蘿卜種質(zhì)資源根腫病抗性鑒定與抗性基因遺傳分析

冉劍釗，孔垂豹，雍曉平，楊 峰，陳 琳，冉 科，冉茂林，李曉梅

（1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻高粱研究所 四川德陽 618000；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院 成都 611130；3.蔬菜種質(zhì)與品種改良四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 成都 610300）

根腫病又稱根癌病，是由蕓薹根腫菌（Plasmodiophora brassicaeWoron）侵染引起的一種土傳病害，是造成十字花科作物經(jīng)濟(jì)損失最嚴(yán)重的病害之一，威脅和制約著十字花科蔬菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[1]。20世紀(jì)50 年代，十字花科根腫病在我國(guó)逐漸流行，至今已蔓延至我國(guó)大部分地區(qū)，尤其以西南、東南及華中地區(qū)危害最重[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，根腫病在我國(guó)常年危害面積320～400 萬hm2，產(chǎn)量損失20%～30%[3]。

蘿卜（Raphanus sativusL.）是我國(guó)重要的十字花科蔬菜作物之一，年平均種植面積約130 萬hm2，年產(chǎn)量約4.5 萬t[4]。四川省蘿卜種植面積約10 萬hm2，為四川省第三大蔬菜，其不僅作鮮菜用，也是四川泡菜加工的重要原料之一，在四川現(xiàn)代農(nóng)業(yè)“10+3”產(chǎn)業(yè)體系的“川菜”產(chǎn)業(yè)發(fā)展中占有舉足輕重的地位。蘿卜為根腫菌的主要寄主之一，目前遼寧、吉林、黑龍江、河南、重慶、湖北、四川一帶均有蘿卜根腫病發(fā)生，部分嚴(yán)重地塊甚至出現(xiàn)絕收現(xiàn)象[5-10]。根腫菌休眠孢子在土壤中存活在20 年以上，一旦污染土壤，采用一般的農(nóng)業(yè)防治方法效果較差，而化學(xué)方法對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重，因此選育抗病品種被認(rèn)為是最經(jīng)濟(jì)、安全且有效的防治方法[11]。

種質(zhì)資源根腫病抗性鑒定與抗性基因遺傳分析是培育抗病品種的理論基礎(chǔ)。諸多研究表明，蘿卜抗性資源主要集中在歐洲、日本，而中國(guó)蘿卜普遍缺乏抗性基因[12-15]。Rowe[12]對(duì)68 份蘿卜資源進(jìn)行抗性評(píng)價(jià)，證實(shí)日本及部分法國(guó)蘿卜品種具有較強(qiáng)的根腫病抗性；Yang 等[14]對(duì)349 份蘿卜資源進(jìn)行抗性鑒定，發(fā)現(xiàn)85.06%的中國(guó)蘿卜表現(xiàn)感病，而大部分國(guó)外材料表現(xiàn)抗??；Wang 等[15]最新研究表明，82.50%中國(guó)蘿卜和57.56%的韓國(guó)蘿卜資源表現(xiàn)出感病。有關(guān)蘿卜根腫病抗性遺傳規(guī)律與抗性基因的研究較少，大部分學(xué)者認(rèn)為蘿卜根腫病抗性由一對(duì)顯性主效基因控制[15-19]，目前已定位到2 個(gè)主效基因位點(diǎn)Crs1[16]、RsCr6[19]，而僅有Gan 等[20]認(rèn)為蘿卜根腫病抗性由隱性多基因控制，并定位到5 個(gè)抗性QTLs。

綜上，雖然有關(guān)蘿卜根腫病抗性研究已取得一定進(jìn)展，然而相對(duì)于其他白菜、甘藍(lán)、油菜等十字花科作物來說還遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后[21]。同時(shí)，根腫菌存在廣泛的生理小種分化現(xiàn)象，單一的抗原容易產(chǎn)生抗性喪失的風(fēng)險(xiǎn)[22-24]。因此，開展更廣泛的蘿卜種質(zhì)資源根腫病抗性鑒定，培育對(duì)多個(gè)生理小種具有抗性的品種具有重要意義。筆者利用田間病圃鑒定篩選抗根腫病蘿卜種質(zhì)資源，然后通過室內(nèi)接種法對(duì)遺傳分離群體進(jìn)行抗性精準(zhǔn)鑒定，分析抗性基因遺傳規(guī)律，為后續(xù)品種選育應(yīng)用、抗性基因定位及抗性機(jī)制深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種 本試驗(yàn)室內(nèi)接種的根腫菌均采自四川省眉山市蘿卜根腫病發(fā)病田，經(jīng)根腫菌Williams 鑒定系統(tǒng)[9]鑒定為4 號(hào)生理小種，經(jīng)SCD 鑒定系統(tǒng)鑒定為Pb3 生理小種（菌樣：SCMS-164）[24]。

