基于倏逝波照明的空間移頻超分辨成像技術研究*

凌進中 郭金坤 王昱程 劉鑫 王曉蕊?

1) (西安電子科技大學光電工程學院,西安 710071)

2) (中國科學院西安光學精密機械研究所,瞬態(tài)光學與光子技術國家重點實驗室,西安 710119)

空間移頻超分辨成像技術利用樣品表面的微納結(jié)構(gòu)對照明倏逝波的散射,使其轉(zhuǎn)換為傳播波,并將倏逝波攜帶的高頻空間信息轉(zhuǎn)換成低頻信息,可被遠場的顯微物鏡所接收,實現(xiàn)超分辨成像.其極限分辨率由照明的倏逝波波長決定,但分辨率僅在倏逝波波矢方向上有提升.在現(xiàn)有的棱鏡全反射倏逝波生成方案中,倏逝波的最短波長受棱鏡折射率的限制,因此其最高分辨率也受限制;且生成的倏逝波波矢為單一方向,因此分辨率存在方向差異性.為解決上述問題,建立了完整的空間移頻超分辨成像仿真模型,并提出了一種新型倏逝波生成方案,可利用微納結(jié)構(gòu)產(chǎn)生波長更短、具有全方向波矢的倏逝波.結(jié)果顯示,新方案可產(chǎn)生波長更短的倏逝波,并消除成像分辨率的方向差異性,從而避免現(xiàn)有方案中的多方位成像和圖像后處理.空間移頻超分辨成像技術具有大視場、高分辨、結(jié)構(gòu)簡單、操作方便、無需逐點掃描、可與普通光學顯微鏡兼容等優(yōu)點,改進后將具有更廣闊的應用空間.

1 引言

自阿貝提出衍射極限以來,科學家們利用各種技術手段繞過或突破光學衍射極限,以實現(xiàn)超高成像分辨率,并數(shù)次獲得諾貝爾物理學獎和化學獎.其中以受激發(fā)射損耗熒光顯微鏡、隨機光學重建顯微鏡、光激活定位顯微鏡為代表的熒光超分辨顯微鏡實現(xiàn)了納米級的成像分辨率,從而極大地促進了生物醫(yī)療及生命科學的進步.然而在非熒光成像領域,雖有眾多超分辨成像技術,例如結(jié)構(gòu)光照明顯微術[1,2]、光學超振蕩透鏡[3,4]、點擴散工程[5,6]、微球輔助納米顯微鏡[7—10]等,但都受限于理論本身或工程實際,分辨率很難突破50 nm,距離納米級的成像分辨率還有很大的差距.

空間移頻超分辨成像(spatial frequency shift super-resolution imaging,SFSSRI)是一種極具潛力的納米成像技術,可利用樣品表面微納結(jié)構(gòu)對入射倏逝波的散射,使之轉(zhuǎn)換成傳播波,進而獲取樣品表面的超精細空間信息,其極限分辨率由倏逝波的波長決定.受合成孔徑成像技術的啟發(fā),SFSSRI技術也是通過空間頻譜的移動、拼接等操作來獲取目標的更高空間頻率信息,從而實現(xiàn)更高的成像分辨率.國外學者對SFSSRI 技術的原理進行了大量研究,并拓展了相關應用領域.在成像原理上,由空間頻譜成像技術拓展出了集成干涉成像系統(tǒng)[11,12]、傅里葉疊層成像技術[13]、合成孔徑顯微鏡[14]等.例如美國康涅狄格大學Zheng 等[13]利用不同角度照明所對應的不同空間頻率,合成出超越物鏡本身分辨率的超分辨圖像;Lee 和Weiner[14]提出一種利用相位恢復來獲得更高空間頻率的超分辨成像方法;Alekseyev 等[15]利用聲子散射,將倏逝波轉(zhuǎn)化成遠場傳導波,實現(xiàn)了可見光波段的SFSSRI,并可推廣至紅外和太赫茲波段.在應用上,Kim等[16]利用合成孔徑顯微鏡技術獲得了超越衍射極限的成像分辨率,并對肝細胞進行了清晰成像.文獻[17—21]對SFSSRI 技術進行了深入的研究,并指出了該方案的關鍵技術問題.2013 年,Hao 等[17]提出了一種利用納米光纖泄露的倏逝波進行照明的超分辨成像方案,并實驗證實了SFSSRI 的可行性.同年,Hao 等[18]又利用棱鏡全反射產(chǎn)生的倏逝波進行近場照明,實現(xiàn)了150 nm 的成像分辨率,并研究了倏逝波波矢與光柵矢量夾角對成像分辨率的影響,即只有在波矢方向上可以獲得最高的成像分辨率,而在與之垂直的方向上,分辨率并沒有改善.為此,將多個方向倏逝波照明成像的結(jié)果進行后處理,可獲得完整的超分辨圖像.2017 年,Liu等[19]利用熒光納米線環(huán)的近場照明,實現(xiàn)了遠場超分辨成像;2019 年,Pang 等[20]深入研究了SFSSRI技術中存在的像質(zhì)問題,指出了空間移頻成像技術中的放大率畸變和部分頻譜缺失問題.2021 年,Ling 等[22]利用微粒散射光的近場照明,實現(xiàn)了SFSSRI,驗證了該方案中成像分辨率的方向差異性,并提出了一種環(huán)形照明方案以解決上述成像質(zhì)量問題.

