血清lncNEAT1和sTREM-2在SAE老年患者中的表達(dá)及臨床意義*

王桂瑜,歐陽葵,蘇小田,龍淑媛

海南省老年病醫(yī)院:1.老年科;2.神經(jīng)內(nèi)科,海南海口 571100

膿毒癥相關(guān)性腦病(SAE)是由膿毒癥引起的,沒有中樞神經(jīng)系統(tǒng)直接感染的急性彌漫性腦功能障礙[1]。老年人群由于機(jī)體抗感染免疫力降低,因此SAE發(fā)生率較高,預(yù)后較差[2]。SAE是一種神經(jīng)系統(tǒng)無菌性炎癥反應(yīng),傳統(tǒng)反映炎癥程度的指標(biāo)[如白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、降鈣素原(PCT)]及反映膿毒癥患者病情程度的指標(biāo)[如急性生理學(xué)與慢性健康狀況評(píng)分系統(tǒng)Ⅱ (APACHEⅡ)、序貫器官衰竭評(píng)分(SOFA)]均有助于評(píng)估SAE老年患者病情及病情程度。但臨床中上述指標(biāo)在SAE的診斷及預(yù)后評(píng)估中尚缺乏特異性,因此有必要尋找新的SAE血清標(biāo)志物。長鏈非編碼RNA核富含豐富的轉(zhuǎn)錄本1(lncNEAT1)參與形成核旁斑亞結(jié)構(gòu),與炎癥、免疫、腫瘤及心血管疾病關(guān)系密切[3- 4]。近年來有研究發(fā)現(xiàn),在脂多糖刺激小膠質(zhì)細(xì)胞后,活化的小膠質(zhì)細(xì)胞lncNEAT1表達(dá)上調(diào),其通過加重機(jī)體炎癥反應(yīng)及調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝過程,參與SAE的發(fā)生發(fā)展[5]。可溶性髓樣細(xì)胞觸發(fā)受體-2(sTREM-2) 是一種細(xì)胞膜表面蛋白分泌型形式,能與TYRO蛋白酪氨酸激酶結(jié)合蛋白形成受體信號(hào)復(fù)合物。sTREM-2可通過誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素-1β等的產(chǎn)生,加重機(jī)體的炎癥反應(yīng),與膿毒癥、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染等疾病關(guān)系密切[6- 7]。本研究通過檢測SAE老年患者血清lncNEAT1及sTREM-2的表達(dá)與SAE老年患者的臨床預(yù)后的關(guān)系,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年1月至2021年1月于本院診治的224例膿毒癥老年患者為研究對(duì)象,根據(jù)是否合并SAE分為SAE組(84例)和對(duì)照組(未并發(fā)腦損傷140例)。SAE組根據(jù)28 d內(nèi)的生存情況分為存活組(44例)和死亡組(40例)。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)通過。

納入標(biāo)準(zhǔn):(1)年齡>60歲;(2)膿毒癥診斷符合2016年美國重癥醫(yī)學(xué)會(huì)發(fā)布的膿毒癥3.0診斷標(biāo)準(zhǔn)[8];(3)SAE診斷排除中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)疾病、藥物及電解質(zhì)紊亂等因素的影響,患者表現(xiàn)為譫妄、定向力障礙及意識(shí)障礙等精神狀態(tài)急性改變;(4)患者及家屬對(duì)本研究知情并簽字。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)存在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、腦血管意外或顱內(nèi)器質(zhì)性病變等;(2)存在肝性腦病、肺性腦病及糖尿病酮癥酸中毒等;(3)精神障礙性疾病;(4)合并惡性腫瘤。

1.2方法 采用靜脈采血法抽取所有研究對(duì)象入院后清晨空腹肘靜脈血5 mL至不含抗凝劑的采血管中,37 ℃靜置1 h后凝固分層,3 000 r/min離心10 min分離血清,分裝后保存于-80 ℃冰箱待測。采用熒光定量PCR(qPCR)檢測血清lncNEAT1的表達(dá)。Trizol法提取血清總RNA,微量分光光度計(jì)測定血清總RNA純度。將血清總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以cDNA為模板進(jìn)行qPCR反應(yīng)。反應(yīng)體系共10 μL:cDNA 0.2 μL,2×SYBR Green Premix 5 μL,上游和下游引物各1 μL,去離子水3.8 μL。反應(yīng)程序:95 ℃ 預(yù)變性5 min,95 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,70 ℃延伸30 s,共40個(gè)循環(huán)。引物:lncNEAT1的正向序列為5′-CTC AGA CCA CAA CTC TCC ACC TTG-3′,反向序列為5′-CAG ATG CTG CCT GGC TGA TGG-3′;GAPDH正向序列為5′-GTG AAG GTC GGA GTC AAC-3′,反向序列為5′-GTT GAG GTC AAT GAA GGG-3′。2-ΔΔCt法對(duì)lncNEAT1的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析,ΔCt=CtlncNEAT1-CtGAPDH,ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組-ΔCt對(duì)照組。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測血清sTREM-2水平。人sTREM-2 ELISA試劑盒購自上海瑞番生物科技公司。人神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)ELISA試劑盒購自上海滬震生物公司。實(shí)驗(yàn)步驟按照嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。Microlab FAME全自動(dòng)酶標(biāo)儀購自瑞士哈美頓公司。

