釓噴替酸葡甲胺對軟骨細(xì)胞凋亡及自噬的影響

焦華杰，宋 濤，于 芝，王琰娟，饒慧敏

隨著核磁共振(MR)技術(shù)的發(fā)展及其影像學(xué)診斷獨(dú)特的優(yōu)勢，目前MR在臨床的應(yīng)用越來越廣泛。釓噴替酸葡甲胺是常用的MR掃描對比劑，長期以來被認(rèn)為在推薦劑量下是安全的,然而越來越多的證據(jù)表明，釓并不能完全從體內(nèi)清除,一些釓劑持續(xù)存在于人體組織細(xì)胞中[1]。MR直接法關(guān)節(jié)造影在關(guān)節(jié)損傷診斷方面應(yīng)用廣泛[2]，但對比劑釓噴替酸葡甲胺局部注射對關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞是否會產(chǎn)生毒性影響，目前尚無文獻(xiàn)資料報(bào)道。本研究通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討不同劑量釓噴替酸葡甲胺對人軟骨細(xì)胞的毒性及對人軟骨細(xì)胞凋亡及自噬的影響。

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組:人軟骨細(xì)胞購自北納生物，細(xì)胞培養(yǎng)采用DMEM/F12培養(yǎng)基+10胎牛血清+1%雙抗(青霉素+鏈霉素)，細(xì)胞每48h換液一次，細(xì)胞融合達(dá)到80%進(jìn)行傳代培養(yǎng),bcl2兔抗人蛋白抗體(12789-1-AP)、bax兔抗人抗體(50599-2-Ig)、lc3兔抗人抗體(14600-1-AP)、p62兔抗人抗體(18420-1-AP)、gapdh兔抗人抗體(10494-1-AP)購自武漢三鷹公司，cleaved-caspase3兔抗人抗體(9661)購自CST公司。實(shí)驗(yàn)依據(jù)加入藥物濃度分為正常對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，各組細(xì)胞培養(yǎng)液中分別加入0 mmoL/L、0.5 mmoL/L、2 mmoL/L、10 mmoL/L釓噴替酸葡甲胺。

1.2 CCK8細(xì)胞增殖檢測:取對數(shù)生長期軟骨細(xì)胞，接種到96孔板中，每孔104個(gè)細(xì)胞，分別加入對應(yīng)濃度藥物24 h 后，CCK8檢測各組細(xì)胞增殖率，每組重復(fù)3次。

1.3 細(xì)胞凋亡率檢測:取對數(shù)生長期軟骨細(xì)胞，分別加入對應(yīng)濃度的釓噴替酸葡甲胺24h后，0.25%胰酶消化收集細(xì)胞，PBS離心洗滌3次(800 g，5 min，下同)，75%乙醇固定30 min，PBS離心洗滌3次，加入500 μL凋亡檢測工作液。避光孵育30 min后流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率，每組重復(fù)3次。

1.4 Western blot檢測:各組細(xì)胞，0.25%胰酶消化后，PBS離心洗滌3次，加入500 μL預(yù)配置好的細(xì)胞裂解液，冰上裂解5 min，震蕩10 s，反復(fù)操作5次，12 000 g離心15 min，收集上清，BCA法檢測蛋白濃度，加熱煮沸5 min，配制SDS凝膠，每組加入30 μg蛋白，110 V恒壓電泳，300 mA恒流轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗工作液37 ℃孵育1 h(bcl2兔抗人抗體，1∶2 000；bax兔抗人抗體，1∶5 000；cleaved-caspase3兔抗人抗體,1∶1 000；lc3兔抗人抗體,1∶3 000；p62兔抗人抗體,1∶4 000；gapdh兔抗人抗體,1∶20 000)，TBST洗膜3次，加入二抗( HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗,1∶10 000)工作液37 ℃孵育1 h，TBST洗滌3次，ECL發(fā)光檢測，采用ImageJ軟件進(jìn)行蛋白表達(dá)相對定量。

2 結(jié)果

2.1 CCK8細(xì)胞增殖檢測:各組細(xì)胞增殖檢測比較(F=7.350,P<0.05)，組間兩兩比較低劑量組(1.01±0.04)與正常對照組細(xì)胞(0.99±0.06)增殖率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.507,P>0.05)，中劑量組(0.97±0.05)與正常對照組細(xì)胞(0.99±0.06)增殖率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.144，P>0.05)，高劑量組(0.86±0.015)，與正常對照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.784，P<0.05)。

2.2 各組細(xì)胞凋亡率檢測:正常對照組細(xì)胞凋亡率為(1.17±0.15)%，低劑量組為(1.27±0.16)%，中劑量組為(1.20±0.20)%，高劑量組為(5.01±0.25)%，四組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=297.44,P<0.05)。各組細(xì)胞凋亡率檢測比較，低劑量組、中劑量組細(xì)胞凋亡率與正常對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，高劑量組與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 各組細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)相對定量比較:Western blot檢測各組細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)，低劑量組、中劑量組與正常對照組比較，bcl2、bax、cleaved-caspase3蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，高劑量組與正常對照組比較，bcl2蛋白表達(dá)下調(diào)，bax、cleaved-caspase3蛋白表達(dá)上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)相對定量比較