然而,上述模型中倏逝波的最短波長仍受光學材料折射率的限制,無法進一步提升系統(tǒng)的成像分辨率.為解決上述問題,本文提出一種基于微納結(jié)構(gòu)的新型倏逝波生成方案,可突破材料折射率的限制,實現(xiàn)更短的倏逝波波長.另外,所生成的倏逝波具有全方向波矢,因此在各個方向上具有相同的成像分辨率,解決了成像分辨率方向差異性問題.仿真結(jié)果驗證了新方案的可行性,可極大提升空間移頻成像技術的成像效率,為該技術的廣泛應用奠定了基礎.

2 理論分析

2.1 SFSSRI 技術及其分辨率極限

根據(jù)空間頻率和分辨率的關系,只要能夠獲取目標的高頻空間信息,即可實現(xiàn)對目標的超分辨成像.然而,普通的光學成像系統(tǒng)都是低通濾波器,超過物鏡自身截止頻率Kmax的高頻信號都無法進入物鏡.截止頻率對應的空間距離,即為成像物鏡的極限分辨率.受合成孔徑技術的啟發(fā),研究人員提出SFSSRI 技術,通過調(diào)制技術將物鏡原本無法接收的高頻信息轉(zhuǎn)移到物鏡的低通頻帶范圍內(nèi),從而實現(xiàn)超越衍射極限的成像分辨率.例如結(jié)構(gòu)光照明技術,物鏡接收到的空間頻率Krec為樣品空間表面結(jié)構(gòu)的空間頻率Kobj與照明光場空間頻率Kill的差頻信號,即

由于Krec的極限為衍射極限所對應的截止頻率Kmax,而對遠場照明光的空間頻率同樣受到衍射極限的限制,即Kill的極值也是Kmax.因此,該方案中能夠獲取的樣品空間頻率的理論極限為2Kmax,即分辨率提升1 倍.若需進一步提升成像分辨率,則只能選擇空間頻率更高的倏逝波作為照明光場.若倏逝波的空間頻率為Kevan,則成像系統(tǒng)能接收的最高頻率為Kevan+Kobj,因此最小可分辨距離Λmin為

其中,λevan為照明倏逝波的波長,d為物鏡能分辨的最小距離.因此在物鏡已經(jīng)確定的情況下,可通過縮短照明倏逝波的波長來不斷提升系統(tǒng)的成像分辨率.

在圖1 所示的成像頻譜空間中,物鏡原本能夠接收的空間頻率范圍為藍色圓形部分,其最大值為Kmax.若照明倏逝波的波矢為沿x軸的Kevan,經(jīng)過移頻后,則物鏡能夠成像的頻譜范圍整體向右平移,如圖1 中虛線包括的范圍.因此,在基于近場照明的移頻成像系統(tǒng)中,沿倏逝波波矢方向可獲得超越衍射極限的分辨率,而在與之垂直的方向上,其分辨率不會發(fā)生改變,即系統(tǒng)在各個方向上分辨率不同.由此可見,SFSSRI 技術中存在兩個關鍵問題: 如何縮短倏逝波的波長,以進一步提升系統(tǒng)的成像分辨率;如何解決成像系統(tǒng)的分辨率方向差異性.

圖1 空間移頻成像中的頻譜移動示意圖Fig.1.Spatial frequency shifting in imaging system.

2.2 倏逝波的產(chǎn)生及其波長、波矢

倏逝波的產(chǎn)生在SFSSRI 技術中至關重要,而最常見的方式為利用直角棱鏡的全反射來生成倏逝波,如圖2(a)所示.光線垂直入射進入棱鏡,在棱鏡的上表面發(fā)生全反射,即在棱鏡的上方出現(xiàn)了一層向右傳播的倏逝場,記作Kevan,其在垂直方向上振幅呈指數(shù)衰減,因此可滲透的深度約為一個波長的距離.生成的倏逝波波長與棱鏡的折射率以及入射角有關,可表示為

圖2 兩種倏逝波的產(chǎn)生方案 (a) 基于棱鏡全反射;(b) 基于微納結(jié)構(gòu)的倏逝波生成Fig.2.Two methods for the generation of evanescent wave:(a) Scheme based on the total internal reflection at upper surface of prism;(b) scheme based on the transmission wave from nano-structures.

