Zn對凡納濱對蝦生長和肌肉中相關(guān)基因表達(dá)的影響

鄒永烽　趙永鵬　梁植　郭慧

摘要：為探究水體不同濃度Zn對凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）的存活率、增重率及特定生長率的影響及鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白3、11、銅鋅超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶、溶菌酶、toll1樣受體、金屬硫蛋白、熱休克蛋白70、己糖激酶、異檸檬酸脫氫酶和肌肉生長抑制素在肌肉組織中的表達(dá)差異。設(shè)定0、0.01、0.1和1 mg/L 4個(gè)Zn濃度，對凡納濱對蝦進(jìn)行30 d的脅迫試驗(yàn)。結(jié)果表明：濃度0.01、0.1 mg/L的Zn對凡納濱對蝦的存活率、特定生長率及增重率無顯著影響（P＞0.05），1 mg/L的Zn顯著降低了凡納濱對蝦的存活率、特定生長率及增重率（P＜0.05）。凡納濱對蝦肌肉中的12種基因的mRNA相對表達(dá)量在Zn濃度高于0.1 mg/L時(shí)發(fā)生極顯著變化（P＜0.01）。結(jié)果表明，Zn脅迫對凡納濱對蝦的存活率、特定生長率、增重率和肌肉中有關(guān)基因的相對表達(dá)具有顯著影響。

關(guān)鍵詞：Zn脅迫；凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）；肌肉組織；基因表達(dá)

Zn是水環(huán)境中最普遍存在的重金屬，作為生命必需的微量元素之一，Zn在生命活動(dòng)的多個(gè)方面都發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[1]。水生生物對水中的Zn通常比哺乳動(dòng)物更敏感，魚類和甲殼類動(dòng)物對Zn的敏感度是哺乳動(dòng)物的10～100倍[2]。近年來水體重金屬污染日趨嚴(yán)重，在水生生物體內(nèi)重金屬離子極易積累，達(dá)到一定濃度時(shí)具有毒性，會嚴(yán)重抑制水生生物的生長發(fā)育[3]。凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）自引入我國以來，迅速遍布全國，成為我國最主要的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一[4]。凡納濱對蝦因其底棲生活習(xí)性和特殊的生理生化特征，使其體內(nèi)容易富集重金屬，對環(huán)境脅迫具有很高的敏感性[5]。當(dāng)前Zn對凡納濱對蝦的影響的研究主要集中在對蝦營養(yǎng)以及生長性能和免疫等方面[6-8]。肌肉是對蝦機(jī)體的主要組成部分，占其體重的60%以上，肌肉生長發(fā)育程度是決定對蝦生長快慢、體形大小和生長性狀優(yōu)劣的主要因素[9]。當(dāng)肌肉組織受損后，其酶活力或者基因表達(dá)的變化可以一定程度上反應(yīng)出肌肉自身的損傷程度[10]。而Zn脅迫對凡納濱對蝦肌肉有關(guān)基因表達(dá)的研究報(bào)道罕見，因此本試驗(yàn)研究了養(yǎng)殖水體中不同濃度Zn脅迫30 d后對凡納濱對蝦生長指標(biāo)的影響以及對其肌肉有關(guān)基因表達(dá)的情況，以期為凡納濱對蝦的安全養(yǎng)殖和Zn在凡納濱對蝦的肌肉的毒性積累和毒性機(jī)制提供參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物

凡納濱對蝦購自廣東省湛江市。在廣東海洋大學(xué)生物研究基地進(jìn)行養(yǎng)殖。試驗(yàn)期間，光周期為12L∶12D，水質(zhì)參數(shù)保持在溶解氧7.00～8.00 mg/L，水溫25.0～28.0 ℃，鹽度28‰～30‰，pH 值7.9～8.0。每日2次，分別于9：00和16：00按其體重1%的比例投喂商業(yè)飼料。在整個(gè)試驗(yàn)過程中，每天對蝦進(jìn)行三次監(jiān)測，記錄蝦的死亡率和異常數(shù)據(jù)。

1.2Zn脅迫試驗(yàn)

