高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法快速檢測淫羊藿藥材中47 種農(nóng)藥殘留

章會(huì)瓊，楊 琴，蒲 雪，劉明容

（四川省樂山市中醫(yī)醫(yī)院，四川 樂山 614000）

淫羊藿為小檗科植物淫羊藿、箭葉淫羊藿、柔毛淫羊藿或朝鮮淫羊藿的干燥葉，主產(chǎn)于貴州、湖北、四川、遼寧、陜西、湖南（湘西）等地［1-2］。其藥用成分主要為黃酮類成分［3］，且該藥具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎等功效［4-6］。目前對(duì)淫羊藿的主要研究方向?yàn)槌煞郑?］、藥用機(jī)理［8］等方面，農(nóng)藥殘留方面鮮有報(bào)道。隨著環(huán)境變化及濫用農(nóng)藥現(xiàn)象的增加，中藥材中農(nóng)藥殘留的檢測越來越受到重視［9］。李剛等［10］建立了檢測丹參中33 種農(nóng)藥殘留的液相/氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，與2020 年版《中國藥典（一部）》［11］中的檢測方法相比，提高了處理效率、靈敏度及準(zhǔn)確性；倪興婷等［12］研究了人參中9 種有機(jī)氯農(nóng)藥殘留，所建立的方法具有快速、準(zhǔn)確、高效等特點(diǎn)；顧夢影等［13］研究了鐵皮石斛中精甲霜靈和嘧菌酯的殘留。目前，中藥材中農(nóng)藥殘留的檢測方法主要有氣相色譜法［14］、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［15］、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［16］、毛細(xì)管電泳法［17］、拉曼光譜法［18］等，其中2種聯(lián)用法因具有高通量及定性能力強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)逐漸成為檢測農(nóng)藥殘留的普遍選擇。2020 年版《中國藥典（一部）》對(duì)普通藥材中農(nóng)藥殘留的檢測給出了3種指導(dǎo)性檢測方法、5種前處理方法，需結(jié)合不同的藥材及不同的農(nóng)藥殘留合理選擇。基于此，本研究中建立了快速檢測淫羊藿藥材中47種農(nóng)藥殘留的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）法，以期為其生產(chǎn)與質(zhì)量控制提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

ME104E 型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；DGU20A-API4500型液質(zhì)聯(lián)用儀（美國AB SCIEX公司）；NP-30S型渦旋混合儀（常州宇瑞儀器制造有限公司）；HT190R 型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；H15S 型臺(tái)式微量高速離心機(jī)（四川蜀科儀器有限公司）；KQ3200E 型超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）；HSC - 12A 型氮吹儀（北京佳航博創(chuàng)科技有限公司）。

1.2 試藥

對(duì)照品信息見表1（共47批，規(guī)格均為100μg/mL；*購自壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司，其余均購自農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所）；N- 丙基乙二胺（PSA，批號(hào)為0G010010），十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18，批號(hào)為K12S22CUMX），石墨化炭黑（GCB，批號(hào)為S0257723），均購自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；乙腈為色譜純，甲酸、冰醋酸、無水硫酸鎂為優(yōu)級(jí)純。淫羊藿藥材樣品信息見表2（共25 批，其中批號(hào)220501，220610，211201 樣品分別為巫山淫羊藿、箭葉淫羊藿、毛淫羊藿，其余樣品均為淫羊藿）。

表1 對(duì)照品信息Tab.1 Information of references

表2 樣品信息Tab.2 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗(yàn)條件

色譜條件：色譜柱為Kromasil 100-5 C18柱（150 mm×3.9 mm，5μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min時(shí)10%A →40%A，10～20 min時(shí)40%A →100%A，20～25 min 時(shí)100%A，25～27 min時(shí)100%A →10%A，27～32 min 時(shí)10%A）；流速為0.4 mL/min；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣量為10μL。

