基于大鼠模型的赤霉素毒理學評價?

圖爾遜娜依·艾力，雒怡倩，吳軍強，王瀟，岳海濤

(新疆大學生命科學與技術(shù)學院，新疆烏魯木齊 830017)

0 引言

紅棗、葡萄等因口感獨特、營養(yǎng)價值高深受人們喜愛．有研究顯示2012―2021年新疆葡萄種植面積及產(chǎn)量位居我國首位[1]．新疆葡萄干產(chǎn)量占全國總產(chǎn)量的95%以上[2]．此外，新疆也是我國紅棗的主要種植地，紅棗產(chǎn)量占據(jù)了我國紅棗總產(chǎn)量的半壁江山．GA是新疆紅棗、葡萄種植中常用的生長調(diào)節(jié)劑，別名920，分子式為C19H22O[3]6．其生物學活性豐富，且在植物生長發(fā)育過程中具有誘導(dǎo)無子果實形成、提高坐果率、改善果實品質(zhì)、防止落花落果、促進果實早熟等關(guān)鍵作用[4]．GA在紅棗、葡萄中使用劑量為50～100 mg/L，在開花期連續(xù)噴灑，GA處理后幼果期果實內(nèi)源GA含量顯著上升，果實緩慢生長期棗果內(nèi)源GA含量快速下降．GA完熟期處理組與對照組相比果實中內(nèi)源GA含量提高了0.011～0.031 mg/kg．內(nèi)源GA含量與駿棗表皮厚度在脆熟期和完熟期呈顯著負相關(guān)，但相較亞洲國家規(guī)定的外源GA在水果及堅果中的使用標準（最大值0.2 mg/kg）存在殘留風險[5]．

現(xiàn)有研究大部分針對GA膨大功能評價，目前國內(nèi)對GA急性毒性進行了大量的研究，但多部分僅對個別臟器的損傷進行了宏觀評價，對其亞急性毒性研究較少，對重復(fù)暴露可能損傷的靶器官不明確且對其毒性效應(yīng)存在爭議．商桑等[6]研究證明GA沒有毒性，GA在100 mg/kg劑量范圍內(nèi)重復(fù)28天染毒，不會對SD大鼠青春期發(fā)育產(chǎn)生顯著影響．根據(jù)化學物質(zhì)毒性數(shù)據(jù)庫（https://www.drugfuture.com/）的查詢結(jié)果，GA對大鼠的LD50>6 300 mg/kg，對小鼠的LD50>8 500 mg/kg，對兔子的LD50>2 g/kg．參照中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第2569號附件14《農(nóng)藥產(chǎn)品毒性分級標準》[7]，LD50>5 000 mg/kg劑量樣品屬微毒級．也有研究表明GA亞急性毒性，對大鼠連續(xù)50天經(jīng)口給GA后，發(fā)現(xiàn)大鼠的肝臟、大腦、脾臟、肺部、腎臟和心臟中丙二醛的濃度明顯上升，脾臟和腎臟中超氧化物歧化酶的活力明顯降低，而大鼠心臟中藥物代謝酶谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)化酶活力明顯降低[8]．Yasin等[9]評估了GA對大鼠的抗氧化防御系統(tǒng)等存在毒性作用．GA可能會對雌性大鼠和它們的幼仔產(chǎn)生肝毒性，大鼠連續(xù)攝入200 mg/kg劑量的GA對其肝臟產(chǎn)生損傷[10]．

由于GA具有提高產(chǎn)量的作用，且在我國法律和國家行業(yè)標準中對GA應(yīng)用的劑量、期限等并沒有具體的指標要求，故GA在農(nóng)產(chǎn)品和林業(yè)產(chǎn)品市場上一直存在著濫用問題．過量或不合理噴灑導(dǎo)致GA在作物中殘留，長期食用可能蓄積人體，從而危害健康．因此，對GA進行毒理學評價是非常有必要的．本文通過觀察SD大鼠經(jīng)單次和連續(xù)28天按噴灑量的倍數(shù)暴露于GA后的毒性反應(yīng)，初步確定其主要毒性靶器官及毒性反應(yīng)性質(zhì)、程度，旨在為GA毒性的準確評價及其安全合理用藥、保護環(huán)境、生物多樣性和人類健康提供科學依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑（表1）

