不同Hp感染的老年慢性胃炎患者S100蛋白表達(dá)及意義

卜佳 孫曼鑾 呂科 溫娟娟

(1山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院,山西 大同 037009;2大同市第五人民醫(yī)院心內(nèi)科)

慢性胃炎是多種病因所致的胃黏膜炎性病變,淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)為其主要特征,隨著病情的發(fā)展會(huì)出現(xiàn)胃黏膜腺體萎縮、化生、癌變〔1〕。老年慢性胃炎患者由于身體功能的減退,上消化道出血等并發(fā)癥的發(fā)生率明顯增加,威脅患者的生命安全〔2〕;同時(shí)老年慢性胃炎患者中發(fā)展為慢性萎縮性胃炎和胃癌的比例較高〔3〕。因此,準(zhǔn)確評(píng)估老年慢性胃炎患者的病情發(fā)展對(duì)治療方案的合理制定具有重要意義。參與人體炎癥反應(yīng)的因子中S100蛋白家族成員S100A8、S100A9具有獨(dú)特的生物學(xué)作用,是目前研究的熱點(diǎn)之一〔4〕。研究報(bào)道顯示,S100A8、S100A9可能參與幽門(mén)螺旋桿菌(Hp)感染誘發(fā)的人胃黏膜上皮永生細(xì)胞增殖異常和致炎過(guò)程〔5〕。本研究探究不同Hp感染情況的老年慢性胃炎患者S100蛋白表達(dá)特點(diǎn)及臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年3月至2021年5月大同市第五人民醫(yī)醫(yī)院收治的老年慢性胃炎患者92例。入選標(biāo)準(zhǔn):①診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2017年全國(guó)慢性胃炎研討會(huì)中制定的中國(guó)慢性胃炎共識(shí)意見(jiàn),經(jīng)胃鏡下組織病理活檢確診為慢性胃炎;②接受碳13尿酸呼氣試驗(yàn),同時(shí)結(jié)合快速尿素酶試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行綜合判斷,二者均為陽(yáng)性則診斷為Hp感染。排除標(biāo)準(zhǔn):①近1個(gè)月有抗Hp類(lèi)藥物或非甾體抗炎藥使用史者;②有精神性疾病或認(rèn)知功能異常者。根據(jù)病理檢查結(jié)果分為慢性非萎縮性胃炎組39例,慢性萎縮性胃炎組53例。慢性非萎縮性胃炎組男21例,女18例;年齡60～78〔平均(68.24±5.08)〕歲。慢性萎縮性胃炎組男29例,女24例;年齡60～80〔平均(68.95±4.71)〕歲。兩組性別、年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò),患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2主要試劑 免疫組化SP法檢測(cè)試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑均購(gòu)于北京拜爾迪生物有限公司;二甲苯、磷酸鹽緩沖液、過(guò)氧化氫溶液均購(gòu)于北京博爾邁生物有限公司;放射免疫沉淀(RIPA)組織細(xì)胞裂解液購(gòu)于上海博湖生物科技有限公司;兔抗人S100A8單克隆抗體、兔抗人S100A9單克隆抗體、辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG均購(gòu)于北京康眾生物科技有限公司。

1.3標(biāo)本采集及蘇木素-伊紅(HE)染色 胃鏡下隨機(jī)采集胃竇部黏膜組織標(biāo)本兩塊,將其中一塊放于-80 ℃冰箱中凍存,另一塊放于4%甲醛溶液中固定,乙醇脫水后二甲苯透明,石蠟包埋。進(jìn)行4 μm連續(xù)切片,脫蠟至水,進(jìn)行HE染色3～5 min,蒸餾水沖洗,脫水、中性樹(shù)膠封片,光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.4免疫組化檢測(cè) 取石蠟切片,脫水后加入濃度為3% H2O2,室溫下孵育30 min,使用磷酸緩沖液反復(fù)洗滌3次,使用10%的山羊血清封閉抗體,棄去血清,加入兔抗人S100A8單克隆抗體(稀釋比例1∶300)、兔抗人S100A9單克隆抗體(稀釋比例1∶500),4 ℃冷藏過(guò)夜,磷酸緩沖液反復(fù)洗滌3次,加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG,稀釋比例1∶2 000,37 ℃靜置30 min,使用增強(qiáng)型DAB底物試劑盒顯色,洗滌后復(fù)染,封片,在光學(xué)顯微鏡下觀察。染色結(jié)果判定:S100A8、S100A9主要分布于細(xì)胞核,陽(yáng)性染色呈黃色、黃褐色。染色程度評(píng)分:0分(無(wú)染色),1分(淺黃色),2分(黃色),3分(黃褐色)。陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分:1分(≤10%),2分(11%～50%),3分(51%～75%),4分(>75%)。兩項(xiàng)評(píng)分的乘積≥3分為陽(yáng)性,<3分為陰性。