1.1.2 供試蘿卜材料 參與抗根腫病蘿卜種質(zhì)資源田間篩選鑒定的各類蘿卜品種/自交系共計(jì)54份，均由四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻高粱研究所蘿卜課題組提供，各材料詳情見表1。

表1 供試蘿卜材料詳情Table 1 Details of radish materials for the experiment

1.2 方法

1.2.1 蘿卜種質(zhì)資源根腫病抗性田間鑒定 蘿卜根腫病抗性種質(zhì)資源田間篩選鑒定在四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻高粱研究所蘿卜課題組建立的根腫病抗性鑒定圃內(nèi)開展，病圃位于眉山市東坡區(qū)農(nóng)光村，采用水稻與蘿卜輪作模式。水稻采收后，于2019 年9 月，稻田免耕播種蘿卜。試驗(yàn)采取隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3 次重復(fù)，每處理種子播種量不少于100粒，播種出苗20 d 后，施用少量尿素，保持田間土壤濕度在80%～90%，60 d 后進(jìn)行蘿卜根腫病抗性調(diào)查。

1.2.2 室內(nèi)接種鑒定 菌液制備：采集眉山田間發(fā)病的蘿卜，選擇處于發(fā)病中期、無皸裂、無腐爛的病根，清洗干凈表面泥土，用10%次氯酸鈉滅菌5 min，沖洗干凈，晾干后，放于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。室?nèi)接種鑒定時(shí)，取適量?jī)龃娌「?，于培養(yǎng)箱25 ℃活化3 d，再用組織研磨機(jī)打碎，8 層紗布過濾，用血球計(jì)數(shù)板于顯微鏡下觀察濾液休眠孢子濃度，將菌液濃度調(diào)至1×108個(gè)?mL-1備用。

試驗(yàn)處理與培養(yǎng)條件：選擇飽滿一致的蘿卜種子，75%酒精滅菌90 s，無菌水沖洗3 次，置于發(fā)芽盤催芽，基質(zhì)于播種前1 天澆透水，每處理播種1盤，3 次重復(fù)，播種深度2 cm 左右，每穴播種2 顆，每穴注射5 mL 菌液后覆蓋基質(zhì)，穴盤放入塑料托盤內(nèi)，置于光照培養(yǎng)室，于25 ℃、12 h 光照條件下培養(yǎng)，接種后3 d 內(nèi)不澆水，中途施用大量溶液水溶肥2 次，55 d 后調(diào)查發(fā)病情況。

1.2.3 病情分級(jí)及抗性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 病情分級(jí)參照甘彩霞等[8]分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，略有修改（圖1）。

圖1 根腫病田間（上）與室內(nèi)（下）抗性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)Fig.1 Classification standard of resistance to clubroot in field（up）and indoor（down）

0 級(jí)，蘿卜根系生長(zhǎng)正常，無腫瘤；1 級(jí)，根系的須根或側(cè)根有較少細(xì)小腫瘤，主根未發(fā)生病害；2級(jí)，根系的須根或側(cè)根有較多腫瘤，主根發(fā)病較輕，稍微腫大；3 級(jí)，根系的主根發(fā)病較重，異常腫大，大部分須根、側(cè)根有很多腫瘤；4 級(jí)，根系的主根異常腫大，須根、側(cè)根有很多腫瘤，根瘤總直徑超出頸粗5 倍以上，或根部出現(xiàn)腐爛，甚至植株死亡。

病情指數(shù)（DI）＝∑（發(fā)病級(jí)代表值×各級(jí)病株數(shù)）/（調(diào)查總株數(shù)×最高發(fā)病級(jí)代表值）×100；（1）

