基于HMGB1/TLR4信號(hào)通路使用迷走神經(jīng)刺激治療難治性癲癇的效果

張冬 梁振 李永格

(1南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部,河南 南陽(yáng) 473061;2河南省腫瘤醫(yī)院神經(jīng)外科)

難治性癲癇的主要特點(diǎn)是存在腦部反復(fù)發(fā)作癲癇的可能性〔1〕,相關(guān)研究顯示,迷走神經(jīng)刺激(VNS)是當(dāng)下治療難治性癲癇的有效治療手段之一。VNS又被稱為自主神經(jīng)刺激,可顯著減少癲癇的發(fā)作次數(shù)〔2,3〕。因此,大部分研究學(xué)者認(rèn)為VNS會(huì)有效提升難治性癲癇患者的生活質(zhì)量。高遷移率族蛋白(HMG)B1廣泛分布在真核細(xì)胞中,在癲癇發(fā)作中,它會(huì)從受損膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元中活化內(nèi)皮細(xì)胞,引發(fā)炎癥反應(yīng),讓血液及膠質(zhì)細(xì)胞中的各種免疫細(xì)胞功能受限〔4〕。在癲癇發(fā)作后,星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元中Toll樣受體(TLR)4會(huì)得到活化,進(jìn)而會(huì)引發(fā)神經(jīng)性炎癥,進(jìn)而它會(huì)與HMGB1組成信號(hào)通路來(lái)參與癲癇的發(fā)生、發(fā)展〔5,6〕。本文主要通過(guò)VNS來(lái)分析其對(duì)HMGB1/TLR4信號(hào)通路是否有調(diào)控作用,同時(shí)在證實(shí)VNS治療難治性癲癇的療效是否顯著。

1 材料與方法

1.1研究動(dòng)物 選擇40只清潔級(jí)健康成年SD大鼠,雌雄各半,體質(zhì)量230～255 g,均由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證號(hào)為:SCXK(京)2021-0008。實(shí)驗(yàn)前,適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w,采用開(kāi)放喂養(yǎng)系統(tǒng),遵循自然規(guī)律進(jìn)行光照照射,室溫保持24～26 ℃,喂養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室大鼠食物飼料及自來(lái)水,讓大鼠適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境中對(duì)動(dòng)物的取材、飼養(yǎng)、手術(shù)等。主要試劑及儀器:氯化鋰、匹魯卡品、東莨菪堿(美國(guó)sigma公司),苯巴比妥鈉(PB,上海新亞藥業(yè)),戊巴比妥鈉溶液(武漢純度生物科技有限公司),多聚甲醛磷酸鹽緩沖液(PBS,廣州美基生物科技有限公司),電生理信號(hào)采集器(Digidata1440A,美國(guó)Axon Instruments公司),可粘貼性皮膚刺激電極片(直徑5 mm,自制),數(shù)字脈沖刺激器(Master-8/Iso-flex,美國(guó)AMPI公司),80-2型低速離心機(jī)(上海手術(shù)器械廠),紅外視頻監(jiān)測(cè)系統(tǒng)(上海景陽(yáng)監(jiān)控,型號(hào)SR-TX420-SL),蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(武漢谷歌生物科技公司),HMGB1、TLR多克隆抗體購(gòu)自亞科因(武漢)生物技術(shù)有限公司,免疫組化檢測(cè)試劑盒購(gòu)自福州邁新公司。石蠟切片機(jī)(RM2245,德國(guó)Leica公司),光學(xué)顯微鏡(Leica公司)。

1.2分組、建模 將40只大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組(A組)、難治性癲癇模型組(B組)、假刺激組(C組)、VNS組(D組),每組各10只。

難治性癲癇大鼠模型的建立:向B、C、D組腹腔內(nèi)注射濃度為1 mol/L的氯化鋰3 mmol/kg,19.5 h后再向這些大鼠皮下濃度為0.5 g/L的1 mg/kg注射東莨菪堿,半小時(shí)后向腹腔注射濃度為10 g/L的匹魯卡品30 mg/kg,空白對(duì)照組腹腔注射0.9%生理鹽水30 mg/kg。使用匹魯卡品的大鼠大約會(huì)在注射半小時(shí)后出現(xiàn)持續(xù)癲癇,等癲癇持續(xù)1 h后注射地西泮(安定)10 mg/kg讓大鼠終止發(fā)作。利用監(jiān)控系統(tǒng)檢測(cè)建模成功后大鼠癲癇的發(fā)展情況,等14 d后大鼠均進(jìn)入癲癇自主發(fā)作階段。