表1 主要儀器與試劑

1.2 實驗動物

根據(jù)《農(nóng)藥登記毒理學試驗方法第3部分：急性經(jīng)口毒性試驗序貫法》（GB/T 15670.3―2017）指定的實驗動物，使用SD大鼠進行動物實驗．SPF級SD大鼠購自新疆醫(yī)科大學動物研究所，體質(zhì)量180～220 g，動物生產(chǎn)許可證號：SYXK（新）2021-0004．實驗前動物在實驗環(huán)境中適應(yīng)3～5 d．

1.3 實驗方法

1.3.1 急性毒性實驗

將84只SPF級SD大鼠按體重隨機分成6組，每組14只，雌雄各占一半．采用單次灌胃方式染毒，對照組和實驗組GA（500、1 000、2 000、4 000、6 500 mg/kg），連續(xù)觀察14 d，記錄大鼠中毒表現(xiàn)，對體重、炎癥因子、組織病理學等指標進行監(jiān)測、評價毒性效應(yīng)．

1.3.2 亞急性毒性實驗

將48只SPF級SD大鼠按體重隨機分成4組，每組12只，雌雄各占一半．采用混合飼料染毒方式，對照組和實驗組GA（100、200、400 mg/kg）連續(xù)染毒28 d，觀察14 d，記錄大鼠中毒表現(xiàn)，對體重、炎癥因子、組織病理學等指標進行監(jiān)測、評價毒性效應(yīng)．

1.3.3 炎癥因子濃度測定

1）標準品的稀釋：在各小試管中加入標準品稀釋液110 μL，然后取原濃度標準品110 μL加入試管中，充分混勻；依次加入至第5個試管，從該試管中抽取110 μL，棄掉．第6只試管作為0號標準品．

2）加入待測樣品：在酶標包被板上加入不同濃度的標準品50 μL；樣本孔中先加樣品40 μL，再加生物素標記的抗體10 μL．

3）加酶及溫育：除空白孔外，每孔加入酶標試劑50 μL，用封板膜封板后置于37 ℃培養(yǎng)箱中溫育30 min．

4）洗滌：將濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋30倍，小心揭掉封板膜，棄去孔內(nèi)液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干．

5）顯色：每孔先加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色10 min．

6）終止及測定：每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)；以空白孔調(diào)零，450 nm波長依序測量各孔的吸光度OD值．測定應(yīng)在加終止液后15 min以內(nèi)進行．

1.3.4 組織病理學觀察臟器組織→10%甲醛固定→乙醇逐級脫水（50%、60%、70%、80%、90%、95%）→二甲苯透明→石蠟浸透和包埋→切片（4 μm）→HE染色→觀察記錄．

1.3.5 GA風險評估

參照中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第1825號《農(nóng)藥每日允許攝入量制定指南》，采用確定性評估模型對GA風險進行評估，農(nóng)藥短期攝入量計算公式為：

式中：ESTI為農(nóng)藥的估計短期攝入量，HR為殘留實驗中農(nóng)藥的最高殘留量，P為水果日均攝入量，BW為體重．

式中：ARfD為急性參考劑量，UF為急性毒性不確定系數(shù)（取100），NOAEL為動物實驗中最大未觀察到有害作用的劑量（NOAEL是在分析評價相關(guān)毒理資料的基礎(chǔ)上，找到最敏感動物的最敏感終點）．