質(zhì)譜條件：掃描模式為多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式；電噴霧離子源正離子模式（ESI+），霧化氣溫度為450 ℃，氣簾氣壓力為30 psi，碰撞氣壓力為5 psi，離子源電壓為4 500 V，輔助氣1，2 壓力均為30 psi。各農(nóng)藥保留時(shí)間及質(zhì)譜參數(shù)見表3。47種農(nóng)藥的總離子流圖見圖1。

圖1 總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms

表3 各農(nóng)藥保留時(shí)間及質(zhì)譜參數(shù)Tab.3 Retention time and mass spectrum parameters of pesticides

2.2 溶液制備

對(duì)照品溶液：精密吸取47種對(duì)照品各1 mL，分別置10 mL 容量瓶中，加乙腈定容，搖勻，得質(zhì)量濃度均為10μg/mL 的單一對(duì)照品溶液，4 ℃貯藏；根據(jù)單一對(duì)照品溶液響應(yīng)值的高低，用乙腈依次稀釋成不同質(zhì)量濃度的中間液，4 ℃貯藏。

供試品溶液：取藥材樣品粉末（過3 號(hào)篩）2 g，精密稱定，置50 mL 聚苯乙烯離心管中，加1%乙酸溶液15 mL，渦旋使之充分浸潤；加入4顆玻璃質(zhì)子球和乙腈15 mL，超聲（功率150 W、頻率40 kHz，下同）5 min，劇烈手搖3 min，加入無水硫酸鎂6 g、醋酸鈉1.5 g，密塞，劇烈手搖3 min后，冰浴冷卻5 min，期間輕搖2次，8 000 r/min離心5 min；取上清液1.5 mL置凈化管內(nèi)（內(nèi)含無水硫酸鎂150 mg、C1850 mg、PSA 50 mg、GCB 7.5 mg），渦旋使之充分混勻、手搖2 min 使之充分凈化，10 000 r/min 離心2 min，取上清液，過有機(jī)相微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：按2.2項(xiàng)下供試品溶液制備方法制得空白溶液，依次加入單一對(duì)照品溶液，制得質(zhì)量濃度依次為2，4，6，8，10，20 ng/ mL 的系列混合工作溶液，按2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，以各待測成分的質(zhì)量濃度（X，ng/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程和線性范圍。結(jié)果表明，47 種農(nóng)藥質(zhì)量濃度在2～20 ng/mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好（r＞0.997）。

檢測限考察：用空白溶液稀釋單一對(duì)照品溶液，按2.1 項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積；以信噪比（S/N）為3時(shí)對(duì)應(yīng)的待測成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為檢測限，結(jié)果檢測限介于0.04～6.50μg/kg，靈敏度較高。

精密度試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，按2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件連續(xù)進(jìn)樣測定6 次，記錄峰面積。結(jié)果47 種待測成分峰面積的RSD均小于3.0%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取空白溶液適量，加入單一對(duì)照品溶液，依法制得供試品溶液Ⅰ，分別于室溫下放置0，8，16，24，36，48 h 時(shí)按2.1 項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果的RSD均小于4.0%（n= 6），表明供試品溶液Ⅰ室溫下放置48 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：取空白溶液適量，加入混合對(duì)照品溶液，依法制得質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.05，0.1，0.5 mg/kg 的工作液，均按2.1 項(xiàng)下試驗(yàn)條件平行測定6 次，取平均值，結(jié)果3 種質(zhì)量分?jǐn)?shù)下的加樣回收率分別為72.23%～89.28%，77.54%～94.82%，82.03%～96.33%，RSD分別為2.47%～4.88%，2.68%～4.79%，1.47%～4.77%（n=6）。