其中λ0為入射光的波長,n為棱鏡的折射率,而θ 為發(fā)生全反射時的入射角.由此可見,全反射時倏逝波的波長受到棱鏡折射率和入射角度的限制,無法不斷縮短,因此近場照明成像系統(tǒng)的分辨率也無法不斷提升.

而另一種產(chǎn)生倏逝波的方法為微納結(jié)構(gòu)對光場的調(diào)制,如圖2(b)所示.當平面波從基底入射到帶有微納結(jié)構(gòu)的上表面時,由于微納結(jié)構(gòu)的折射率調(diào)制,使得透射光的波前被調(diào)制,從而形成了帶有高頻空間信息的倏逝波.經(jīng)過一段距離的傳輸,倏逝場的振幅按指數(shù)衰減,只剩下傳播場信息,即在距離微納結(jié)構(gòu)一個波長以內(nèi)的近場區(qū)域,同時包含倏逝場和傳播場,而在遠場區(qū)域僅有傳播場.

為對比兩種方案所產(chǎn)生倏逝波的特性差異,將二者在分界面處的光強分布和相位分布進行仿真,如圖3 所示.當波長為500 nm 的平面波以45°入射在n=2.0 的棱鏡上表面全反射時,分界面下方的光強為入射光和反射光干涉形成的條紋,而分界面上方的光強呈指數(shù)衰減,如圖3(a)所示.圖3(b)為分界面上的光場相位分布,根據(jù)等相位面可知倏逝波的波矢方向向右,其波長約為350 nm,與(3)式的計算結(jié)果一致.與棱鏡全反射模型相比,利用微納結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的倏逝波無法與透射場分開,即在微納結(jié)構(gòu)上方的近場區(qū)域內(nèi)既存在倏逝波也有傳播波.例如采用周期為400 nm、線寬100 nm,深度400 nm,折射率為3 的矩形光柵作為倏逝波生成器,若波長為500 nm 的平面波垂直入射后,其表面的相位分布如圖3(c)所示.在近場區(qū)域,原本的平面波前受到微納結(jié)構(gòu)的調(diào)制,變成了攜帶高頻空間信息的正弦型波前;而當遠離微納結(jié)構(gòu)時,高頻信息丟失,其波前又恢復為平面.將探測器放置在微納結(jié)構(gòu)上方的近場區(qū)域,可獲得其相位分布,如圖3(d)所示.兩個相鄰的等相位面之間的間隔為倏逝波的波長,恰好等于微納結(jié)構(gòu)的周期,波矢方向為垂直于等相位面的方向.因此,可通過更加精細的微納結(jié)構(gòu)來獲取更短波長的倏逝波.

圖3 兩種方案中倏逝波的特性比較 (a) 棱鏡全反射時橫截面上的光強分布;(b) 棱鏡上表面的相位分布;(c) 微納結(jié)構(gòu)附近的相位分布;(d)微納結(jié)構(gòu)上方探測器位置的相位分布Fig.3.Comparison of evanescent wave generated by above two methods: (a) Light intensity distribution around the interface of prism when total internal reflection occurs;(b) light phase distribution at the upper interface of prism;(c) light phase distribution around the nano-structure;(d) phase distribution at the monitor closely above the nano-structure.

3 建模與仿真研究

3.1 SFSSRI 仿真模型的建立

根據(jù)SFSSRI 的過程,可將其分為3 個部分:倏逝波的產(chǎn)生及其與樣品的相互作用;樣品表面的光場傳輸至焦平面;焦平面上的光場分布經(jīng)過透鏡組后到達像面,在CCD 上成像,如圖4 所示.無論是棱鏡全反射、還是微納結(jié)構(gòu)模型,均可以使用時域有限差分法(finite-difference time-domain algori thm,FDTD)來仿真倏逝波的產(chǎn)生,以及倏逝波與微納結(jié)構(gòu)的相互作用;再使用衍射的角譜理論,將近場探測器獲得的光場信息投影至物鏡的焦平面位置,從而獲得焦平面上的光場信息;最后,使用Chirp-Z 變換來計算經(jīng)過顯微物鏡和筒鏡后在像面上得到的成像結(jié)果.

