一株中華鱉源維氏氣單胞菌的分離鑒定及抗性研究

劉曉麗　王恬暢　蔣紅艷　殷蕊　宮春光

摘要：自保定阜平患病中華鱉（Pelodiscus sinensis）體內(nèi)分離獲得一株革蘭氏陰性菌，對其形態(tài)特征、生理生化特性及１６Ｓ ｒＤＮＡ序列進(jìn)行分析，鑒定其為維氏氣單胞菌（Aeromonas veroni）；對分離菌株進(jìn)行了29種抗菌藥的藥敏試驗和15株益生菌的拮抗實驗，得出此分離菌株對阿米卡星、頭孢呋辛鈉、左氧氟沙星、諾氟沙星、頭孢曲松、頭孢哌酮、環(huán)丙沙星和頭孢他啶等8種藥物高度敏感，對青霉素、苯唑西林、慶大霉素、萬古霉素、氨芐西林等其它17種藥物表現(xiàn)為不同程度的耐藥性；解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌2種益生菌在一定濃度下對其具有拮抗作用。

關(guān)鍵詞：中華鱉（Pelodiscus sinensis）；維氏氣單胞菌（Aeromonas veroni）；分離鑒定；藥敏試驗；拮抗試驗

中華鱉（Pelodiscus sinensis）又名水魚、甲魚、團(tuán)魚，因其味道鮮美，蛋白質(zhì)含量豐富，而且又有很高的藥用價值，是自古以來受到人們青睞的滋補佳品。中華鱉自上世紀(jì)七十年代末開始進(jìn)行人工養(yǎng)殖，是一種經(jīng)濟(jì)價值很高的淡水養(yǎng)殖品種。隨著居民消費升級，中華鱉的需求逐年增加，集約化養(yǎng)殖規(guī)模也在不斷擴(kuò)大，隨之而來的病害問題也越發(fā)嚴(yán)重，其中細(xì)菌性疾病尤為嚴(yán)重。維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）隸屬于氣單胞菌屬（Aeromonas），是一種能引起人-畜-水生動物共患病的病原菌[1-3]。本研究對一例患病的中華鱉進(jìn)行了病原菌的分離鑒定，并對分離菌株進(jìn)行了29種抗菌藥的藥敏試驗和15株益生菌的拮抗試驗，旨在為中華鱉細(xì)菌性疾病的研究和防控提供參考。

1材料與方法

1.1病鱉

患病中華鱉來自保定市阜平縣某甲魚養(yǎng)殖場，體重340～500 g。主要癥狀：腹部出現(xiàn)大小不一的紅色斑塊，頸部潰爛，背甲前部有小潰瘍口；解剖發(fā)現(xiàn)有異味。肝腫脹發(fā)黑、質(zhì)碎，胃、腸壁出血，內(nèi)充黏稠液體（見圖1，封二）。

1.2病原菌的分離鑒定

1.2.1病原菌的分離及純化取患病的中華鱉進(jìn)行解剖，分別挑取鱉體表病灶、脾臟等部位劃線接種于LB培養(yǎng)基，28 ℃下培養(yǎng)18～24 h；挑選形態(tài)特征一致的優(yōu)勢菌落， 28 ℃培養(yǎng)24 h，反復(fù)操作3次以上直至獲得形態(tài)和顏色一致的菌落，純化后的菌株以甘油（終濃度為 50%）為保護(hù)劑，置-80 ℃保存?zhèn)溆?。將獲得的單一形態(tài)的菌株命名為 AV0412。

1.2.2分離菌的鑒定

1.2.2.1生理生化分析鑒定參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[4]對病原菌進(jìn)行生理生化指標(biāo)分析和鑒定。無菌操作將分離菌株AV0412接種LB培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)至長出單菌落。挑取新鮮單菌落分別接種于16種細(xì)菌微量生化鑒定管中，28 ℃培養(yǎng)24 h或48 h，后根據(jù)測定結(jié)果分析該菌株的生理生化特性。

1.2.2.2分子生物學(xué)鑒定對菌株AV0412進(jìn)行基因組DNA 提取，然后采用通用引物（27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，1 492Ｒ：5-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3）進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 擴(kuò)增長度約 1 470 bp，獲得16S rDNA 序列產(chǎn)物。將擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海邁浦生物科技有限公司進(jìn)行16S rDNA測序。利用DNA Sequencing analysis軟件進(jìn)行分析比對，使用MEGA11的Neighbor Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3藥敏試驗