收集所有研究對(duì)象的年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)、受教育年限、高血壓史、糖尿病史、感染部位等一般臨床資料。收集入院后48 h以內(nèi)的實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢查資料,NSE采用ELISA檢測,中樞神經(jīng)特異性蛋白(S100β)采用免疫層析法檢測,PCT采用羅氏Combas e601電化學(xué)發(fā)光全自動(dòng)免疫分析儀器及配套試劑檢測。收集并統(tǒng)計(jì)患者入院48 h內(nèi)APACHEⅡ評(píng)分、SOFA評(píng)分和28 d內(nèi)患者生存情況。

2 結(jié) 果

2.1SAE組和對(duì)照組血清lncNEAT1、sTREM2表達(dá)比較 SAE組血清PCT、NSE、S100β、APACHEⅡ評(píng)分、SOFA評(píng)分、lncNEAT1、sTREM2表達(dá)明顯高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.001)。SAE組和對(duì)照組患者在性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)、受教育年限、高血壓史、糖尿病史及感染部位方面比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表1。

表1 SAE組和對(duì)照組血清lncNEAT1、sTREM2表達(dá)比較(n/n或或n/n/n)

2.2不同預(yù)后SAE老年患者臨床指標(biāo)比較 與生存組相比,死亡組SAE老年患者PCT、S100β、NSE、APACHEⅡ評(píng)分、SOFA評(píng)分、lncNEAT1及sTREM2表達(dá)明顯較高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。兩組在性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)、受教育年限、高血壓史、糖尿病史、感染部位及WBC方面比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表2。

表2 影響SAE老年患者28 d生存預(yù)后的因素(n/n或或n/n/n)

2.3血清lncNEAT1、sTREM2表達(dá)與SAE老年患者臨床參數(shù)的相關(guān)性 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示,SAE老年患者血清lncNEAT1表達(dá)與PCT、S100β、NSE、APACHEⅡ評(píng)分、SOFA評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.451、0.503、0.514、0.609、0.674,均P<0.001);SAE老年患者血清sTREM2表達(dá)與PCT、S100β、NSE、APACHEⅡ評(píng)分、SOFA評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.451、0.503、0.514、0.709、0.617,均P<0.001)。

2.4多因素Logistic回歸分析影響SAE老年患者生存預(yù)后的因素 以SAE老年患者是否發(fā)生死亡為因變量(賦值:1=死亡,0=生存),以lncNEAT1、sTREM-2為自變量,以PCT、NSE、S100β、APACHEⅡ評(píng)分、SOFA評(píng)分為協(xié)變量,進(jìn)行多因素Logistic回歸分析。結(jié)果顯示,同時(shí)校正PCT、NSE、S100β、APACHEⅡ評(píng)分、SOFA評(píng)分后,血清lncNEAT1、sTREM-2表達(dá)升高是影響SAE老年患者不良生存預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。見表3。

表3 影響SAE老年患者生存預(yù)后的多因素Logistic回歸分析

2.5血清lncNEAT1、sTREM2及聯(lián)合檢查對(duì)SAE老年患者生存預(yù)后的評(píng)估價(jià)值 當(dāng)ROC曲線中約登指數(shù)最大時(shí),血清lncNEAT1、sTREM2的最佳截?cái)嘀捣謩e為6.52、34.71 pg/mL。血清lncNEAT1、sTREM2聯(lián)合檢查對(duì)SAE老年患者生存預(yù)后評(píng)估的曲線下面積(AUC)為0.874,顯著高于血清lncNEAT1、sTREM2單一指標(biāo)檢測,AUC為0.797、0.820,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=4.864、3.872,P<0.001、P=0.003)。見表4。