基質(zhì)效應(yīng)考察：公式為ME（%）=（A1-A2）/A2×100%（式中，A1為空白基質(zhì)配標(biāo)的峰面積，A2為純?nèi)軇┡錁?biāo)的峰面積），僅當(dāng)ME 在± 20%之間可忽略［19］。結(jié)果47 種農(nóng)藥基質(zhì)效應(yīng)介于- 69%～49%，其中40 種農(nóng)藥存在負(fù)的基質(zhì)效應(yīng)（即基質(zhì)抑制農(nóng)藥的檢測靈敏度），且38 種農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)不可忽略，因此，試驗(yàn)中采用空白基質(zhì)配標(biāo)抵消基質(zhì)效應(yīng)，以提高結(jié)果的準(zhǔn)確度。

2.4 樣品檢測

取25批藥材樣品，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，結(jié)果10批藥材樣品中共檢出4種農(nóng)藥，其中批號(hào)200401檢出多菌靈（17.2μg/kg），批號(hào)211110檢出多菌靈（14.5μg/kg）、噻蟲嗪（35.2μg/kg），批號(hào)220401 檢出多菌靈（21.8 μg / kg），批號(hào)210809檢出多菌靈（20.9 μg/ kg），批號(hào)220310 檢出甲胺磷（10.2μg/kg），批號(hào)190701檢出甲胺磷（24.7μg/kg），批號(hào)211101 檢出噻蟲嗪（22.2μg/kg），批號(hào)220303 檢出克百威（92.8 μg/ kg），批號(hào)211001 檢出克百威（17.8μg/kg），批號(hào)220701檢出克百威（110.4μg/kg）。可能原因?yàn)榉N植人員未嚴(yán)格規(guī)范使用農(nóng)藥，也可能是土壤污染導(dǎo)致。檢測結(jié)果顯示，農(nóng)藥的使用有一定地域性，且淫羊藿中農(nóng)藥殘留的種類已從10 多年前的有機(jī)氯類農(nóng)藥演變?yōu)楝F(xiàn)在的有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥［20］。

3 討論

對(duì)于淫羊藿藥材，當(dāng)前大多數(shù)研究僅限于少數(shù)幾個(gè)農(nóng)藥殘留的同時(shí)測定，且多為有機(jī)氯類農(nóng)藥的測定，對(duì)于大多數(shù)為高等或中等毒性的有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的同時(shí)測定報(bào)道較少。與傳統(tǒng)的氣相色譜法、液相色譜法比較，本研究中所建HPLC - MS/ MS 法進(jìn)一步提高了檢測方法的準(zhǔn)確性和靈敏度，有高通量特性，大幅縮短了分析周期，節(jié)約了檢測成本，可用于同時(shí)檢測淫羊藿藥材中47種農(nóng)藥殘留。

中藥材農(nóng)藥檢測的樣品制備方法包括乙腈直接提取法、QuEChERS法、乙腈提取-固相萃取柱法。預(yù)試驗(yàn)中，向使用3 種不同方法制備的供試品溶液中加入0.05 mg/kg 水平的47 種農(nóng)藥對(duì)照品溶液（其他預(yù)試驗(yàn)同此加入水平），結(jié)果加樣回收率達(dá)標(biāo)（標(biāo)準(zhǔn)為70%～110%，下同）的分別有28，40，33種。

乙腈直接提取法加樣回收率達(dá)標(biāo)的農(nóng)藥個(gè)數(shù)較少（氯吡脲、氟蟲脲加樣回收率在50%以下），可能原因?yàn)?，溶液酸堿度不固定，對(duì)酸堿較敏感的農(nóng)藥可能會(huì)分解；以及樣品雜質(zhì)較多，方法除雜不徹底，造成基質(zhì)效應(yīng)較大，對(duì)某些農(nóng)藥回收影響較大。乙腈提取- 固相萃取柱法，加樣回收率達(dá)標(biāo)的農(nóng)藥個(gè)數(shù)也較少，可能原因?yàn)楣滔噍腿≈鶎?duì)淫羊藿藥材中基質(zhì)去除較多，從而減少了基質(zhì)對(duì)農(nóng)藥回收率的影響。因此，本研究中選取QuEChERS 法為淫羊藿農(nóng)藥檢測的樣品制備方法。