DI=0，免疫（IR）；0＜DI≤10，抗?。≧）；10＜DI≤30，耐病（T）；30＜DI≤60，感?。⊿）；DI＞60，高感（HS）。

發(fā)病率/%＝發(fā)病株數(shù)/觀察總株數(shù)×100。（2）

1.2.4 抗性基因遺傳分析 于2020 年4 月，利用免疫級(jí)抗性材料（白雪公主）與高感材料（重慶砂罐蘿卜）正反交獲得F1，2021 年4 月，將F1代材料自交獲得F2。2021 年7 月對(duì)親本、F1、F2代材料開展室內(nèi)接種鑒定，55 d 后調(diào)查數(shù)據(jù)，然后利用Excel 對(duì)病情調(diào)查結(jié)果進(jìn)行χ2檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘿卜種質(zhì)資源根腫病抗性田間鑒定

通過田間病圃鑒定發(fā)現(xiàn)，不同蘿卜種質(zhì)資源對(duì)根腫病抗性存在差異（表2）。54 份蘿卜種質(zhì)資源發(fā)病率在0～100%，病情指數(shù)在0～93.73，其中共鑒定到免疫級(jí)抗性材料（IR）2 份、抗病材料（R）5 份，耐病材料（T）8 份，感病材料（S）13 份，高感材料（HS）26 份。

表2 蘿卜種質(zhì)資源根腫病抗性田間鑒定結(jié)果Table 2 Identification result of resistance to clubroot of radish germplasm

從蘿卜種質(zhì)資源來源分析，發(fā)現(xiàn)根腫病抗性材料主要來自國(guó)外，占總抗性材料的85.71%，其中2份免疫材料分別來自日本與韓國(guó)，4 份抗性材料來自歐洲，僅有1 份抗性材料（捷夏美45）來自國(guó)內(nèi)，而86.05%的國(guó)內(nèi)蘿卜表現(xiàn)感病。

從蘿卜類型分析，發(fā)現(xiàn)抗病、耐病材料以長(zhǎng)白蘿卜（6 份）、黑蘿卜（2 份）、櫻桃蘿卜（3 份）為主，僅有1 份圓白蘿卜郫縣小黃葉與1 份紅蘿卜郫縣紅蘿卜表現(xiàn)出一定耐病性，在青蘿卜和紫蘿卜中缺乏抗性種質(zhì)資源。

免疫材料白雪公主與高感材料重慶砂罐蘿卜均為高代自交系（圖2），用于后續(xù)遺傳群體構(gòu)建。

圖2 白雪公主（A）與重慶砂罐蘿卜（B）根腫病田間抗性鑒定Fig.2 Resistance identification of Snow White（A）and Chongqing Shaguan radish（B）to clubroot in field

2.2 蘿卜根腫病抗性基因的遺傳分析

為保證遺傳分析的準(zhǔn)確性，采用更穩(wěn)定的室內(nèi)接種鑒定法對(duì)遺傳群體進(jìn)行抗性鑒定。由圖3、表3 可知，接種55 d 后的抗病親本（R）未出現(xiàn)任何病征，而感病親本（S）發(fā)病率為100%，且發(fā)病等級(jí)均在3～4 級(jí)，抗性材料白雪公主與高感材料重慶砂罐蘿卜正反交F1均表現(xiàn)出免疫級(jí)抗性，說明抗性基因具有完全顯性質(zhì)量性狀的特征。在500 株F2（R×S）群體中，385 株表現(xiàn)為抗病，115 株表現(xiàn)為感病；在1506 株F2（S×R）群體中，1116 株表現(xiàn)為抗病，390株表現(xiàn)為感病。正反交組合均符合單基因顯性遺傳3∶1 分離比（抗、感比例在p=0.05 水平時(shí)χ2≤3.84），說明白雪公主含有1 對(duì)根腫病抗性基因。

圖3 親本及F1 群體根腫病抗性表現(xiàn)Fig.3 Resistance of parents and F1 population to clubroot disease