利用K-B紙片瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗， 28 ℃培養(yǎng)24 h后用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑， 測定3次取平均值。檢測的抗菌藥包含林可霉素、阿米卡星、青霉素、苯唑西林、慶大霉素、萬古霉素、氨芐西林、卡那霉素、復(fù)方新諾明、鏈霉素、哌拉西林、環(huán)丙沙星、氟苯尼考、頭孢他啶、阿奇霉素等29種。

1.4益生菌拮抗試驗

采用LB雙層平板打孔法。下層平板不加菌，上層平板加0.1 mL濃度為10⁸CFU/mL的菌液（滅菌后降溫至45 ℃左右時）。待平板凝固后使用經(jīng)滅菌的打孔器在平板上均勻的打6個孔（只穿過上層培養(yǎng)基），將孔中的培養(yǎng)基用滅菌牙簽挑出。之后在每個孔內(nèi)加20 μL益生菌液，每組三個平行，一個空白對照。將培養(yǎng)基置于28 ℃培養(yǎng)24 h后，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑，判斷益生菌對病原菌的拮抗作用。

2結(jié)果與分析

2.1細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察

AV0412為桿菌，革蘭氏陰性，不生成芽孢。在LB培養(yǎng)基上菌落呈圓形、表面光滑不透明、微隆起、呈現(xiàn)淡黃色。

2.2生理生化特性分析

分離菌株AV0412對精氨酸脫羧酶、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、甘露醇、海藻糖、苯丙氨酸、七葉苷和氧化酶等呈陽性; 而對賴氨酸脫羧酶、乳糖、肌醇、山梨醇、阿拉伯糖、賴氨酸和硫化氫等呈陰性反應(yīng)（見表1）。參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》，發(fā)現(xiàn)分離菌株AV0412與維氏氣單胞菌的生理生化特性基本一致。

2.3分子生物學(xué)鑒定

分離菌株AV0412目的條帶測序后與GenBank中已公布的序列進(jìn)行BLAST比對分析，發(fā)現(xiàn)與其他維氏氣單胞菌的核苷酸相似性達(dá)到99%以上。構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2（封二）。結(jié)果顯示AV0412與維氏氣單胞菌（A. veronii）聚為同一分支。

綜合菌株AV0412的生態(tài)特征、生理生化特性及16S rDNA序列及系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果， 確定菌株AV0412屬于維氏氣單胞菌（A. veronii）。

2.4藥敏試驗

藥敏試驗結(jié)果顯示：菌株AV0412對29種抗生素中的阿米卡星、頭孢呋辛鈉、左氧氟沙星、諾氟沙星、頭孢曲松、頭孢哌酮、環(huán)丙沙星和頭孢他啶等8種藥物高度敏感；對卡那霉素、哌拉西林、米諾環(huán)素和氟苯尼考4種藥物中度敏感；對青霉素、苯唑西林、慶大霉素、萬古霉素、氨芐西林等其它17種藥物表現(xiàn)為不同程度的耐藥性。具體試驗結(jié)果見表2。

2.5益生菌拮抗試驗

益生菌拮抗試驗結(jié)果顯示：14種益生菌中解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌在高濃度時，即107 CFU/mL和108 CFU/mL濃度時對菌株AV0412有一定拮抗作用；而當(dāng)濃度在106 CFU/mL以下時，則沒有拮抗作用；地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌等其他12種益生菌則在所有濃度時對菌株AV0412都沒有抑菌效果。具體試驗結(jié)果見表3。