1.5RT-PCR檢測(cè)S100A8、S100A9 mRNA表達(dá) Trizol法提取組織標(biāo)本中的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,S100A8、S100A9、β-actin引物序列由上海權(quán)陽(yáng)生物有限公司設(shè)計(jì)、合成;S100A8上游引物:5′-GGCGACTCGTTATTGTTCAT-3′,下游:5′-GGGTATTACTTCGATAGTGC-3′。S100A9上游引物:5′-CGCGGGGCTACTGATTAGCGT-3′,下游:5′-TGTAAG-GCTTAGCAATCTCGA-3′。β-actin上游引物:5′-CAGTCCGTCGAGCATCG ATA-3′,下游:5′-GACATGCGGGTGTCACGACC-3′。PCR擴(kuò)增條件:94 ℃預(yù)變性5 min,活化TagDNA酶,94 ℃變性20 s,55 ℃反應(yīng)40 s,共40個(gè)循環(huán),72 ℃終末延伸3 min。檢測(cè)各基因相對(duì)表達(dá)量。

1.6Western印跡檢測(cè)S100A8、S100A9蛋白表達(dá) 收集組織標(biāo)本,使用高效RIPA組織細(xì)胞裂解液提取總蛋白,定量后取10 μg行電泳,將分離出的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜,室溫下封閉2 h。洗膜后加入1∶300倍稀釋的兔抗人S100A8單克隆抗體、1∶500倍稀釋的兔抗人S100A9單克隆抗體、1∶2 000倍稀釋的鼠抗β-actin單克隆抗體,4 ℃過(guò)夜,洗滌后加入1∶2 000稀釋辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG,室溫?fù)u床孵育2 h,化學(xué)發(fā)光法成像,使用ImageJ軟件分析圖片條帶的灰度值。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS25.0軟件進(jìn)行方差分析、t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1兩組S100A8、S100A9表達(dá)比較 慢性萎縮性胃炎組S100A8、S100A9表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于慢性非萎縮性胃炎組(P<0.01)。見(jiàn)表1。

2.2兩組S100A8、S100A9 mRNA和蛋白表達(dá)水平比較 慢性萎縮性胃炎組S100A8、S100A9 mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯高于慢性非萎縮性胃炎組(均P<0.01)。見(jiàn)表1。

2.3不同Hp感染情況患者S100A8、S100A9表達(dá)情況比較 92例老年慢性胃炎患者中Hp感染陽(yáng)性52例(陽(yáng)性組),陰性40例(陰性組)。Hp感染陽(yáng)性的老年慢性胃炎患者S100A8、S100A9表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于Hp感染陰性的患者(P<0.01)。見(jiàn)表2。

2.4不同Hp感染患者S100A8、S100A9 mRNA和蛋白表達(dá)水平比較 Hp感染陽(yáng)性的老年慢性胃炎患者S100A8、S100A9 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯高于Hp感染陰性患者(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表1 兩組S100A8、S100A9陽(yáng)性表達(dá)、mRNA及蛋白表達(dá)水平比較

表2 不同Hp感染患者S100A8、S100A9陽(yáng)性表達(dá)、mRNA及蛋白表達(dá)比較〔n(%)〕

2.5各組S100A8、S100A9表達(dá)情況比較 慢性萎縮性胃炎合并Hp陽(yáng)性組S100A8、S100A9表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于Hp陰性組,慢性非萎縮性胃炎合并Hp陽(yáng)性組S100A8、S100A9表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于Hp陰性組(P<0.05)。慢性萎縮性胃炎合并Hp陽(yáng)性組S100A8、S100A9表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于慢性非萎縮性胃炎合并Hp陽(yáng)性組及Hp陰性組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