采用ZnSO₄-7H₂O配置所需要的脅迫溶液。設(shè)置3個(gè)Zn脅迫組 （0.01、0.1和1 mg/L） 和1個(gè)空白對照組，每組設(shè)置5個(gè)重復(fù)。每天用相應(yīng)濃度的Zn溶液替換50%的培養(yǎng)水，保持濃度穩(wěn)定。

1.3試驗(yàn)取樣

Zn脅迫30 d后，在取樣前禁食24 h。每組采集5份肌肉樣品，將其置于2 mL的收集管中，以液氮保存，直至進(jìn)行生化檢測。所有的操作均在冰上進(jìn)行。

1.4生長指標(biāo)計(jì)算

生長性能計(jì)算公式如下：

SR=100×（N₁/N₀）；

WGR=100×[（W_t-W₀）/W₀]；

SGR=100×[（LnW_t-LnW₀）/T]。

式中：SR為存活率， %；N₁為試驗(yàn)結(jié)束后存活的蝦尾數(shù)；N₀：試驗(yàn)前蝦的初始尾數(shù)；WGR為增重率， %；SGR為特定生長率， %/d；W₀為蝦初重，g；Wt為蝦末重，g；T為試驗(yàn)天數(shù)，d 。

1.5基因相對表達(dá)量分析

按照TriQuick Reagent總RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行組織中RNA提取。

cDNA的合成按照Vazyme公司的HiScript III RT SuperMix for qPCR （+gDNA wiper） 試劑盒說明書進(jìn)行。

引物設(shè)計(jì)所需的序列均在美國國家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行搜索獲取，引物設(shè)計(jì)通過Primer Primer 5.0軟件或參考前人試驗(yàn)中的引物。具體序列見表1。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR （RT-qPCR） 使用Vazyme公司的ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒，按說明書進(jìn)行。按下列程序進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增：94 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性5 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃10 s，65 ℃1 min，97 ℃ 1 s；72 ℃10 min。

1.6數(shù)據(jù)處理

所得基因數(shù)據(jù)使用LightCycler 480 Software relwase 1.5.0軟件進(jìn)行處理，用β-actin作為內(nèi)參基因，結(jié)合β-actin和目的基因在Ct值方面進(jìn)行計(jì)算，運(yùn)用2-ΔΔct法來計(jì)算目的基因mRNA的相對表達(dá)量并分析變化原因。使用Excel 2016對存活率、增重率、特定增長率和基因的mRNA表達(dá)量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和作圖，計(jì)算結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 （mean ± S. D. ） 表示，采用SPSS Statistics 22 軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用LSD法進(jìn)行組間多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2結(jié)果與分析

2.1Zn脅迫下凡納濱對蝦的生長性能和存活率

Zn脅迫對凡納濱對蝦的生長性能和存活率的影響如圖1所示。隨著Zn濃度增加，增重率、特定生長率和存活率的變化呈先增后減的趨勢，在Zn濃度為0.01 mg/L處理組有最大值，分別是49.25%、8.74%/d、78.3%。增重率、特定生長率和存活率在Zn濃度為1 mg/L時(shí)有最小值，分別是11.95%、1.09%/d、62.9%，均顯著低于對照組（P＜0.05）。

2.2Zn脅迫下凡納濱對蝦肌肉組織相關(guān)基因的相對表達(dá)水平

Zn脅迫對凡納濱對蝦肌肉組織相關(guān)基因的影響如圖2所示。與對照組相比，GPx、CAT、toll1、HK的mRNA相對表達(dá)量在0.01、0.1、1 mg/L濃度組時(shí)均極顯著上調(diào)（P＜0.01），見圖2A、圖2B、圖2C、圖2D；HSP70、MSTN的mRNA相對表達(dá)量在0.01、0.1 mg/L濃度組變化不顯著（P>0.05），在1 mg/L組HSP70極顯著上調(diào)（P＜0.01）而MSTN極顯著下降（P＜0.01），見圖2E、圖2F；ZIP3和ZIP11的mRNA相對表達(dá)量隨著Zn濃度增加呈上升趨勢，在0.01 mg/L組ZIP3無顯著變化（P＞0.05）而ZIP11顯著上調(diào)（P＜0.05），在0.1 mg/L組均顯著上調(diào)（P＜0.05），在1 mg/L組均極顯著上調(diào)（P＜0.01），見圖2G、圖2H；LZM和MT的mRNA相對表達(dá)量隨著濃度上升呈先增后減的趨勢，從0.01 mg/L組開始上升（P＜0.01）都在0.1 mg/L組達(dá)到最大值（P＜0.01），在1 mg/L組LZM稍微下降（P＜0.05）而MT回歸正常水平（P＞0.05），見圖2I、圖2J；Cu-Zn SOD的mRNA相對表量在0.01 mg/L組顯著上調(diào)（P＜0.05），在0.1、1 mg/L組極顯著上調(diào)（P＜0.05），見圖2K；IDH的mRNA相對表達(dá)量在0.01 mg/L組極顯著上調(diào)（P＜0.01），在1 mg/L組極顯著下降（P＜0.01），在0.1 mg/L組無顯著變化（P＞0.05），見圖2L。