迷走神經(jīng)分離術(shù):向C、D組大鼠腹腔內(nèi)注射濃度為25%的烏拉坦4 ml/kg,讓大鼠仰臥手術(shù)臺(tái),在其頸部備皮,正中切口長(zhǎng)度保持5 cm,切口涉及大鼠淺筋及皮膚,沿其左側(cè)胸骨骨肌進(jìn)入左側(cè)頸動(dòng)脈鞘,利用玻璃針?lè)珠_(kāi)頸動(dòng)脈鞘,游離左側(cè)迷走神經(jīng)。將自制C型雙極銀質(zhì)電極刺激端置于大鼠迷走神經(jīng)干上,兩電極距離為1～2 mm,將無(wú)菌恒溫石蠟油棉條固定在大鼠游走神經(jīng)干,置于C型電極凹槽內(nèi),縫合傷口,通電刺激時(shí),電刺激器與C型電極遠(yuǎn)端連接。

1.3方法 A組、B組不作任何刺激處理,C、D組大鼠左耳部剃毛,左頸部植入VNS電極,C組不刺激通電。D組進(jìn)行通電刺激,VNS刺激參數(shù)設(shè)置為:電流控制在0.25～1.0 mA之間,波寬為500 μs,頻率為25 Hz,刺激時(shí)間為30 s,刺激時(shí)間為12 h(08∶00～20∶00),間歇為5 min,連續(xù)刺激28 d,在大鼠進(jìn)行刺激之前使其適應(yīng)刺激環(huán)境,電流由0.25 mA逐漸增加,1 w后提高到最大值1.0 mA,利用電腦視頻系統(tǒng)監(jiān)測(cè)大鼠癲癇發(fā)作狀況。

1.4指標(biāo)觀察 42 d后,按照40 mg/kg的比例將1%戊巴比妥鈉溶液注射大鼠腹腔進(jìn)行麻醉,靜待大鼠麻醉成功后,主動(dòng)脈取血5 ml,將血樣以14 000 r/min的速度離心5 min,沉淀蛋白質(zhì),吸取上清液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾備用。①處死大鼠,用4%多聚甲醛PBS灌注斷頭取腦,取大鼠海馬組織進(jìn)行HE染色。在光學(xué)顯微鏡高倍視野(×400)下隨機(jī)選取CA3區(qū)4個(gè)不重復(fù)視野,觀察各組大鼠細(xì)胞數(shù)量、核仁狀態(tài)、存活錐體細(xì)胞數(shù)、陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)等,應(yīng)用計(jì)算機(jī)病理圖像分析系統(tǒng) Image Pro Plus6.0 分析。②利用24 h電腦監(jiān)控系統(tǒng)記錄刺激前1 w及刺激后1 w B、C、D組癲癇發(fā)作頻率(癲癇持續(xù)時(shí)間超過(guò)30 s)。③采用免疫組化檢測(cè)單核趨化蛋白(MCP)-1、層黏連蛋白(LAP)、P糖蛋白(gp)。在海馬部位灰度比值,將切片常規(guī)脫蠟水化,于60 ℃恒溫箱中烘烤1.5 h,加入二甲苯浸提10 s,自來(lái)水沖洗3 min后用PBS沖洗3次,加入0.01 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液,冷卻后用PBS沖洗,加入3%H2O2覆蓋切片組織表面,37 ℃避光恒溫箱孵育10 min,棄一抗,取出,置于4 ℃冰箱中過(guò)夜,然后二抗孵育后置入37 ℃恒溫箱孵育30 min,PBS沖洗3次,1次/3 min,擦干,甩掉二抗,PBS沖洗3次,每次3 min,加入二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液,光鏡下觀察顯色程度,讀取表達(dá)后計(jì)算比值。④Western印跡檢測(cè)海馬組織HMGB1、TLR4蛋白的表達(dá)。取50 mg海馬組織,用Western印跡提取組織總蛋白,調(diào)整蛋白質(zhì)濃度,經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、膜轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,加入對(duì)應(yīng)一抗,于4 ℃條件下孵育過(guò)夜,TBST漂洗40 min,分為3次漂洗,再加入經(jīng)(HRP)標(biāo)記的二抗繼續(xù)孵育1 h,根據(jù)電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)蛋白條帶進(jìn)行顯影、定影,觀察、分析各組蛋白條帶成像情況。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS25.0軟件進(jìn)行方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1大鼠海馬CA3區(qū)觀察 大鼠海馬CA3區(qū)HE染色結(jié)果如圖1所示,形態(tài)正常,排列整齊,核仁清晰;與A組相比,B組海馬CA3區(qū)細(xì)胞數(shù)量最少,且出現(xiàn)形態(tài)的嚴(yán)重?fù)p傷,核仁溶解、縮小、模糊不清,核斷裂現(xiàn)象嚴(yán)重;與B組相比,C組癥狀無(wú)明顯區(qū)別,神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量及核仁狀態(tài)都受損嚴(yán)重;D組則有明顯變化,細(xì)胞數(shù)量大幅度增加、形態(tài)趨于正常,核仁狀態(tài)恢復(fù)良好。