式中：%ARfD為急性膳食攝入風險值；%ARfD≤100%代表風險考驗接受，%ARfD>100%意味著存在不可接受急性風險．

ADI參考《農(nóng)藥每日允許攝入量定制指南（2012年）》[11]進行計算：

式中：NOAEL（mg/kg）為動物實驗中最大未觀察到有害作用的劑量；UF為不確定系數(shù)，根據(jù)《指南》要求，不確定系數(shù)一般為100，同時結(jié)合毒理學實驗數(shù)據(jù)，從4周毒性實驗外推至慢性毒性實驗需放大10倍，推導(dǎo)得到的安全因子（基于動物實驗外推人群時存在的不確定因素而估算的系數(shù)）為1 000．

式中：%ADI為慢性膳食攝入風險；%ADI≤100%代表風險考驗可接受，%ADI>100%意味著存在不可接受急性風險．STMR為規(guī)范實驗殘留中值．

式中：HI為累積風險；HI≤100%代表風險考驗接受，HI>100%意味著存在不可接受急性風險．

2 結(jié)果與分析

2.1 GA急性毒性評價

2.1.1 GA對SD大鼠一般情況影響

最大非致死劑量及毒性分級預(yù)測．表2列出了SD大鼠單次灌胃給予6 500、4 000、2 000、1 000、500 mg/kg GA后的存活率，劑量在4 000 mg/kg以上時，可見明顯單次毒性反應(yīng)，主要的臨床癥狀為自主活動減少、呼吸困難、腹式呼吸、翻正反射消失、陣攣性抽搐．SD大鼠灌胃給予GA后實驗中高劑量組只有1只大鼠出現(xiàn)死亡情況，即最小致死劑量（LD01）為6 500 mg/kg，本次實驗并未觀察到絕對致死劑量（LD100）和半數(shù)致死劑量（LD50），在4 000 mg/kg以下劑量未見明顯中毒表現(xiàn)，觀察期內(nèi)無SD大鼠死亡，故本次實驗最小觀察到有害作用劑量（LOAEL）以及最大非致死劑量（LD0）為4 000 mg/kg，未觀察到有害作用劑量（NOAEL）為2 000 mg/kg．本次實驗雖然未觀察到LD50，但是根據(jù)結(jié)果可知LD50>6 500 mg/kg，根據(jù)食品安全毒性分級，GA屬于無毒級LD50>5 000 mg/kg．死亡率-劑量曲線和概率單位-劑量曲線見圖1．

表2 大鼠單次灌胃給予GA后的存活率

2.1.2 GA對SD大鼠體重的影響

灌胃給予GA后，各組受試SD大鼠的體重與灌胃前相比無顯著差異（P>0.05）．體重統(tǒng)計見圖2．

圖2 大鼠灌胃給予GA后的體重情況

2.1.3 GA對SD大鼠血清中炎癥因子的影響

為檢測單次給藥對大鼠免疫系統(tǒng)是否有影響，檢測血清中IL-6和TNF-α的濃度（圖3）．IL-6各劑量組與對照組無顯著差異（P>0.05），TNF-α各劑量組與對照組也無顯著差異（P>0.05）．

圖3 GA單次給藥對大鼠IL-6和TNF-α的影響

2.1.4 GA對SD大鼠臟器組織病理學影響

通過組織病理學進一步分析GA暴露后對大鼠主要臟器（包括肝臟、腎臟、睪丸和卵巢）的影響．圖4（a）為GA大鼠單次灌胃給藥后肝臟切片，與對照組相比各劑量組未見明顯病變，組織結(jié)構(gòu)正常；圖4（b）為大鼠腎臟切片，與對照組相比未見明顯病變，腎細胞排列整齊，未見大量空泡現(xiàn)象；圖4（c）為大鼠睪丸切片，與對照組相比炎性細胞浸潤情況較多；圖4（d）為大鼠卵巢切片，與對照組相比無明顯病變．

