下丘腦室旁核miR-132對心力衰竭大鼠外周交感神經(jīng)興奮性的影響

劉羽承 郭雨欣 張波,2 李晶,2 趙津璋,3 辛恬 于海波 賈琳琳,2

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 1生理教研室,黑龍江 佳木斯 154000;2微生態(tài)-免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)與相關(guān)疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;3佳木斯市中心醫(yī)院;4佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院)

外周交感神經(jīng)興奮性增強(qiáng)是心力衰竭(HF)早期即可出現(xiàn)的病理特征及臨床治療的主要靶點(diǎn)。下丘腦室旁核(PVN) 是參與心血管活動調(diào)節(jié)的重要部位,包含有多種類型的神經(jīng)遞質(zhì)。有研究證實(shí)高血壓、HF發(fā)生時下丘腦PVN內(nèi)谷氨酸(Glu)、去甲腎上腺素(NE)的表達(dá)上調(diào),而γ-氨基丁酸(GABA)、一氧化氮(NO)表達(dá)下調(diào),這種興奮性神經(jīng)遞質(zhì)和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)表達(dá)失衡可導(dǎo)致PVN內(nèi)神經(jīng)元基礎(chǔ)活動的改變,從而影響外周交感神經(jīng)的活動和基礎(chǔ)血壓〔1,2〕。前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)HF大鼠下丘腦PVN miR-132表達(dá)升高并伴有Glu含量增高,由此推測下丘腦PVN miR-132在HF狀態(tài)下對調(diào)控外周交感神經(jīng)活動發(fā)揮重要作用〔3〕。本項(xiàng)目通過建立HF大鼠模型,在下丘腦PVN灌注miR-132特異抑制劑,觀察大鼠交感神經(jīng)興奮性和心功能的改變,從而明確miR-132在HF中樞機(jī)制的作用。

1 材料與方法

1.1制造HF動物模型 將購于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心的健康、成年、雄性SD大鼠〔SCXK (黑) 2019-001,清潔級〕隨機(jī)分為正常對照(Ctrl)+人工腦脊液(ACSF)組、HF+ACSF組及HF+miR-132抑制劑組。HF動物模型制作:抽取10%水合氯醛(40 mg/kg)通過腹腔注射給藥,待實(shí)驗(yàn)動物麻醉后,將氣管插管插入口腔,固定后一端與呼吸機(jī)相連,開胸暴露心臟,在左冠狀動脈前降支偏上的位置穿線打結(jié)后,肉眼觀察到由于血供減少導(dǎo)致心室壁顏色變淺、活動減弱,心電圖(ECG)檢測出現(xiàn)ST段抬高,Ctrl+ACSF組開胸不結(jié)扎血管,4 w后檢測心功能和ECG,左室舒張末壓力(LVEDP)≥15 mmHg作為判定HF制作成功的標(biāo)準(zhǔn),不符合的實(shí)驗(yàn)動物剔除〔4〕。

1.2側(cè)腦室插管 根據(jù)大鼠解剖圖譜進(jìn)行側(cè)腦室插管,以前囟為基點(diǎn)尋找進(jìn)針點(diǎn),插管位置為前囟后1.0 mm、旁開1.5 mm、深3.5 mm,墨水標(biāo)記。用連接滲透壓泵的無菌不銹鋼管插至標(biāo)記處,固定后埋于頸背部皮下。HF+miR-132抑制劑組大鼠通過滲透泵注入miR-132特異抑制劑0.1 nmol/d,Ctrl+ACSF組和HF+ACSF組每天微灌注等量的ACSF,各組實(shí)驗(yàn)動物持續(xù)灌注4 w〔5〕。

1.3主要的儀器和試劑 多通道小動物人工呼吸機(jī)(DB038-1)、精密注射泵(LSP01-2A)、高效液相色譜儀(STI501)、腦立體定位儀(DB053)、東芝四維彩超(Aplio50)、倒置光學(xué)顯微鏡(Olympus)、BL-420生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟公司)、miR-132特異抑制劑(Biomics Biotech)、大鼠腦鈉肽(BNP)、NE酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(碧云天生物科技公司)等。

1.4心功能檢測 通過超聲心動圖和血流動力學(xué)檢測心率(HR)、LVEDP等心功能指標(biāo),超聲檢測和分析由臨床超聲醫(yī)師完成,血流動力學(xué)檢測步驟參考El-Husseing等〔6〕的方法。

1.5腎交感神經(jīng)活動(RSNA)檢測 對于心血管活動的調(diào)節(jié),腎交感神經(jīng)具有很高的緊張性,因此應(yīng)用電生理實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測RSNA來直接反映外周交感神經(jīng)活動的瞬時變化。神經(jīng)的分離及放電的檢測方法同文獻(xiàn)〔7〕。

1.6血漿BNP和NE含量檢測 動物在非麻醉狀態(tài)下通過內(nèi)眥靜脈取血,離心收集血樣標(biāo)本后嚴(yán)格執(zhí)行ELISA試劑盒說明書步驟檢測血漿NE和BNP水平,外周血液中的NE含量可間接反映外周交感神經(jīng)的興奮性。