2.2大鼠每周癲癇發(fā)作次數(shù)比較 刺激前1 w,B、C、D組癲癇發(fā)作頻率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);刺激結(jié)束后1 w,與B、C組相比,D組刺激結(jié)束后癲癇發(fā)作頻率顯著減少(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.3大鼠海馬組織存活錐體細(xì)胞數(shù)、陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) 與A組相比,B組、C組、D組海馬組織存活錐體細(xì)胞數(shù)明顯減少、海馬組織陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增加(P<0.05);與B、C組相比,D組海馬組織存活錐體細(xì)胞數(shù)明顯增加,海馬組織陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.4大鼠海馬區(qū)MCP-1、LAP、P-gp灰度比值比較 與A組相比,B組、C組、D組海馬區(qū)MCP-1、LAP、P-gp灰度比值明顯增加(P<0.05);與B、C組相比,D組海馬區(qū)MCP-1、LAP、P-gp灰度比值明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

圖1 各組海馬CA3區(qū)(HE染色,×400)

表1 各組每周癲癇發(fā)作次數(shù)、海馬組織存活錐體細(xì)胞數(shù)、陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、海馬區(qū)MCP-1、LAP、P-gp灰度比值比較

2.5HMGB1、TLR4蛋白表達(dá)比較 與A組相比,B組、C組、D組海馬區(qū)HMGB1、TLR4表達(dá)增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與B、C組相比,D組海馬區(qū)HMGB1、TLR4表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2、圖2。

表2 HMGB1、TLR4蛋白表達(dá)比較

圖2 Western印跡檢測(cè)各組HMGB1、TLR4蛋白表達(dá)

3 討 論

癲癇以短暫性、陣發(fā)性、突發(fā)性、反復(fù)發(fā)作的大腦功能性障礙為主要表現(xiàn)特征〔7,8〕。雖然當(dāng)前臨床上,有各種各樣的抗癲癇藥物不斷取得顯著的臨床治療效果,但在癲癇發(fā)病人群中仍有30%～40%的患者不能獲得滿意治療療效,這種則屬于難治性癲癇,難治性癲癇有其自身的復(fù)雜性,且對(duì)多種藥物有耐藥性。在手術(shù)治療上,很多難治性癲癇患者往往因?yàn)樯窠?jīng)功能損害而不適合致癲癇病灶的切除。