圖4 GA單次暴露組織病理學影響

2.2 GA亞急性毒性評價

2.2.1 GA對SD大鼠體重的影響

給予GA后，GA組雌性大鼠的體重與灌胃前相比沒有顯著差異，雄性大鼠的體重有上升趨勢，但無顯著差異（P>0.05）．體重統(tǒng)計見圖5．

圖5 大鼠給予GA后的體重情況

2.2.2 GA對大鼠炎癥因子的影響

通過組織病理切片觀察到部分臟器存在損傷，為在小分子水平驗證其結(jié)果，對GA暴露的SD大鼠血清及部分組織進行了炎癥因子（IL-6和TNF-α）含量檢測．血清中炎癥因子含量見圖6，GA暴露雌雄性大鼠血清中炎癥因子較對照組急劇增加，且呈劑量正相關(guān)性，隨著劑量上升雌雄鼠血清中IL-6的含量增加（P<0.01）．雌性大鼠TNF-α有上升趨勢但無顯著差異（P>0.5，圖6(c)），雄性大鼠在中、高劑量與對照組相比有顯著差異（P<0.5，圖6(d)）．

本次實驗對主要臟器（肝臟、腎臟、卵巢、睪丸）組織中炎癥因子含量進行了檢測，結(jié)果見圖7．在SD大鼠肝臟組織中，與對照組相比IL-6的含量沒有顯著差異（P>0.5），TNF-α的含量在400 mg/kg劑量組有顯著上升，為對照組的2.9倍．在腎臟組織中，炎癥因子含量在200、400 mg/kg劑量較對照組均顯著上升（P<0.5），IL-6含量為對照組的1.7倍，TNF-α含量為對照組的2.4倍．在卵巢組織中，IL-6含量較對照組在100 mg/kg劑量組呈1倍差異（P<0.5），在200、400 mg/kg劑量組呈極顯著上升（P<0.01），均為對照組的1.3倍．TNF-α含量在400 mg/kg劑量組呈顯著差異（P<0.5），為對照組的1.5倍．在睪丸組織中，200、400 mg/kg劑量IL-6含量呈顯著上升（P<0.5），TNF-α含量極顯著上升（P<0.01），分別為對照組的1.4倍和1.6倍．

2.2.3 GA對SD大鼠臟器組織病理學影響

通過組織病理學進一步分析GA重復(fù)暴露后對大鼠主要臟器（包括肝臟、腎臟、睪丸和卵巢）的影響．圖8（a）為大鼠重復(fù)暴露于GA后肝臟組織病理變化．100～200 mg/kg劑量大鼠的肝臟組織與對照組相比無明顯病理變化，肝臟組織結(jié)構(gòu)正常；400 mg/kg劑量肝細胞間隙擴大，包內(nèi)結(jié)構(gòu)松散．圖8（b）為大鼠重復(fù)暴露于GA后腎臟組織病理變化．對照組與處理組腎臟細胞排列整齊，未見大量空泡，但中、高劑量組與對照組相比腎臟細胞間隙出現(xiàn)輕微擴大．

圖8（c）為大鼠重復(fù)暴露于GA后卵巢組織病理變化．與對照組相比低、中劑量組未見明顯病變，高劑量組與對照組相比炎癥細胞浸潤較多．圖8（d）為大鼠重復(fù)暴露于GA后睪丸組織病理變化．對照組與低劑量組睪丸曲細精管生精細胞豐富、排列整齊、層次清楚，可見成熟精子生成、結(jié)構(gòu)正常；中劑量組曲細精管內(nèi)生精上皮層次減少、稀疏，腔內(nèi)僅見少量成熟精子生成；高劑量組大量生精細胞壞死溶解，生精上皮層稀疏，且曲細精管內(nèi)未見精子生成．