3討論

不同地域、不同時間段、不同養(yǎng)殖環(huán)境中分離出的維氏氣單胞菌， 其對抗菌藥的耐藥性會存在一定差異。如雷寧等[5]從浙江省湖州市大口黑鱸體內(nèi)分離到的維氏氣單胞菌，藥敏試驗結(jié)果表明對頭孢曲松、氯霉素、氟苯尼考、強(qiáng)力霉素、復(fù)方新諾明、四環(huán)素、左氧氟沙星敏感，而本研究發(fā)現(xiàn)，除頭孢曲松和左氧氟沙星外，其他5種抗菌藥均呈現(xiàn)中度敏感或耐藥，尤其是四環(huán)素和強(qiáng)力霉素，表現(xiàn)出強(qiáng)耐藥性；而雷寧等的試驗表明對阿米卡星、諾氟沙星耐藥，而本研究卻表明這兩種藥物敏感。再如鄧龍君[6]從四川某養(yǎng)殖場大口黑鱸體內(nèi)分離得到維氏氣單胞菌， 藥敏試驗結(jié)果表明菌株對氟苯尼考敏感，對復(fù)方新諾明、四環(huán)素、卡那霉素和多西環(huán)素存在不同耐藥性，而本研究發(fā)現(xiàn)，分離得到的菌株對氟苯尼考和卡那霉素中度敏感，而對復(fù)方新諾明、四環(huán)素和多西環(huán)素也表現(xiàn)出耐藥。本藥敏試驗的結(jié)果與其他人的研究對比，發(fā)現(xiàn)有部分藥物的敏感性相同，有部分藥物的敏感性有一定差異，而有部分藥物的敏感性完全相反。以上結(jié)果說明了同一菌種的不同菌株間存在藥物敏感性差異，造成菌株間耐藥性差異的原因，可能與不同養(yǎng)殖品種、不同養(yǎng)殖地區(qū)在不同時間段使用抗菌藥的類型、劑量等有關(guān)，胡大勝[7]、鄧玉婷等[8]研究證明了病原菌耐藥性與苗種來源、養(yǎng)殖模式、菌株來源、分離年份及各地用藥習(xí)慣有關(guān)。

益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中經(jīng)常直接應(yīng)用到養(yǎng)殖水體中，除用來改良水環(huán)境如降解有機(jī)物、去除氨氮和硫化氫等有害物質(zhì)外，理論上還可以拮抗條件致病菌，尤其是在消毒后使用。本研究的結(jié)果顯示，只有解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌對維氏氣單胞菌有一定拮抗作用，且需要在107 CFU/mL以上濃度時才有作用。當(dāng)然，本試驗條件較為單一，試驗結(jié)果僅具有一定參考意義，而在實際生產(chǎn)中，養(yǎng)殖水環(huán)境的微生態(tài)系統(tǒng)極為復(fù)雜，各種微生物及其次生代謝產(chǎn)物往往快速演變，單一條件下的試驗結(jié)果不能為實際生產(chǎn)提供準(zhǔn)確支撐。利用益生菌拮抗條件致病菌來防控病害是一條減少抗生素使用、具有廣闊前景的路徑，如何能夠更有效的實現(xiàn)這一路徑還需要進(jìn)一步研究。

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[8] 鄧玉婷， 譚愛萍， 張瑞泉， 等. 廣東主要水產(chǎn)養(yǎng)殖地區(qū)氣單胞菌耐藥狀況的調(diào)查分析[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，2019， 50（11）： 2375-2383.

Isolation， identification， and antibiotic resistance research of

a strain of Aeromonas veronii from Pelodiscus sinensis

LIU Xiaoli WANG Tianchang JIANG Hongyan YIN Rui GONG Chunguang

（1.Ocean College of Hebei Agricultural University，Qinhuangdao 066003，China;

2.Hebei Fisheries Technology Extension Center，Shijiazhuang 050035，China;

3.Hebei Academy of Marine and Aquatic Sciences，Qinhuangdao 066201，China）

Abstract：A Gram-negative bacterium was isolated from the diseased Pelodiscus sinensis in Fuping， Baoding. Its morphological characteristics， physiological and biochemical properties， as well as the 16S rDNA sequence， were analyzed， confirming it as Aeromonas veroni. The isolated strain was subjected to susceptibility testing against 29 antibiotics and antagonistic experiments with 15 probiotic strains. It was found that the isolated strain exhibited highly sensitivity to amikacin，cefuroxime sodium，levofloxacin， norfloxacin， ceftriaxone， cefoperazone， ciprofloxacin and ceftazidime，showed resistance to 17 antibiotics in different level including penicillin， oxacillin， gentamycin， vancomycin and ampicillin，and the stain was antagonized by two probiotic strains Bacillus amyloliquefaciens and B. subtilis at certain concentrations.

Key words：Pelodiscus sinensis; Aeromonas veronii; isolation and identification; antibiotic susceptibility testing; antagonistic assay

（收稿日期：2023-07-10）