表4 血清lncNEAT1、sTREM2及聯(lián)合檢測對(duì)SAE老年患者生存預(yù)后的評(píng)估價(jià)值

3 討 論

SAE是膿毒癥嚴(yán)重并發(fā)癥之一,是由膿毒癥全身炎癥反應(yīng)引起的急性彌漫性腦功能障礙,表現(xiàn)為輕度譫妄到昏迷等。有研究報(bào)道,合并SAE的膿毒癥患者病死率顯著升高,并且SAE病情嚴(yán)重程度與患者病死率呈正相關(guān)[9]。本研究中,膿毒癥患者SAE發(fā)病率為37.5%(84/220),28 d病死率為47.62%(40/84),均與既往報(bào)道的SAE發(fā)病率和病死率的結(jié)果相近[1]。因此,早期診斷和治療SAE,對(duì)于降低患者病死率至關(guān)重要。SAE的臨床診斷為排除性診斷,目前尚無明確的診斷標(biāo)準(zhǔn)及實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)。血清PCT等炎癥指標(biāo)是評(píng)估膿毒癥嚴(yán)重程度的指標(biāo),但臨床中PCT難以有效評(píng)估SAE老年患者的預(yù)后情況。SAE的發(fā)病涉及多種機(jī)制。SAE患者腦微循環(huán)改變和血腦屏障破壞導(dǎo)致大量炎癥因子及內(nèi)毒素入腦,引起腦部無菌性炎癥,導(dǎo)致SAE的發(fā)生。此外,大量假性神經(jīng)遞質(zhì)形成及線粒體功能障礙等因素也會(huì)導(dǎo)致SAE的發(fā)生。近年來報(bào)道較多的是中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的生物標(biāo)志物如NSE及S100β等,有助于SAE的早期診斷,但這些指標(biāo)的靈敏度及特異度不高,臨床應(yīng)用價(jià)值有限[10]。深入研究SAE的發(fā)病機(jī)制,尋找能夠評(píng)估SAE預(yù)后的血清標(biāo)志物,對(duì)于早期臨床干預(yù),降低SAE病死率具有重要意義。

lncRNA是長度為200～300個(gè)核苷酸RNA調(diào)控分子,廣泛參與個(gè)體生長發(fā)育、炎癥、感染及免疫等病理生理學(xué)過程[11]。lncNEAT1是近年來發(fā)現(xiàn)的新的lncRNA,表達(dá)于人類心肌細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞中,參與人類炎癥、組織損傷和多器官功能衰竭等疾病的發(fā)生發(fā)展[3-4]。近年來有研究報(bào)道,血清lncNEAT1表達(dá)升高能夠增加膿毒癥患者急性呼吸窘迫綜合征發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn),與患者疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[12]。本研究中,SAE組患者血清lncNEAT1表達(dá)明顯升高,分析其原因可能是,膿毒癥時(shí)細(xì)菌脂多糖能夠刺激機(jī)體單核細(xì)胞,導(dǎo)致lncNEAT1表達(dá)升高,lncNEAT1 能夠作為分子海綿,結(jié)合并抑制微小RNA-124的表達(dá),導(dǎo)致其下游分子靶點(diǎn)如腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素-1β等表達(dá)升高,加重機(jī)體的炎癥反應(yīng)程度[13]。本研究中,SAE老年患者血清lncNEAT1表達(dá)與血清PCT、S100β、NSE、APACHEⅡ評(píng)分、SOFA評(píng)分呈正相關(guān),提示血清lncNEAT1表達(dá)與SA患者疾病嚴(yán)重程度有關(guān)。其原因一方面是lncNEAT1能夠通過上調(diào)白細(xì)胞介素-6,白細(xì)胞介素-17等炎癥因子的表達(dá),加重機(jī)體炎癥反應(yīng)程度,導(dǎo)致大量炎癥因子通過受損的血腦屏障,引起大腦功能障礙,導(dǎo)致SAE的發(fā)生[13];另一方面是lncNEAT1能夠通過直接誘導(dǎo)中樞神經(jīng)細(xì)胞的損傷,促進(jìn)SAE的疾病進(jìn)展。有學(xué)者發(fā)現(xiàn),膿毒癥小鼠腦組織中l(wèi)ncNEAT1表達(dá)升高通過促進(jìn)核因子κB的表達(dá),促進(jìn)膿毒癥小鼠神經(jīng)細(xì)胞的凋亡,加重腦組織損傷,而敲低lncNEAT1表達(dá)可明顯減輕膿毒癥小鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡[14]。本研究中,血清lncNEAT1表達(dá)與SAE老年患者28 d生存預(yù)后有關(guān),是影響SAE老年患者生存預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,表明檢測SAE老年患者血清lncNEAT1表達(dá)有助于評(píng)估臨床預(yù)后,可能是新的SAE老年患者生存預(yù)后的血清標(biāo)志物。其機(jī)制可能與lncNEAT1參與加重膿毒癥炎癥反應(yīng)有關(guān)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn),在脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中l(wèi)ncNEAT1表達(dá)升高,其能夠與POU結(jié)構(gòu)域2類轉(zhuǎn)錄因子1 mRNA 的3′UTR區(qū)結(jié)合,促進(jìn)脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞的炎癥反應(yīng),加重膿毒癥的疾病進(jìn)展[15]。尚有學(xué)者發(fā)現(xiàn),膿毒癥感染小鼠的神經(jīng)細(xì)胞中l(wèi)ncNEAT1表達(dá)增加,其能夠與血紅蛋白亞單位β相互作用并抑制其降解,進(jìn)而抑制突觸后密度蛋白95水平,降低神經(jīng)元樹突棘密度,導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物膿毒癥后的焦慮樣行為和認(rèn)知障礙[16]。