VNS是臨床中第一個(gè)被批準(zhǔn)使用的刺激性治療方法,這種治療手段主要是針對(duì)不能進(jìn)行外科手術(shù)治療的難治性癲癇患者而推出的輔助治療方案。VNS治療的原理是通過(guò)外科手術(shù)將螺旋電極纏繞于頸部迷走神經(jīng)上,將可植入裝置置于胸前,然后調(diào)整相關(guān)參數(shù)模式,通電刺激迷走神經(jīng),最終達(dá)到治療目的〔9,10〕。有研究顯示,VNS可以對(duì)病灶進(jìn)行精準(zhǔn)定位在經(jīng)電刺激后會(huì)降低癲癇發(fā)病次數(shù),甚至可以完全控制病情〔11〕。分析VNS的具體作用機(jī)制,需要從迷走神經(jīng)入手,迷走神經(jīng)的傳出、傳入神經(jīng)纖維主要廣泛分布于內(nèi)臟與軀體中,這些神經(jīng)纖維會(huì)投射到腦部各個(gè)部位,與內(nèi)臟功能產(chǎn)生相關(guān)反射,而迷走神經(jīng)這種網(wǎng)狀傳出、傳入神經(jīng)系統(tǒng)最適合VNS的作用原理,VNS可在刺激中利用上行、下行網(wǎng)狀神經(jīng)系統(tǒng)控制脊髓,進(jìn)而調(diào)節(jié)大腦皮質(zhì)的相關(guān)功能〔12〕。

相關(guān)研究顯示,有超過(guò)70%的藥物難治性癲癇患者在手術(shù)治療時(shí)被發(fā)現(xiàn)其海馬出現(xiàn)萎縮、硬化現(xiàn)象,難治性癲癇的反復(fù)發(fā)作則是造成海馬硬化萎縮的主要原因,而反過(guò)來(lái)海馬萎縮又會(huì)讓癲癇發(fā)作次數(shù)增多,形成一種惡性循環(huán)〔13,14〕。本研究結(jié)果說(shuō)明,VNS可以讓難治性癲癇大鼠海馬組織CA3區(qū)受損狀態(tài)得到改善,內(nèi)皮細(xì)胞、核仁、微血管等都處于恢復(fù)狀態(tài),提示VNS會(huì)減輕難治性癲癇造成的海馬組織損傷。

本研究說(shuō)明,VNS治療會(huì)有效控制難治性癲癇的發(fā)作,減少海馬神經(jīng)元的凋亡、壞死,進(jìn)而保護(hù)海馬神經(jīng)元,這一點(diǎn)或許就是VNS抗癲癇的作用機(jī)制,VNS與海馬神經(jīng)元之間的調(diào)節(jié)機(jī)制還需進(jìn)一步研究。既往研究表明,MCP-1、LAP、P-gp等相關(guān)蛋白都與難治性癲癇的耐藥性有緊密聯(lián)系〔15,16〕。本研究結(jié)果提示,海馬區(qū)MCP-1、LAP、P-gp蛋白與耐藥基因有密切關(guān)系,可作為非藥物作用的治療靶點(diǎn),是VNS治療的新作用途徑。

HMGB1會(huì)作為損傷相關(guān)分子模式參與多種疾病的發(fā)病中,經(jīng)常參與機(jī)體耐藥及炎癥的修復(fù)過(guò)程中。HMGB1在多項(xiàng)動(dòng)物癲癇模型實(shí)驗(yàn)中都有較高的蛋白表達(dá),研究人員證實(shí)了HMGB1是通過(guò)介導(dǎo)炎癥來(lái)激活癲癇病灶組織,進(jìn)而促進(jìn)癲癇的發(fā)生、發(fā)展〔17～19〕。TLR4會(huì)參與機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng),相關(guān)研究已經(jīng)證實(shí),TLR4在腦中的表達(dá)范圍僅存在于突膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞中,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)中也有一定表達(dá),其在這些組織中的高表達(dá)會(huì)加速神經(jīng)元死亡〔20,21〕。本研究結(jié)果顯示,提示HMGB1/TLR4通路的活化是癲癇發(fā)生、發(fā)展的重要原因,且與癲癇的耐藥性有關(guān),據(jù)此可以推測(cè),VNS可能通過(guò)HMGB1/TLR4信號(hào)通路,逆轉(zhuǎn)了相關(guān)耐藥基因,比如MCP-1、LAP、P-gp過(guò)度表達(dá)而發(fā)揮調(diào)節(jié)作用,讓神經(jīng)功能趨于平衡狀態(tài),抑制癲癇發(fā)作。