2.6各組S100A8、S100A9 mRNA和蛋白表達(dá)水平比較 慢性萎縮性胃炎合并Hp陽(yáng)性組S100A8、S100A9 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯高于Hp陰性組,慢性非萎縮性胃炎合并Hp陽(yáng)性組S100A8、S100A9 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯高于Hp陰性組(P<0.05)。慢性萎縮性胃炎合并Hp陽(yáng)性組S100A8、S100A9 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯高于慢性非萎縮性胃炎合并Hp陽(yáng)性組及Hp陰性組(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組S100A8、S100A9陽(yáng)性表達(dá)、mRNA及蛋白表達(dá)水平比較

3 討 論

慢性胃炎是胃癌發(fā)生的重要環(huán)節(jié),進(jìn)展過(guò)程分為慢性非萎縮性胃炎、慢性萎縮性胃炎、腸化生、不典型增生〔6〕。關(guān)注慢性胃炎的發(fā)病機(jī)制對(duì)降低胃癌的發(fā)病率具有重要意義。相關(guān)研究顯示,Hp感染的胰島素胃泌素轉(zhuǎn)基因小鼠胃黏膜萎縮及不典型增生的發(fā)生時(shí)間明顯早于Hp感染陰性的小鼠〔7〕。國(guó)外流行病學(xué)研究報(bào)道顯示,Hp陽(yáng)性的患者慢性萎縮性胃炎的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)高出陰性患者5倍以上,提示Hp感染與慢性萎縮性胃炎的發(fā)生密切相關(guān)〔8〕。同時(shí)Hp感染作為慢性萎縮性胃炎的主要病因已得到廣泛認(rèn)可〔9〕,但具體致病機(jī)制仍未完全明確。S100A8、S100A9均屬于S100蛋白家族成員,存在形成主要為S100A8/S100A9異源二聚體〔10〕。研究發(fā)現(xiàn)S100A8、S100A9 參與炎癥發(fā)展過(guò)程,且能夠調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡等過(guò)程〔11〕。自身免疫性疾病、感染性炎癥及胰腺癌、結(jié)直腸癌等惡性腫瘤患者中S100A8、S100A9高表達(dá)〔12〕。

研究顯示,Hp感染會(huì)誘發(fā)人胃黏膜上皮永生細(xì)胞異常增殖,具體表現(xiàn)為低水平Hp活菌感染時(shí)人胃黏膜上皮永生細(xì)胞增殖活性提升,高水平Hp活菌感染時(shí)其增殖活性被抑制〔13〕。研究顯示,Hp感染的人胃黏膜上皮永生細(xì)胞S100A8、S100A9 mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯提升,且與人胃黏膜上皮永生細(xì)胞增殖紊亂、腫瘤壞死因子α濃度呈正相關(guān)〔14〕,提示S100A8、S100A9 可能參與了Hp誘導(dǎo)人胃黏膜上皮永生細(xì)胞炎癥反應(yīng)異常及增殖紊亂過(guò)程。本研究結(jié)果說(shuō)明S100A8、S100A9高表達(dá)可能參與慢性胃炎的發(fā)生與發(fā)展,且S100A8與S100A9表達(dá)變化趨勢(shì)相同,進(jìn)一步證實(shí)了S100A8/S100A9異源二聚體存在的結(jié)論;胃黏膜組織中S100A8、S100A9表達(dá)水平與Hp感染情況密切相關(guān)。研究顯示,細(xì)胞外S100A8、S100A9與免疫細(xì)胞表面的Toll樣受體4、RAGE等受體結(jié)合,發(fā)揮正反饋?zhàn)饔?生成級(jí)聯(lián)信號(hào),大量合成并分泌趨化因子、細(xì)胞因子、一氧化氮等,導(dǎo)致細(xì)胞外微環(huán)境改變,細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)變化或細(xì)胞中DNA發(fā)生損傷,周?chē)?xì)胞出現(xiàn)異常增殖和凋亡〔15〕。胃黏被Hp感染后可刺激黏膜組織中S100A8、S100A9的大量合成與分泌,進(jìn)而激活核因子κB信號(hào),與免疫細(xì)胞表面的Toll樣受體4、RAGE等結(jié)合后誘發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)信號(hào),改變局部微環(huán)境,影響胃黏膜上皮細(xì)胞增殖與分化,固有腺體減少造成慢性胃炎的發(fā)生與發(fā)展。