中藥材農(nóng)藥檢測常用的凈化試劑包括無水硫酸鎂、PSA、C18、硅膠、GCB。預(yù)試驗(yàn)中向陰性樣品中加入0.05 mg/ kg 水平的47 種農(nóng)藥對(duì)照品溶液，結(jié)果PSA、C18加入量均為10，30，50，70，90 mg 時(shí)47 種農(nóng)藥加樣回收率達(dá)標(biāo)個(gè)數(shù)分別為37，42，44，41，37 個(gè)。兩者加入量均為50 mg時(shí)47種農(nóng)藥加樣回收率達(dá)標(biāo)個(gè)數(shù)最多，加入量≥70 mg 時(shí)，溶液顏色逐漸變淺，加樣回收率達(dá)標(biāo)農(nóng)藥個(gè)數(shù)稍有下降，這可能與PSA、C18粉末與羥基、氨基、巰基等官能團(tuán)及脂溶性農(nóng)藥的吸附有一定關(guān)系。同時(shí)分別考察硅膠的加入量為0，10，30，50，70，90 mg；GCB的加入量為0，5，10，15，20，30 mg時(shí)47種農(nóng)藥的加樣回收率達(dá)標(biāo)的農(nóng)藥個(gè)數(shù)始終不多，且隨加入量的增加呈下降趨勢，可能是硅膠對(duì)47 種農(nóng)藥無差別的物理吸附導(dǎo)致，隨著硅膠量的增加，加樣回收率下降。去掉硅膠，其他條件保持不變，當(dāng)不加GCB 時(shí)，空白溶液中干擾峰較多，整體基線明顯上升，隨著GCB 量的增加，干擾峰減少，基線整體明顯下降，加樣回收率達(dá)標(biāo)農(nóng)藥個(gè)數(shù)在5，10 mg 時(shí)較高，在10 mg 時(shí)，基線整體較低。綜合加樣回收率達(dá)標(biāo)情況和基線整體水平，選擇GCB 添加量為10 mg。綜上所述，凈化試劑最終選擇為無水硫酸鎂150 mg、PSA 50 mg、C1850 mg、GCB 10 mg。

基質(zhì)效應(yīng)是影響農(nóng)藥殘留檢測結(jié)果準(zhǔn)確性和重復(fù)性的重要因素［21］，在液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用方面，基質(zhì)效應(yīng)主要來自樣品中雜質(zhì)和農(nóng)藥在離子化階段競爭離子化過程，或某些雜質(zhì)與農(nóng)藥形成離子對(duì)，導(dǎo)致檢測信號(hào)增強(qiáng)或減弱現(xiàn)象。本研究中涉及的大多數(shù)農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)為負(fù)值，故試驗(yàn)中采用空白基質(zhì)配標(biāo)的方法消除基質(zhì)效應(yīng)帶來的影響，提高了試驗(yàn)的準(zhǔn)確度。本研究的不足之處在于考察的殘留農(nóng)藥種數(shù)較少，后續(xù)將進(jìn)一步擴(kuò)大農(nóng)藥的種類，為淫羊藿藥材中農(nóng)藥殘留檢測的全覆蓋提供參考。

綜上所述，本研究中對(duì)25 批來自不同地區(qū)的淫羊藿藥材進(jìn)行檢測，其中10 批檢出4 種農(nóng)藥（多菌靈、噻蟲嗪、克百威、甲胺磷）殘留，且發(fā)現(xiàn)農(nóng)藥的使用呈現(xiàn)地域性，農(nóng)藥殘留的種類也已從10 多年前的有機(jī)氯類農(nóng)藥（國家已禁止生產(chǎn)和銷售）演變?yōu)楝F(xiàn)在的有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥。當(dāng)前市場上使用最廣、用量最大的為有機(jī)磷農(nóng)藥，本研究為有機(jī)磷農(nóng)藥在淫羊藿藥材種植過程中的使用情況提供了一定的檢測數(shù)據(jù)，也為相關(guān)部門的監(jiān)管和檢測提供了方向。