3討論

3.1Zn脅迫下凡納濱對蝦的存活率和生長情況

Zn是生命活動(dòng)的重要微量元素，具有催化和調(diào)節(jié)功能，在營養(yǎng)物質(zhì)代謝過程中發(fā)揮重要作用，也是糾正免疫應(yīng)答功能的關(guān)鍵元素[11]。有報(bào)道指出，水產(chǎn)動(dòng)物除了能從飼料獲得微量元素外，還可從水環(huán)境吸收礦物質(zhì)[12]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在水體Zn濃度低于0.1 mg/L時(shí)，凡納濱對蝦的存活率沒有受到顯著的影響，且在Zn濃度0.01 mg/L時(shí)凡納濱對蝦的生長指標(biāo)最好。吳賢漢等[13]認(rèn)為微量的金屬元素對生物無毒害作用，且能促進(jìn)生長。本試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了該觀點(diǎn)。1 mg/L組的凡納濱對蝦的存活率最低（62.9%），表明水體中1mg/L的Zn可能會對凡納濱對蝦的生理功能造成影響進(jìn)而降低存活率。許多研究均表明Zn超過1 mg/L會對動(dòng)物機(jī)體造成影響。Liang等[14]發(fā)現(xiàn)在Zn處理組為1 mg/L，凡納濱對蝦的成活率和生長性能顯著降低；鄭琰晶等[15]發(fā)現(xiàn)，在Zn濃度為1 mg/L時(shí)，對脊尾白蝦脅迫96 h的毒性實(shí)驗(yàn)得出其死亡率約為43%。1 mg/L的Zn濃度遠(yuǎn)高于我國漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)[16]（GB 11607-89）的限定（Zn≤0.1 mg/L），因此Zn更容易在體內(nèi)富集，阻礙機(jī)體正常生理功能運(yùn)轉(zhuǎn)，導(dǎo)致凡納濱對蝦的存活率隨著培養(yǎng)時(shí)間延長而降低。

3.2Zn脅迫下凡納濱對蝦的肌肉相關(guān)基因的表達(dá)

重金屬在凡納濱對蝦體內(nèi)的含量增加會引起肌肉損傷，影響生長發(fā)育和食用性質(zhì)。進(jìn)入肌肉的Zn水平的調(diào)控機(jī)制主要包括金屬的轉(zhuǎn)運(yùn)、儲存和解毒等[17]。本研究中，凡納濱對蝦在3種Zn濃度（0.01、0.1、1 mg/L）中脅迫30 d，肌肉中有關(guān)Zn轉(zhuǎn)運(yùn)、儲存的基因（ZIP3、ZIP11）的mRNA相對表達(dá)量上調(diào)，這和時(shí)博[18]探究飼料中Zn對凡納濱對蝦生長和營養(yǎng)代謝的研究結(jié)果類似。此外本試驗(yàn)通過對比ZIP3和ZIP11的相對表達(dá)水平變化，發(fā)現(xiàn)ZIP3相對表達(dá)水平在Zn濃度為0.01 mg/L時(shí)顯著升高，而ZIP11在0.1 mg/L時(shí)才有顯著上調(diào)跡象。這可能跟調(diào)節(jié)酶活性和ZIP蛋白在細(xì)胞中的位置不同有關(guān)[19]。