2.3 GA風險評估

《中國居民膳食指南（2022）》[12]推薦的水果消耗量為200～350 g/d．國外大多數(shù)具有推薦攝入量的國家建議每天攝入超過300 g新鮮水果，按照中華人民共和國國務(wù)院新聞辦公室發(fā)布的《中國居民營養(yǎng)與慢性病狀況報告（2020年）》[13]，成人男性平均體重為69.9 kg、女性為59 kg，成人平均體重以63 kg計，按風險最大化原則將紅棗和葡萄的每日水果消耗量以0.30 kg/d計．本課題組前期在田間實驗中得到GA在紅棗中的殘留值為0.007 2～0.130 1 mg/kg．本次風險評估中GA在紅棗中殘留量參考文獻[14]．急性毒性實驗中觀察到GA的NOAEL劑量為2 000 mg/kg；亞急性毒性實驗中觀察到的NOAEL為100 mg/kg．GA急性和慢性膳食風險評估結(jié)果見表3．

3 討論

GA是一種高效的植物生長調(diào)節(jié)劑，在中國新疆紅棗、葡萄中廣泛應(yīng)用，但其對人群可能帶來的風險存在較大爭議，為了探究GA對人體帶來的危害，本文通過急性及亞急性毒性實驗，建立了動物體內(nèi)毒性模型，根據(jù)GA毒性效應(yīng)，初步探究了GA可能損傷的靶器官，為GA毒性準確評價及其安全合理用藥、制定GA殘留相關(guān)標準提供依據(jù)．

急性毒性是食品安全性毒理學評價程序的第一階段，通過經(jīng)口一次性給予或24 h內(nèi)多次給予受試物后，觀測SD大鼠在短時間內(nèi)產(chǎn)生的毒性反應(yīng)[15]．目前國內(nèi)研究人員多針對GA急性毒性開展宏觀研究，如通過最大耐受法研究GA急性毒性，發(fā)現(xiàn)其毒性比較低，毒性分級屬于無毒級[6]，但對可能損傷的靶器官不明確，缺乏對主要臟器的組織病理學觀察．本文通過SD大鼠單次灌胃給予GA，對體內(nèi)急性毒性進行評價，并觀察到GA暴露后睪丸組織損傷．實驗中未觀察到致死劑量（LD100）和半數(shù)致死劑量（LD50），在SD大鼠急性毒性實驗中，GA最高劑量為6 500 mg/kg，初步推測GA對SD大鼠的LD50>6 500 mg/kg，這與化學物質(zhì)毒性數(shù)據(jù)庫查詢到的大鼠毒性分級以及商桑等[6]的研究結(jié)果一致，均屬于無毒級．為了進一步研究GA對人群生長發(fā)育的影響[16]，研究人員發(fā)現(xiàn)GA可使仔鼠的生長發(fā)育提前，雌性陰道開口時間及雄性小鼠的陰囊下降時間提前[17]．本文急性毒性實驗中，觀察到6 500 mg/kg劑量組SD大鼠睪丸組織病理切片與對照組相比炎性細胞浸潤情況較多，因此，GA高劑量急性暴露可能會對生殖系統(tǒng)產(chǎn)生一定影響．

如上所述，本文通過急性毒性實驗初步觀察了GA高劑量單次暴露后SD大鼠組織病理學切片，結(jié)果顯示睪丸組織存在損傷，為進一步研究GA低劑量重復(fù)暴露后是否同樣會對靶器官產(chǎn)生損傷，進行了亞急性毒性實驗．目前，國內(nèi)外亞急性毒性研究表明，0～100 mg/kg劑量范圍內(nèi)GA對SD大鼠青春期沒有影響[17]；本文低劑量組在重復(fù)28天暴露GA后同樣未觀察到對SD大鼠青春期以及生長明顯的影響，但在暴露劑量超過400 mg/kg時，SD大鼠卵巢炎癥細胞浸潤較多．200 mg/kg劑量組曲細精管內(nèi)生精上皮層次減少、稀疏，腔內(nèi)僅見少量成熟精子生成；400 mg/kg劑量組大量生精細胞壞死溶解，生精上皮層稀疏，且曲細精管內(nèi)未見精子生成．