sTREM-2主要表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞中,參與調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬功能,與人類阿爾茨海默病、額顳葉癡呆和艾滋病相關(guān)神經(jīng)認(rèn)知障礙等疾病密切相關(guān)[17]。近年來有研究發(fā)現(xiàn),外周血sTREM2的表達(dá)升高能夠加重神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者認(rèn)知功能障礙,可作為神經(jīng)系統(tǒng)疾病預(yù)后評(píng)估的血清標(biāo)志物[18]。本研究中,SAE老年患者血清sTREM-2表達(dá)明顯升高,其表達(dá)升高的機(jī)制與SAE老年患者小膠質(zhì)細(xì)胞過度激活有關(guān)。有研究表明,SAE老年患者神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)能夠激活小膠質(zhì)細(xì)胞,導(dǎo)致SAE老年患者血清和腦脊液中sTREM-2和神經(jīng)絲輕鏈蛋白水平顯著升高,sTREM2表達(dá)升高可通過促進(jìn)神經(jīng)突觸中淀粉樣蛋白沉積,加速神經(jīng)突觸傳導(dǎo)功能喪失,促進(jìn)患者認(rèn)知功能障礙,導(dǎo)致SAE的發(fā)生[7]。本研究中,SAE老年患者血清sTREM-2的表達(dá)與血清PCT、S100β、NSE、APACHEⅡ評(píng)分、SOFA評(píng)分呈正相關(guān),提示血清sTREM-2表達(dá)升高促進(jìn)SAE疾病進(jìn)展。其原因可能是sTREM的表達(dá)升高加重膿毒癥患者神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)。有研究報(bào)道,sTREM2的表達(dá)上調(diào)能夠磷酸化激活磷脂酰肌醇3激酶/Akt信號(hào)通路,促進(jìn)腫瘤壞死因子α和白細(xì)胞介素-6的表達(dá),加重神經(jīng)炎癥并促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡,導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)損傷[19]。此外,sTREM-2是小膠質(zhì)細(xì)胞過度激活的重要標(biāo)志物,小膠質(zhì)細(xì)胞的過度活化能夠分泌產(chǎn)生大量促炎細(xì)胞因子,如白細(xì)胞介素-6等,加重神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)及腦組織損傷。本研究中,SAE老年患者血清sTREM2表達(dá)與28 d生存預(yù)后有關(guān),是影響患者生存預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,提示檢測血清sTREM2水平有助于評(píng)估SAE老年患者的臨床預(yù)后,這與sTREM-2對(duì)機(jī)體抗感染免疫抑制作用有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn),革蘭陰性病原體感染的動(dòng)物模型中,sTREM-2的表達(dá)升高能夠抑制機(jī)體骨髓源性巨噬細(xì)胞對(duì)病原體的吞噬和殺傷作用,從而加重機(jī)體的炎癥反應(yīng),加重器官損傷和增加實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的病死率[20]。

本研究中,APACHEⅡ評(píng)分及SOFA評(píng)分不能作為影響SAE不良預(yù)后的獨(dú)立因素,其原因可能是APACHEⅡ評(píng)分和SOFA評(píng)分所涉及的評(píng)分項(xiàng)目涵蓋患者的健康狀況、年齡等因素,導(dǎo)致研究過程中的混雜因素較多,難以準(zhǔn)確評(píng)估SAE老年患者的臨床預(yù)后。本研究利用ROC曲線分析發(fā)現(xiàn),血清lncNEAT1、sTREM2、NSE、S100β聯(lián)合檢測對(duì)SAE老年患者生存預(yù)后具有較高的評(píng)估價(jià)值,臨床醫(yī)生可根據(jù)血清lncNEAT1、sTREM2水平對(duì)SAE老年患者的臨床預(yù)后進(jìn)行評(píng)估,對(duì)于高?；颊哂枰栽缙谠\治及預(yù)防,提高患者的生存率。

綜上所述,SAE老年患者血清lncNEAT1,sTREM2表達(dá)升高,兩者表達(dá)與SAE疾病嚴(yán)重程度有關(guān),共同參與SAE疾病的發(fā)生發(fā)展。血清lncNEAT1、sTREM2表達(dá)升高是影響SAE老年患者28 d生存預(yù)后的獨(dú)立因素。但本研究也存在一定的不足,由于本研究樣本量有限,可能存在一定的研究偏倚,有待今后前瞻性、多中心、大樣本的臨床研究進(jìn)一步證實(shí)本研究的結(jié)論。