圖4 SFSSRI 仿真模型示意圖Fig.4.Schematic diagram of the simulation model for SFSSRI.

3.2 SFSSRI 特性的驗證

為驗證成像模型的正確性,選擇了一組3 條線的成像樣品,線條寬度為100 nm,相鄰線條的中心間隔為d,如圖5(a)所示.仿真中使用的入射光波長為500 nm,物鏡的數(shù)值孔徑(numerical aperture,NA)為0.9.首先,用平面波直接照明成像樣品,驗證遠場照明時系統(tǒng)的成像分辨率.當線條間隔為500 nm 時,3 條線可以清晰成像,如圖5(b)所示;當線條間隔縮小至460 nm 時,3 線條恰好可分辨,如圖5(c)所示;繼續(xù)縮小線條間距至430 nm 時,3 條線的中心位置連為一體,線條無法分辨,如圖5(d)所示.由此可見系統(tǒng)的最小可分辨距離約為460 nm,與理論值基本一致.隨后,使用全反射時棱鏡上表面的倏逝波來照明樣品,棱鏡的折射率n=1.5,其成像結(jié)果如圖5(e)和圖5(f)所示.當線條間隔為300 nm 時,3 條線可以清晰分辨,而當間隔縮短至280 nm 時,3 條線隱約可見.相比遠場照明,倏逝波的近場照明顯著提升了系統(tǒng)的成像分辨率.若提升棱鏡的折射率至n=1.8,則系統(tǒng)的成像分辨率可進一步提升,間隔為280 nm 的樣品仍然可清晰分辨,而間隔為250 nm 時無法分辨,如圖5(g)和圖5(h)所示.根據(jù)(3)式,全反射時倏逝波的波長由棱鏡的折射率和入射角決定,無法繼續(xù)縮短.因此,要進一步提升成像分辨率,就必須另辟蹊徑,以產(chǎn)生更短波長的倏逝波.

圖5 遠場照明與近場照明時的成像分辨率比較 (a) 成像目標及參數(shù);(b)—(d)遠場照明的成像結(jié)果;(e),(f) 棱鏡折射率n=1.5 時的近場照明成像結(jié)果;(g),(h) 棱鏡折射率n=1.8 時的近場照明成像結(jié)果Fig.5.Imaging resolution contrast between far-field illumination and near-field evanescent wave illumination: (a) Imaging target and its parameters;(b)—(d) imaging results obtained by far-field illumination;(e),(f) imaging results of near-field illumination when the refractive index of prism n=1.5;(g),(h) imaging results of near-field illumination when the refractive index of prism n=1.8.

為驗證空間移頻成像中分辨率的方向差異性,繼續(xù)選用線寬100 nm、間隔300 nm 的線狀樣品進行測試.樣品方向與棱鏡表面所產(chǎn)生的倏逝波波矢如圖6(a)所示,其中倏逝波沿x軸方向傳播,線條方向與y軸的夾角為θ.當θ=0°時,線條方向與倏逝波的波矢方向垂直,此時成像結(jié)果中3 條線清晰可辨,如圖6(b)所示;整體旋轉(zhuǎn)樣品,保持線條的間距不變,成像結(jié)果如圖6(c)—(g)所示.隨著樣品方向的改變,其成像結(jié)果中3 條線逐漸變得模糊,當θ ＞ 30°時,3 條線無法分辨.由此可見,在倏逝波的波矢方向上,成像分辨率較高,其極限分辨率取決于倏逝波的波長,而在與之垂直的方向上,分辨率最低,與遠場照明時的分辨率無異.

圖6 SFSSRI 中的分辨率方向差異性 (a) 成像樣品的方位示意圖;(b)—(g) 不同方位角時樣品的成像結(jié)果Fig.6.Directional differences in imaging resolution of spatial frequency shift super-resolution imaging: (a) Imaging target and its direction;(b)—(g) imaging results obtained at different azimuth angles.

3.3 新型倏逝波生成器及其在SFSSRI 中的應用

為解決基于棱鏡全反射的倏逝波生成器中出現(xiàn)的上述問題,提出一種新型倏逝波生成器,如圖7(a)所示.其核心部件為透明基底上的同心圓環(huán)形狀的微納結(jié)構(gòu)(周期300 nm,線寬150 nm,深度200 nm,折射率為2),圓環(huán)中心半徑1 μm 的圓形區(qū)域不設微納結(jié)構(gòu);相鄰圓環(huán)間的間隔可調(diào)控倏逝波的波長;圓環(huán)的折射率和厚度可調(diào)制近場區(qū)域相位差的大小.由于該結(jié)構(gòu)的旋轉(zhuǎn)對稱性,可生成具有全方向波矢的倏逝波,即圓環(huán)中心位置的光場具有任意方向的波矢,因此可解決棱鏡全反射模型中的分辨率方向差異性問題.其生成倏逝波的相位分布如圖7(b)所示,其中藍色部分為微納結(jié)構(gòu)對平面波前調(diào)制后的結(jié)果;中心區(qū)域的相位為倏逝波向內(nèi)傳輸形成的相位分布;白色箭頭方向垂直于等相位面,為波矢方向.