銅鋅超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，Cu-Zn SOD）在響應(yīng)氧化應(yīng)激的抗氧化防御途徑中發(fā)揮著重要作用，抗氧化作用可以防止自由基的形成，從而減少細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)等[18]。過氧化氫酶（catalase，CAT）是一種高度保守的酶，它能打破H₂O₂形成兩個(gè)水分子和一個(gè)氧分子，從而減少毒性作用，并維持細(xì)胞氧化還原平衡[20]。谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPX）在細(xì)胞防御和減少自由基等方面發(fā)揮著重要作用，是生物抗氧化防御系統(tǒng)的關(guān)鍵[21]。本試驗(yàn)中，Cu-Zn SOD、CAT和GPx的表達(dá)水平在三個(gè)處理組中均顯著性提高，這和陳天賜[22]的研究結(jié)果類似。活性氧（ROS）是生物正常代謝和異型生物質(zhì)暴露的產(chǎn)物，在正常生理?xiàng)l件下細(xì)胞會啟動(dòng)酶抗氧化劑和非酶抗氧化劑以避免ROS造成的氧化損傷[23]。Cu-Zn SOD和GPx的表達(dá)水平和所處環(huán)境中的Zn濃度呈正相關(guān)。可能在較高Zn濃度下ROS含量增加，為了維持細(xì)胞內(nèi)氧化與抗氧化的動(dòng)態(tài)平衡，需要更多Cu-Zn SOD和GPx抑制過量ROS。在Zn1 mg/L時(shí)CAT相對表達(dá)量比在0.1 mg/L少，可能是持續(xù)的Zn脅迫導(dǎo)致ROS含量過量破壞細(xì)胞的正常功能，引起基因表達(dá)水平的下降。這表明，基因表達(dá)對Zn脅迫具有特異性，對蝦肌肉組織通過不同基因的表達(dá)產(chǎn)生不同的抗氧化應(yīng)答，從而減小Zn對機(jī)體的損傷。

溶菌酶（Lysozyme）是體液免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分[24]，有研究表明凡納濱對蝦攝食含鋅的飼料顯著提高溶菌酶的表達(dá)量和活性[18]，這和本試驗(yàn)結(jié)果類似，表明適量的Zn可以刺激凡納濱對蝦提升免疫應(yīng)答水平。

金屬硫蛋白（metallothioneins，MTs）是一種結(jié)合金屬離子的蛋白質(zhì)，它對Zn有著很高的親和力，參與重金屬解毒過程，是維持金屬含量動(dòng)態(tài)平衡、參與重金屬解毒的關(guān)鍵酶之一，在減輕重金屬對生物體的毒害方面起重要作用[25]。研究表明，重金屬脅迫可以顯著提高日本囊對蝦MT基因的表達(dá)水平[26]。本研究中，凡納濱對蝦MT表達(dá)水平在Zn濃度0.01 mg/L和0.1 mg/L時(shí)顯著升高，表明MT參與抵抗Zn脅迫的免疫防御。此外，MT是細(xì)胞凋亡的抑制因子，有研究表明抑制MT基因的表達(dá)可以增強(qiáng)凋亡基因P53的表達(dá)水平[27]。本試驗(yàn)中，MT在1 mg/L組顯著下調(diào)，在該濃度下凡納濱對蝦的存活率最低（62.9 %），進(jìn)一步驗(yàn)證了MT是細(xì)胞凋亡的負(fù)調(diào)控因子。

熱休克蛋白（Heat shock proteins，HSPs）又稱應(yīng)激蛋白或熱應(yīng)激蛋白，是有機(jī)體受到熱刺激及其他環(huán)境、生理或病理脅迫時(shí)大量表達(dá)的一類保守型蛋白[28]。有研究顯示，水體中施用芽孢桿菌可提高凡納濱對蝦肌肉HSP70的mRNA表達(dá)量[29]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HSP70應(yīng)對Zn脅迫的響應(yīng)敏感性較低，在Zn濃度為1 mg/L時(shí)才顯著上調(diào)。有研究指出HSP70在脅迫后期顯著升高，相比于HSP60較不敏感[30]，這和本試驗(yàn)中得到的結(jié)果相似，推測HSP70可能在高濃度的Zn脅迫中起重要作用。