2.4 各組細(xì)胞自噬蛋白表達(dá)比較:Western blot檢測各組細(xì)胞自噬蛋白表達(dá)，低劑量組、中劑量組與正常對照組比較，lc3Ⅱ蛋白表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，p62蛋白表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高劑量組與正常對照組比較，lc3Ⅱ蛋白表達(dá)下調(diào)，lc3 、p62蛋白表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表2。

表2 各組細(xì)胞自噬蛋白相對表達(dá)定量比較

3 討論

近年來MR關(guān)節(jié)造影在臨床應(yīng)用越來越多，相關(guān)研究表明MR 關(guān)節(jié)造影對半月板撕裂的敏感性和特異性有明顯提高，檢查結(jié)果更接近關(guān)節(jié)鏡[3]。MR關(guān)節(jié)造影分為直接法和間接法，直接法是先向關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射MR對比劑，然后通過MR掃描觀察關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)及病變。直接法膝關(guān)節(jié)MR造影可以通過擴(kuò)大分離關(guān)節(jié)囊,能夠更加清晰顯示關(guān)節(jié)內(nèi)部結(jié)構(gòu)及病變，同時(shí)對于某些膝關(guān)節(jié)病變,如評價(jià)術(shù)后半月板是否再次損傷、膝關(guān)節(jié)游離體、評價(jià)關(guān)節(jié)軟骨退變、剝脫等方面,MR膝關(guān)節(jié)直接造影具有很高的診斷價(jià)值[4]。

釓噴替酸葡甲胺是常用的MR掃描對比劑，隨著研究的不斷深入，近年來關(guān)于釓增強(qiáng)劑應(yīng)用的安全性越來越受到關(guān)注[5]，MR增強(qiáng)掃描后的組織細(xì)胞釓沉積對機(jī)體具有一定危害[6-7]，同時(shí)有相關(guān)資料顯示釓可在細(xì)胞中長期存在[8-9]。有研究表明[10]，小鼠孕期接受釓增強(qiáng)劑可同過胎盤沉積于幼鼠大腦組織，并對幼鼠腦發(fā)育產(chǎn)生影響。Beyazal Celiker F等研究表明臨床反復(fù)使用釓對比劑可使大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡增加，血清Ca2+水平升高，睪酮水平降低[11]。

骨組成細(xì)胞包括軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞的細(xì)胞死亡，在骨骼的發(fā)育、維持和修復(fù)以及骨關(guān)節(jié)炎和骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。軟骨細(xì)胞的增殖、分化和凋亡是軟骨內(nèi)成骨的重要步驟,軟骨細(xì)胞通過產(chǎn)生各種酶、細(xì)胞因子和基質(zhì)相關(guān)蛋白來維持細(xì)胞外基質(zhì)在降解和修復(fù)之間的功能平衡[12]，而廣泛的軟骨細(xì)胞死亡或功能障礙可導(dǎo)致關(guān)節(jié)損傷的進(jìn)一步發(fā)展[13]。為此，在關(guān)節(jié)損傷診斷治療過程中應(yīng)盡力保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞數(shù)量功能完整。

目前國內(nèi)外常用釓噴替酸葡甲胺關(guān)節(jié)造影濃度為0.5 mmoL/L及2 mmoL/L[14]，也有文獻(xiàn)資料表明可應(yīng)用到45 mmoL/L[15]。本次研究中通過比較不同濃度釓噴替酸葡甲胺對人軟骨細(xì)胞增殖、凋亡影響發(fā)現(xiàn)，0.5 mmoL/L、2 mmoL/L釓噴替酸葡甲胺對軟骨細(xì)胞增殖及凋亡無影響，但可促進(jìn)細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白lc3Ⅱ表達(dá)，提高細(xì)胞自噬能力。10 mmoL/L釓噴替酸葡甲胺能夠抑制人軟骨細(xì)胞增殖及自噬，通過上調(diào)促凋亡蛋白bax、cleaved-caspase3蛋白表達(dá)，抑制抗凋亡蛋白bcl2表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本次研究表明低濃度釓噴替酸葡甲胺能夠促進(jìn)人軟骨細(xì)胞自噬，而高濃度釓噴替酸葡甲胺能夠抑制人軟骨細(xì)胞增殖及自噬，促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡。雖然本次研究對釓噴替酸葡甲胺誘導(dǎo)人軟骨細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚未闡明，但本次研究結(jié)果為臨床改善釓噴替酸葡甲胺進(jìn)行MR關(guān)節(jié)造影提供了理論依據(jù)，臨床醫(yī)師在進(jìn)行MR關(guān)節(jié)造影檢查時(shí)應(yīng)嚴(yán)格把控釓噴替酸葡甲胺對比劑濃度，避免高濃度對比劑帶來的二次損傷。