肝臟具有多種功能且代謝旺盛，對外源污染物反應(yīng)靈敏，因此在毒理學評價中經(jīng)常作為毒性效應(yīng)觀察靶器官和細胞毒性觀測模型．有研究通過亞急性毒性實驗證明農(nóng)藥對大鼠的肝毒性[18]．GA重復(fù)暴露會引起肝臟毒性，GA肝臟切片檢查顯示充血、門靜脈和中央靜脈擴張以及血細胞積聚、炎癥細胞浸潤，除此之外損傷跡象還有肝細胞結(jié)構(gòu)松動、肝細胞出現(xiàn)空泡化等[19]．本文中100～200 mg/kg劑量重復(fù)暴露后大鼠的肝臟組織與對照組相比無明顯病理變化，肝臟組織結(jié)構(gòu)正常，400 mg/kg劑量組肝細胞間隙擴大，包內(nèi)結(jié)構(gòu)松散，表現(xiàn)出明顯的損傷．亞急性毒性實驗中觀察到GA的持續(xù)攝入導(dǎo)致肝臟、脾臟、腎臟的氧化損傷[20]、炎癥和細胞壞死現(xiàn)象[21]．除肝臟損傷外，本文還觀察到了重復(fù)暴露于GA后腎臟組織病理變化，在暴露劑量超過200 mg/kg時腎臟細胞間隙出現(xiàn)輕微擴大，與上述研究結(jié)果具有一致性．

研究表明GA在果實生長發(fā)育過程中呈逐漸降低趨勢[14]，急性毒性最高劑量為GA暴露量的65～130倍，亞急性毒性實驗高劑量為暴露量的4～8倍，本文參考張賢輝等[22]和顧夢影[23]研究計算急性和慢性膳食風險的評估方法，其中未觀察到有害作用劑量（NOAEL）和最小觀察到有害作用劑量（LOAEL）是物質(zhì)暴露風險評估中重要的數(shù)據(jù)[24-25]．本次風險暴露評估中GA累積風險商值小于100%，說明在急性暴露中130倍以內(nèi)噴灑量的GA膳食中累積風險可被接受，GA在8倍以內(nèi)重復(fù)28天暴露的膳食風險可被接受，但并不代表所有群體均可接受長期蓄積性風險．本次風險暴露評估中參考攝入群體為成年人，未考慮接受度較差的幼兒以及老弱群體，膳食風險商值考慮的是單向農(nóng)藥（添加劑）殘留的影響，未估計混合疊加與其它藥物使用的情況，所以引起的安全風險有待進一步研究．

綜上所述，如何避免紅棗、葡萄中農(nóng)藥殘留帶來的風險是一個復(fù)雜的問題，需要多方面的努力和配合．首先，最根本是從源頭把好紅棗、葡萄質(zhì)量關(guān)，種植者要提高對農(nóng)藥危害的認識并在采摘前科學、合理、規(guī)范地使用農(nóng)藥．其次，有關(guān)部門作好紅棗、葡萄質(zhì)量的監(jiān)管和監(jiān)測，加強知識宣傳及禁限用農(nóng)藥銷售渠道的管理，完善相關(guān)法規(guī)和標準，研發(fā)高效且無毒的GA替代品；加工過程中嚴格把關(guān)紅棗、葡萄的清洗、晾曬方式．最后，消費者在食用前對其進行徹底清洗、浸泡等可以有效減少殘留的攝入．

4 結(jié)論

依據(jù)本實驗結(jié)果，GA急性毒性屬于低毒，單次高劑量暴露時損傷的靶器官是睪丸；GA重復(fù)暴露后主要毒性反應(yīng)集中在肝臟、腎臟、卵巢、睪丸中，最大未觀察到有害作用劑量為100 mg/kg．紅棗、葡萄中GA急性和慢性風險商值均低于100%，說明紅棗、葡萄中GA殘留膳食攝入風險很低，造成的累積風險可以接受．