1.7下丘腦PVN Glu含量檢測 使用大鼠腦定位圖譜來明確下丘腦PVN所處位置:視交叉后緣向后1.5～2.0 mm,垂直7.1～8.1 mm。側(cè)腦室灌注4 w后麻醉狀態(tài)下斷頭處死實(shí)驗(yàn)動物,將下丘腦PVN腦組織立即取出,超聲粉碎、勻漿取上清之后,應(yīng)用高效液相色譜(HPLC) 儀檢測Glu含量,藥學(xué)院專業(yè)技師完成儀器操作及結(jié)果分析。

1.8光鏡下心臟組織結(jié)構(gòu)觀察 麻醉狀態(tài)下斷頭處死實(shí)驗(yàn)動物,快速開胸將心臟取下,去除心臟周圍其他組織后用生理鹽水清洗,然后用濾紙吸干且稱質(zhì)量,計算心臟質(zhì)量指數(shù):心臟質(zhì)量與體質(zhì)量的比值(HW/BW)。將置于4%多聚甲醛溶液中的心肌組織仔細(xì)取出,蘇木素-伊紅(HE)染色,放置在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.9統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1心功能和HW/BW檢測 ECG可見:HF+ACSF組出現(xiàn)明顯的ST段抬高、T波振幅變高;相較于HF+ACSF組,HF+miR-132抑制劑組ST段抬高的幅度和速度降低、T波振幅相對變低;Ctrl+ACSF組ECG無明顯異常。見圖1。與Ctrl+ACSF組比較,HF+ACSF組和HF+miR-132抑制劑組HW/BW、LVEDP、HR顯著升高,左室收縮壓(LVSP)、射血分?jǐn)?shù)(EF)顯著降低(P<0.05,P<0.000 1,P<0.01);HF+miR-132抑制劑組心功能和HW/BW與HF+ACSF組相比較有明顯改善(P<0.05,P<0.000 1,P<0.001)。見表1。

圖1 各組ECG檢測結(jié)果

表1 各組心功能及HW/BW比較

2.2血漿BNP、NE含量及下丘腦PVN中Glu含量 HF+ACSF組和HF+miR-132抑制劑組血漿BNP、NE含量及下丘腦PVN Glu含量與Ctrl+ACSF組相比顯著升高(P<0.000 1,P<0.01); 與HF+ACSF組比較,HF+miR-132抑制劑組可降低HF大鼠血漿NE、BNP及下丘腦PVN Glu水平(P<0.05)。見表2。

2.3電生理檢測 HF+ACSF組RSNA放電頻率和幅度與Ctrl+ACSF組相比明顯增快、增高 (P<0.000 1);HF+miR-132抑制劑組RSNA幅度顯著小于Ctrl+ACSF組(P<0.000 1);HF+miR-132抑制劑組RSNA與HF+ACSF組相比較顯著降低(P<0.000 1)。見表2。

2.4組織學(xué)觀察 與Ctrl+ACSF組相比較,HF+ACSF組心肌細(xì)胞核淡染且數(shù)量明顯減少,心肌纖維皺縮,肌間隙明顯變寬,有斷裂和空泡樣變性出現(xiàn);HF+miR-132抑制劑組心肌組織出現(xiàn)病理改變的程度與HF+ACSF組相比較明顯減輕。見圖2。

表2 各組血漿NE、BNP、下丘腦PVN Glu含量 及RSNA比較

圖2 3組心肌組織(HE染色,×200)

3 討 論

多種miRNA參與HF的發(fā)生和發(fā)展,但其中最引起重視的是miR-132。miR-132在HF的心肌細(xì)胞中表達(dá)增高,可通過影響多條信號通路的靶向下游分子調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞生長、自噬、凋亡和收縮等功能參與心室重構(gòu),動物和臨床試驗(yàn)均證實(shí)應(yīng)用miR-132抑制劑可改善心功能和心肌纖維化,達(dá)到緩解癥狀、延緩甚至逆轉(zhuǎn)HF病程的作用〔8,9〕。研究表明,外周血液中的miR-132水平與HF的嚴(yán)重程度密切相關(guān),低水平的miR-132相較于傳統(tǒng)的危險因素,可提高HF患者再入院的風(fēng)險預(yù)測,miR-132有望成為輔助診斷、評估HF預(yù)后的標(biāo)志物及臨床治療的靶點(diǎn)〔10〕。綜上可知,外周組織中表達(dá)增多的miR-132在HF進(jìn)程中發(fā)揮著重要的功能。

miR-132是與中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)功能相關(guān)的miRNA,參與調(diào)節(jié)CNS的發(fā)育和活動,并與多種CNS疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)〔11〕。CNS內(nèi)的miR-132與興奮性神經(jīng)遞質(zhì)Glu關(guān)系密切,可參與N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體介導(dǎo)的Glu信號基因調(diào)控〔12,13〕。

本研究結(jié)果顯示,HF大鼠表現(xiàn)出不同程度心功能損害,應(yīng)用miR-132抑制劑后心功能各項(xiàng)指標(biāo)和心臟病理改變均有所改善,下丘腦PVN灌流miR-132抑制劑可明顯降低RSNA和Glu水平。但有研究表明在疾病進(jìn)展的不同階段,miR-132功能失衡和作用機(jī)制可受多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控,在CNS的表達(dá)和新陳代謝也與神經(jīng)元的實(shí)時狀態(tài)及谷氨酸受體是否被抑制和激活有關(guān)〔14,15〕。為此,下丘腦PVN miR-132對HF狀態(tài)下外周交感神經(jīng)活動的影響機(jī)制還需深入研究。