己糖激酶（hexokinase，HK），是糖酵解途徑中的重要酶類之一[31]，異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）是三羧酸循環(huán)重要的酶類之一[32]。本試驗(yàn)中，HK和IDH在0.01 mg/L的Zn脅迫下表達(dá)量顯著提高，這可能是一種代償性表達(dá)，在受到Zn脅迫下免疫系統(tǒng)誘導(dǎo)免疫蛋白大量合成，消耗大量能量，為保持機(jī)體穩(wěn)定的能量供應(yīng)，從而進(jìn)一步增強(qiáng)葡萄糖的分解，同時(shí)提高己糖激酶的相對表達(dá)水平。在1 mg/L脅迫下可能因?yàn)槊{迫壓力過大，導(dǎo)致細(xì)胞縮水損壞，三羧酸循環(huán)的反應(yīng)歷程遭到破壞引起IDH相對表達(dá)水平下降。

肌肉生長抑制素（MSTN）可顯著抑制肌肉增生，負(fù)向調(diào)控肌纖維生長，該基因在非骨骼肌生長發(fā)育中發(fā)揮著重要的生理功能調(diào)節(jié)作用[33]。在本試驗(yàn)中，凡納濱對蝦MSTN在對蝦肌肉中表達(dá)水平較高，表明MSTN在對蝦肌肉的生長發(fā)育中起重要作用。MSTN在1 mg/L組中，表達(dá)水平顯著下降，這與斑節(jié)對蝦的研究近似[34]，表明1 mg/L的Zn可能對肌肉造成較大的損傷，機(jī)體通過降低MSTN的表達(dá)從而促進(jìn)肌纖維的生長并修復(fù)肌肉。

4結(jié)論

本研究表明，Zn濃度1 mg/L會對凡納濱對蝦特定生長率、存活率和增重率造成顯著影響。Zn脅迫會使凡納濱對蝦相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)、抗氧化、應(yīng)激和代謝基因的相對表達(dá)水平顯著升高，對Zn脅迫做出應(yīng)答，從而保護(hù)機(jī)體，這展現(xiàn)出凡納濱對蝦肌肉組織相關(guān)基因應(yīng)對Zn脅迫具有多種應(yīng)答機(jī)制和特異性表達(dá)。本研究可為凡納濱對蝦的養(yǎng)殖和Zn在凡納濱對蝦的肌肉的毒性積累和毒性機(jī)制的探究提供參考。

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Effects of Zn on growth and related gene expression in

muscle of Litopenaeus vannamei

ZOU Yongfeng， ZHAO Yongpeng， LIANG Zhi， GUO Hui

（ Zhanjiang Key Laboratory of Marine Ecology and Aquaculture Environment，

College of Aquaculture， Guangdong Ocean University， Zhanjiang 524088，China）

Abstract：In order to investigate the effects of different concentrations of zinc on survival， weight gain and specific growth rate of Litopenaeus Vannamei， and the expression of zinc transporter genes 3，11（ZIP3， ZIP11） ， Superoxide Dismutase Superoxide Dismutase （Cu-Zn SOD） ， Catalase Glutathione Peroxidase （GPx） ， Lysozyme （LZM） ， toll1-like receptors， Metallothioneins （MT） ， Heat shock proteins （HSP70） ， Hexokinase （HK） ， Isocitrate Dehydrogenase （IDH） and Myostain （MSTN） in muscle，the stress experiment of L. vannamei was carried out at the concentrations of 0.0.01，0.1 and 1 mg/L Zn for 30 days. The results showed as follows： Zn concentrations of 0.01 and 0.1 mg/L had no significant effects on the survival rate， specific growth rate and weight gain rate of L. vannamei （P>0.05）， while Zn concentrations of 1 mg/L significantly decreased the survival rate， specific growth rate and weight gain rate of L. vannamei （P<0.05）. The mRNA relative expression levels of 12 genes in muscle of L. vannamei significantly changed when Zn concentration was higher than 0.1 mg/L （P<0.01）. The results showed that Zn stress had significant effects on survival rate， specific growth rate， weight gain rate and relative expression of related genes in muscle of L. vannamei.

Key words：Zn stress; Litopenaeus vannamei; muscle tissue; gene expression

（收稿日期：2023-09-26）