié)合，通過抑制轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后編碼基因的表達(dá)來影響許多生物學(xué)途徑，許多miRNA 已被證明參與生物途徑并影響發(fā)病機(jī)制［51］。 miRNA參與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞周期、氧化應(yīng)激、血小板活化、內(nèi)皮及VSMC 功能，從而影響AS的發(fā)生與發(fā)展［52］。 研究表明，miR-33 在體內(nèi)的拮抗作用會增加循環(huán)HDL 和RCT，從而抑制AS 的發(fā)生與發(fā)展，并增強(qiáng)其消退［53］。 采用高脂飼料喂養(yǎng)C57BL/6 小鼠和miR-33（miR-33-/-）敲除小鼠12周，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-33-/-小鼠體內(nèi)TG 水平和肝中的脂質(zhì)積累增多，引發(fā)了中度肝脂肪變性和高甘油三酯血癥［54］。 此外，miR-27b、 miR-144 也代表了miRNA 作為膽固醇穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵介質(zhì)，其可能作為AS 的潛在生物標(biāo)志物［55］。 研究顯示高脂肪飲食誘導(dǎo)miR-144 基因敲除小鼠（miR-144-/-）的AS 病變是正常小鼠的1.5 倍［56］。

3 新技術(shù)AAV-PCSK9 的AS 模型

作為脂蛋白代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9（proprotein convertase subtilisin kexin 9，PCSK9）可以增強(qiáng)肝LDL 受體的降解，從而導(dǎo)致LDL 水平升高［57］。 腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus，AAV）載體可以有效地、特異性地將轉(zhuǎn)基因遞送到肝，且能夠持續(xù)表達(dá)［58］。 AAV-PCSK9 小鼠是10 年前開發(fā)的一種無種系基因工程的致AS 小鼠模型新品系［59］，高脂喂養(yǎng)同時注射AAV-PCSK9 的C57BL/6N 小鼠3 個月，顯示TC 濃度升高至1000 mg/dl 以上，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于普通飲食組小鼠TC 濃度，油紅O 染色結(jié)果顯示接受AAV-PCSK9 注射的小鼠主動脈根部斑塊和脂肪明顯增加；同時確定，在西方飲食的基礎(chǔ)上注射AAV-PCSK9 病毒載量為1.0 ×1011VG 是誘發(fā)AS 病變的最佳劑量［60］。 與ApoE-/-或LDLR-/-小鼠的常規(guī)雜交相比，單次AAV 注射足以在更快的時間內(nèi)產(chǎn)生新的AS 小鼠模型。

4 遺傳和環(huán)境因素

4.1 母體遺傳導(dǎo)致后代AS 病變發(fā)展

長期以來，人們一直認(rèn)為胎兒發(fā)育期間的致病事件會影響AS 相關(guān)的疾?。?1］。 研究發(fā)現(xiàn)，不論在人類還是動物體內(nèi)，AS 病變在胎兒期間開始形成，并且這一病變過程因母親高膽固醇血癥而加速［62］。通過以C57BL/6J 雌性小鼠為研究對象，在其整個交配、妊娠期與哺乳期之間，補(bǔ)充外源性膽固醇，觀察其雄性后代，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雄性后代血清VLDL 顆粒數(shù)量與大小均增加，肝脂譜的早期變化（單不飽和脂肪酸濃度較低，多不飽和脂肪酸濃度較高），并持續(xù)到成年期［63］。 研究人員給8 周齡ApoE-/-雌鼠在妊娠與哺乳期間喂養(yǎng)高脂飼料，6 個月后其生產(chǎn)的雄性后代中，整個主動脈AS 病變是普通飼料喂養(yǎng)的雌鼠組的2 ～3 倍［64］。

4.2 慢性應(yīng)激加速AS 的發(fā)展

慢性應(yīng)激是指當(dāng)身體長時間受到各種內(nèi)部和外部的負(fù)面因素刺激下發(fā)生的非特異性全身反應(yīng)。長期以來，在慢性應(yīng)激下暴露的生理反應(yīng)一直被認(rèn)為與AS 發(fā)生有著密切聯(lián)系［65］。 研究表明，慢性應(yīng)激能增加血管疾病的發(fā)展及冠狀動脈疾病的發(fā)病率和死亡率，其機(jī)制可能是由于慢性應(yīng)激引起內(nèi)皮損傷，直接激活巨噬細(xì)胞，促進(jìn)泡沫細(xì)胞形成并產(chǎn)生AS 斑塊［66］。 Figueiro 等［67］給予LDLR-/-小鼠高脂飲食的同時，每周連續(xù)4 d 的逆轉(zhuǎn)明暗、3 d 的常規(guī)明暗（rotating shift schedules，RSS）模式，持續(xù)11周，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RSS 模式下的小鼠出現(xiàn)較大的AS 病變，同時，原纖維膠原減少，并增加了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和病變內(nèi)的壞死區(qū)域，加速了LDLR-/-小鼠AS 的發(fā)展。 此外，ApoE-/-在輕度慢性應(yīng)激暴露12 周后，與未暴露ApoE-/-小鼠相比，暴露的ApoE-/-小鼠的AS 斑塊面積增加了一倍［68］。 說明慢性應(yīng)激和高脂飲食復(fù)合因素對基因編輯小鼠AS病變發(fā)展具有很強(qiáng)的協(xié)同作用。

5 結(jié)語

綜上，實驗性AS 小鼠模型復(fù)制方法種類較多，且不同干預(yù)因素建立小鼠AS 模型各有優(yōu)劣（表1）。 ApoE-/-小鼠可以自發(fā)性的產(chǎn)生AS 病變，是建立AS 的經(jīng)典模型。 LDLR 受體的缺失更加符合高脂血癥誘導(dǎo)的AS，但其需要高脂喂養(yǎng)或物理操作才能較好地實現(xiàn)AS 病變。 ApoE3-Leiden.CETP小鼠克服了經(jīng)典小鼠模型中非人類脂蛋白代謝的缺陷，但仍需要高脂喂養(yǎng)。 SR-BI-/-、ApoE/LDLR dKO、IL-19/LDLR dKO 小鼠TC 水平升高，加速AS 斑塊形成，是實現(xiàn)AS 快速造模的方法，但易造成嚴(yán)重管腔閉塞，導(dǎo)致過早死亡。 而ApoEFbn1-/-C1039G＋/-、LDLRFbn1-/-C1039G＋/-小鼠模型能夠自發(fā)性AS 斑塊破裂，給晚期病變和自發(fā)性斑塊破裂在經(jīng)典小鼠中的發(fā)生提供了可用模型，但復(fù)雜病變的證據(jù)較少，尚待進(jìn)一步深入研究。 MicroRNA 敲除小鼠能加快AS 病變的進(jìn)程，但目前并未見到MicroRNA 在小鼠體內(nèi)動態(tài)影響AS 病變的報道，仍需進(jìn)一步研究。 除基因缺失，以AAV 為載體注射PCSK9，導(dǎo)致體內(nèi)LDL 積聚，從而建立AS 小鼠模型，該模型操作簡便，但可能存在抗病毒宿主免疫反應(yīng)。 從現(xiàn)有的小鼠AS 模型來看，用于評價或篩選防治AS 中藥新藥研發(fā)的模型動物是經(jīng)典的ApoE-/-小鼠，同時結(jié)合高脂飼料長期喂養(yǎng)，則更易形成AS 斑塊破裂或心肌梗死。

表1 不同AS 模型小鼠的優(yōu)勢與弊端Table 1 Advantages and disadvantages of each type of atherosclerosis mice