表3 遺傳群體根腫病抗性表現(xiàn)Table 3 Resistance of genetic population to clubroot disease

3 討論與結(jié)論

中國(guó)為蘿卜起源中心之一，蘿卜種質(zhì)資源豐富多樣，擁有近2000 個(gè)地方品種，蘿卜不僅可以熟食、生食、加工，還可藥用和飼用，蘿卜產(chǎn)業(yè)在我國(guó)國(guó)民生產(chǎn)生活中具有重要的地位[25]。近年來，隨著人口和物質(zhì)的全球化流動(dòng)、農(nóng)業(yè)機(jī)械化程度的不斷提高以及農(nóng)業(yè)機(jī)械跨區(qū)域作業(yè)的實(shí)施，根腫病的蔓延速度加大，嚴(yán)重威脅十字花科蔬菜產(chǎn)業(yè)的安全生產(chǎn)[26]。蘿卜被認(rèn)為是十字花科作物中具有較強(qiáng)根腫病抗性的作物，但大部分研究結(jié)果表明蘿卜抗性資源主要集中在國(guó)外，而中國(guó)蘿卜抗源較少[13-15]，筆者的供試材料中86.05%的中國(guó)蘿卜感病，與前人研究結(jié)果相似。感病品種大多數(shù)是一些有名的地方品種，如心里美、山東濰縣青、重慶胭脂紅、成都春不老、重慶草兜等，這些地方資源符合當(dāng)?shù)叵M(fèi)習(xí)慣，在當(dāng)?shù)靥}卜生產(chǎn)與加工產(chǎn)業(yè)中發(fā)揮著重要作用。然而，根腫病的日益危害與中國(guó)蘿卜抗性資源的缺乏，對(duì)中國(guó)蘿卜產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展帶來了巨大威脅。根腫菌存在廣泛的生理小種分化現(xiàn)象，且抗性基因?qū)Σ煌硇》N具有特異性。甘彩霞等[8]以湖北長(zhǎng)陽山區(qū)根腫菌對(duì)100 份蘿卜種質(zhì)資源進(jìn)行抗性鑒定評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)春不老、重慶冰糖蘿卜2 份圓白蘿卜材料表現(xiàn)抗病，而筆者的研究中2 份材料分別為高感、感病材料，可能是根腫菌生理小種不同所致。Pang 等[24]利用新建立的根腫菌SCD 鑒定系統(tǒng)，表明來自長(zhǎng)陽山區(qū)火燒坪的根腫菌生理小種為Pb10（HBHSP-91），來自四川眉山的根腫菌生理小種為Pb3（SCMS-164），進(jìn)一步證實(shí)蘿卜不同品種對(duì)根腫菌生理小種具有?；剐?，因此篩選多抗種質(zhì)資源尤為必要。筆者的研究篩選到2 份對(duì)根腫菌生理小種Pb3 免疫的蘿卜材料，其是否對(duì)國(guó)內(nèi)多個(gè)根腫菌生理小種具有抗性還需要進(jìn)一步鑒定。

掌握根腫病抗性遺傳規(guī)律是抗病材料創(chuàng)制的理論依據(jù)。目前，十字花科作物根腫病抗性遺傳研究主要集中在白菜（B.rapa）、甘藍(lán)型油菜（B.napus）、甘藍(lán)（B.oleracea）這三大類蕓薹屬作物中，且在以上3 種作物中抗性遺傳基礎(chǔ)存在差異。B.rapa根腫病抗性主要是受單個(gè)顯性主效基因控制的質(zhì)量性狀，B.napus根腫病抗性是由若干個(gè)獨(dú)立的顯性基因控制的質(zhì)量性狀，B.oleracea根腫病抗性主要是多基因控制的數(shù)量性狀[27]。受主效基因或獨(dú)立顯性基因控制的性狀更容易進(jìn)行轉(zhuǎn)育與基因定位研究，至今在大白菜上已定位27 個(gè)抗性位點(diǎn)，在油菜上已定位45 個(gè)抗性位點(diǎn)，并通過傳統(tǒng)或分子標(biāo)記輔助選育手段培育了大批優(yōu)秀的白菜、油菜根腫病抗性品種[21，26-27]。然而，有關(guān)蘿卜根腫病抗性遺傳與抗性基因的研究較少，大部分學(xué)者認(rèn)為蘿卜根腫病抗性由一對(duì)顯性主效基因控制[15-19]，與筆者的研究結(jié)果一致，而Gan 等[20]認(rèn)為蘿卜根腫病抗性由隱性多基因控制，可能是用于試驗(yàn)的蘿卜品種與根腫病生理小種不同所致。

綜上所述，蘿卜根腫病抗性田間病圃鑒定結(jié)果表明，54 份種質(zhì)資源對(duì)根腫病的抗病能力存在差異?？剐蕴}卜品種主要來自國(guó)外，國(guó)內(nèi)大部分品種表現(xiàn)感病。筆者通過抗性遺傳規(guī)律分析發(fā)現(xiàn)免疫材料白雪公主的根腫病抗性基因受一對(duì)顯性核基因控制，這一材料的獲得將加快蘿卜根腫病抗性基因的定位、克隆及抗病新品種的培育進(jìn)程。