圖7 微納結(jié)構(gòu)及其產(chǎn)生的倏逝波 (a) 微納結(jié)構(gòu)示意圖;(b) 微納結(jié)構(gòu)表面倏逝波的相位分布Fig.7.Directional differences in imaging resolution of spatial frequency shifting super-resolution imaging method: (a) Sketch of the nano-structure;(b) phase distribution of the evanescent wave generated above the upper surface of nano-structure.

將上述微納結(jié)構(gòu)中心區(qū)域生成的倏逝波用于近場照明成像,并與棱鏡全反射時生成的倏逝波照明成像進行比較,可看出二者的明顯區(qū)別.分別選擇線寬150 nm、周期300 nm 的一組同心圓環(huán)和線寬100 nm、周期300 nm 的一組十字條紋作為成像目標,如圖8(a)和圖8(b)所示.利用棱鏡全反射時產(chǎn)生的倏逝波進行照明,其成像結(jié)果如圖8(c)和圖8(d)所示,從圖中可看出不同方向的分辨率差異以及圖像的強度差異;改用上述微納結(jié)構(gòu)中心區(qū)域的倏逝場近場照明,其成像結(jié)果如圖8(e)和圖8(f)所示,其成像分辨率和成像強度在各方向基本一致,因此可避免因倏逝波方向單一而帶來的分辨率方向差異性.

圖8 不同倏逝波的成像性能比較 (a),(b) 成像樣品的結(jié)構(gòu)示意圖;(c),(d) 利用棱鏡全反射所生成的倏逝波照明的成像結(jié)果;(e),(f) 利用微納結(jié)構(gòu)生成的倏逝波照明的成像結(jié)果Fig.8.Comparison of imaging characteristic under different evanescent wave illumination: (a),(b) Sketch of the imaging targets;(c),(d) imaging results obtained under the evanescent wave illumination generated by the total internal reflection at prism surface;(e),(f) imaging results obtained under the evanescent wave illumination generated by nano-structures.

最后,為驗證基于微納結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的超短倏逝波具有極高的成像分辨率,選擇線寬100 nm,周期200 nm,深度200 nm,折射率為2 的一維矩形光柵結(jié)構(gòu)作為倏逝波生成器,將其生成的波長為200 nm 的倏逝波用于近場照明成像.遠場入射光波長為500 nm,顯微物鏡的數(shù)值孔徑為0.9.成像樣品為間距漸變的線狀樣品和點狀樣品,其結(jié)構(gòu)參數(shù)如圖9(a)所示,最小間隔為160 nm,最大間隔為220 nm.成像結(jié)果如圖9(b)所示,從圖中可以看出,當相鄰線條的中心間距大于180 nm 時,兩條線可分辨.若中心間距小于180 nm 時,則兩條線相互融合,無法分辨.換點狀目標后,有類似的成像效果.因此,最小可分辨距離為180 nm,與(2)式中的理論預測基本一致.

圖9 超高成像分辨率的實現(xiàn) (a) 成像樣品的結(jié)構(gòu)示意圖;(b) 倏逝波照明的成像結(jié)果Fig.9.Realization of ultra-high imaging resolution: (a) Parameters of the imaging targets;(b) imaging results under evanescent wave illumination.

4 結(jié)論

通過對SFSSRI 系統(tǒng)的完整建模,仿真分析了其極限分辨率與照明倏逝波波長的關系,并演示了其成像分辨率的方向差異性.為突破現(xiàn)有技術方案中棱鏡的材料折射率對極限分辨率的限制并解決其成像分辨率的方向差異性,提出一種基于微納結(jié)構(gòu)的倏逝波生成器,生成了波長更短且具有全方向波矢的倏逝波,解決了單一方向倏逝波照明中存在的成像分辨率差異性問題,從而避免了多次成像和圖像后處理,可極大地拓展該方案的應用領域,為光學超分辨成像提供一種新的選擇.在后續(xù)工作中,我們將實驗驗證上述結(jié)論,并深入研究SFSSRI技術中的頻譜拓寬技術,以獲得更高的成像分辨率和更優(yōu)的成像質(zhì)量.